II. Bố cục của luận văn
2.4. Xử lý số liệu thực nghiệm
- Độ lặp lại được dùng để đánh giá độ phân tán của các kết quả. Đại lượng này đặc trưng cho độ gần về giá trị trung bình của hai hay nhiều phép đo nhận được trong những điều kiện giống nhau.
- Đánh giá độ lặp dựa trên độ lệch chuẩn tương đối (RSD%).
- Các công thức tính toán trong xử lý thông kê kết quả thực nghiệm: + Giá trị trung bình: n i i=1 bt X X = n
+ Độ lệch chuẩn:
n n 2 2 i i i=1 i=1 tt x -x x -x S = = n-1 k
Trong đó:n là số lần phân tích lặp lại của mẫu i k là số bậc tự do (k= n-1)
xi là giá trị phân tích lần thứ i
x là giá trị phân tích trung bình của i lần + Độ lệch tương đối:
t td t
S = S ×100 X
+ Với chuẩn Student:
tt
x-μ
t =
S
Trong đó: t là chuẩn Student giá trị thực của đại lượng cần đo + Độ chính xác :
t×S
ε =
n
Ta suy ra khoảng tin cậy của giá trị phân tích
CHƯƠNG III
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 3.1. Khảo sát tìm điều kiện tối ưu của phương pháp phân tích
Để đánh giá sự phù hợp và ổn định của hệ thống thiết bị phân tích, chúng ta cần khảo sát lại các yếu tố ảnh hưởng quan trọng có thể dẫn đến sai số của phép phân tích.
- Dung dịch chuẩn gốc: Cân chính xác 50 mg (0,1 mg) chất chuẩn dexamethason acetat vào bình định mức dung tích 100,0 ml, thêm khoảng 70 ml methanol, lắc đến tan hoàn toàn và thêm methanol vừa đủ đến vạch, lắc đều, được dung dịch chuẩn gốc hydrocortison acetat có nồng độ khoảng 0,5 mg/ml.
- Dung dịch chuẩn làm việc: Pha các dung dịch chuẩn làm việc dexamethason acetat
Dung dịch chuẩn 1: Có nồng độ 0,5 ppm bằng cách lấy 0,1 ml Dung dịch chuẩn 2: Có nồng độ 1,0 ppm bằng cách lấy 0,2 ml Dung dịch chuẩn 3: Có nồng độ 2,0 ppm bằng cách lấy 0,4 ml Dung dịch chuẩn 4: Có nồng độ 3,0 ppm bằng cách lấy 0,6 ml Dung dịch chuẩn 5: Có nồng độ 5,0 ppm bằng cách lấy 1,0 ml Dung dịch chuẩn 6: Có nồng độ 6,0 ppm bằng cách lấy 1,2 ml Dung dịch chuẩn 7: Có nồng độ 6,5 ppm bằng cách lấy 1,3 ml Dung dịch chuẩn gốc vào mỗi bình định mức dung tích 50,0 ml tương ứng, thêm methanol vừa đủ đến vạch, lắc đều. Lọc các dung dịch qua màng lọc 0,45 μm để tiêm sắc ký. Có ghi các ký hiệu của mỗi mẫu chuẩn.
3.1.1. Khảo sát vạch phổ hấp thụ
Pha dung dịch chuẩn làm việc dexamethason acetat có nồng độ 2,0 ppm. Tiến hành vận hành thiết bị ở các điều kiện theo các tài liệu đã tham khảo [6, 15, 17, 22]:
- Cột sắc ký: Cột C18 (250 x 4,6 mm, 5 μm I.D.). - Tốc độ dòng: 1,2 ml/phút.
- Thể tích tiêm mẫu: 20 μl.
- Detecter: Thay đổi các bước sóng xung quanh giá trị 240 nm.
Khảo sát tìm bước sóng tối ưu xác định hàm lượng của dexamethason acetat. Kết quả thu được trình bày trong bảng 3.1.
Bảng 3.1. Kết quả khảo sát vạch đo phổ của dexamethason acetat
(nm) 237 238 239 240 241 242
Spic - 2,0 ppm 50189 50209 50252 50485 50247 50212
RSD% 0.2194 0.2193 0.2191 0.2181 0.2191 0.2193
Nhận xét:
Như vậy qua kết quả khảo sát, chúng tôi chọn vạch hấp thụ 240 nm. Đây là vạch phổ đảm bảo cho độ hấp thụ cao, độ lặp tốt, phù hợp với phép phân tích. Kết quả này cũng phù hợp với một số tài liệu đã công bố [6],[22]. Các nghiên cứu tiếp theo chúng tôi chọn λ = 240 nm.
3.1.2. Khảo sát tỉ lệ pha động
Pha dung dịch chuẩn làm việc dexamethason acetat có nồng độ 2,0 ppm. Tiến hành vận hành thiết bị ở các điều kiện theo các tài liệu đã tham khảo:
- Thành phần pha động: Thay đổi tỉ lệ pha động acetonitril - nước xung quanh giá trị (35: 65).
- Cột sắc ký: Cột C18 (250 x 4,6 mm, 5μm I.D.). - Tốc độ dòng: 1,2 l/phút.
- Thể tích tiêm mẫu: 20 μl. - Detecter: 240 nm.
Khảo sát tìm tỷ lệ pha động tối ưu để xác định hàm lượng của dexamethason acetat. Kết quả thu được trình bày trong bảng 3.2.
Bảng 3.2. Kết quả khảo sát tỉ lệ pha động của dexamethason acetat
ACN: H2O 32:68 33:67 34:66 35:65 36:64 37:63
Spíc - 2,0 μg/ml 50123 50434 50492 50474 50231 50206
RSD% 0.3164 0.3145 0.3141 0.3142 0.3157 0.3159
Nhận xét:
Như vậy qua kết quả khảo sát, chúng tôi chọn tỉ lệ pha động ACN: H2O (34:66). Đây là tỉ lệ pha động đảm bảo cho độ hấp thụ cao, độ lặp tốt, phù hợp với phép phân tích. Kết quả này cũng phù hợp với một số tài liệu đã công bố. Các nghiên cứu tiếp theo chúng tôi sử dụng tỷ lệ pha động này [6, 10, 17, 22].
3.1.3. Khảo sát tốc độ dòng
Pha dung dịch chuẩn làm việc dexamethason acetat có nồng độ 2,0 μg/ml. Tiến hành vận hành thiết bị ở các điều kiện theo các tài liệu đã tham khảo:
- Thành phần pha động: Tỉ lệ pha động acetonit - nước (34 : 66). - Cột sắc ký: Cột C18 (250 x 4,6 mm, 5 μm I.D.).
- Tốc độ dòng: Thay đổi tốc độ xung quang 1,2 ml/phút. - Thể tích tiêm mẫu: 20 μl.
- Detecter: 240 nm.
Qua kết quả khảo sát cũng như dựa vào các tài liệu tham khảo yêu cầu xác định hàm lượng của dexamethason acetat ta thấy tốc độ dòng tại giá trị 1,2 ml/phút có độ hấp thụ lớn nhất được nêu trong bảng 3.3
Bảng 3.3. Kết quả khảo sát tốc độ dòng
V(ml/phút) 1,0 1,1 1,2 1,3 1,4 1,5
Spíc - 2,0 ppm 50347 50452 50512 50491 50281 50263
Nhận xét:
Như vậy qua kết quả khảo sát, chúng tôi chọn tốc độ dòng tại giá trị 1,2 ml/phút. Đây là tỉ lệ pha động đảm bảo cho độ hấp thụ cao, độ lặp tốt, phù hợp với phép phân tích. Kết quả này cũng phù hợp với một số tài liệu đã công bố [22]. Các nghiên cứu tiếp theo chúng tôi chọn tốc độ dòng tại giá trị 1,2 ml/phút.
3.1.4. Khảo sát xác định khoảng nồng độ tuyến tính
Chúng tôi tiến hành pha dãy dung dịch có nồng độ xác định tiến hành đo phổ hấp thụ của các dung dịch trên ở điều kiện tối ưu đã được khảo sát.
Kết quả đo phổ được trình bày trong bảng 3.4
Bảng 3.4. Khảo sát khoảng nồng độ tuyến tính
TT Nồng độ dung dịch chuẩn (ppm) Spíc 1 0,1 13768 2 0,3 16876 3 0,5 18981 4 1,0 32356 5 2,0 60513 6 3,0 99813 7 5,0 154136 8 6,0 187125 9 6,5 201324 10 6,7 203131 11 7,0 207122
Từ số liệu ở bảng 3.4 ta sử dụng chương trình Microsoft Excel 2003 vẽ được đồ thị hình 3.4. 0 50000 100000 150000 200000 250000 0 1 2 3 4 5 6 7 8 ppm Spic
Hình 3.1. Đồ thị khảo sát khoảng nồng độ tuyến tính của dexamethason axetat
Nhận xét:
Qua đồ thị hình 3.1 ta thấy khoảng tuyến tính thể hiện mối quan hệ diện tích pic nồng độ của dexamethason axetat là 0,5 ppm đến 6,5 ppm.
3.2. Xây dựng đường chuẩn, xác định giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) của dexamethason acetat hạn định lượng (LOQ) của dexamethason acetat
Pha các dung dịch chuẩn làm việc dexamethason acetat có nồng độ 0,5 ppm, 1,0 ppm; 2,0 ppm; 3,0 ppm; 5,0 ppm; 6,0 ppm; 6,5 ppm. Tiến hành vận hành thiết bị ở các điều kiện đã khảo sát và theo các tài liệu đã tham khảo:
- Thành phần pha động: Tỉ lệ pha động acetonit - nước (34: 66). - Cột sắc ký: Cột C18 (250 x 4,6 mm, 5μm I.D.).
- Tốc độ dòng: Thay đổi 1,2 ml/phút. - Thể tích tiêm mẫu: 20 μl.
- Detecter: 240 nm
Từ kết quả thu được ở trên để chúng tôi dùng phần mềm origin 7.5 để xây dựng phương trình hồi quy đầy đủ cho đường chuẩn của dexamethason
acetat, đồng thời xác định giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng. Kết quả thu được trình bày trong bảng 3.5.
Bảng 3.5. Số liệu xây dựng đường chuẩn
TT Nồng độ dung dịch
chuẩn (ppm) Tổng Spíc Số liệu thống kê
1 0.5 18981 y = 30623x + 2757.8 r = 0.9993 2 1.0 32356 3 2.0 60513 4 3.0 99813 5 5.0 154136 6 6.0 187125 7 6.5 201324
Từ số liệu ở bảng 3.5 ta sử dụng chương trình Microsoft Excel vẽ được đồ thị mối quan hệ tuyến tính giữa diện tích pic và nồng độ chất chuẩn được thể hiện trên hình 3.2. y = 30623x + 2757.8 R2 = 0.9987 0 50000 100000 150000 200000 250000 0 1 2 3 4 5 6 7 ppm Spic
Phương trình đường chuẩn Data_B: Y= A*X + B R: Độ lệch chuẩn tương đối
SD: Độ lệch chuẩn tuyệt đối N: Số lần thực nghiệm (N =7) P: Độ sai số cho phép
Thông số Giá trị Sai số
A B 30623 2757.8 503 2062 R SD N P 0,99933 2987 7 <0.0001
Tra bảng phân phối Student ta được giá trị t (P = 0,95; f = N-1 = 6) = 2,45 Theo kết quả tính toán của phần mềm origin 7.5 ta có:
∆A = t(0,95;6)*SA = 2,45*503 = 1232.4 ∆B = t(0,95;6)*SB = 2,45*2062 = 5051.9
Vậy phương trình hồi quy đầy đủ của đường chuẩn có dạng: Ai = (30623± 1232.4)* X +( 2757.8 ± 5051.9) Trong đó:
Ai là diện tích píc của phân tích
X là nồng độ của dexamethoxason acetat (ppm)
3.2.1. Giới hạn phát hiện (LOD)
LOD được xem là nồng độ của chất phân tích mà hệ thống phân tích còn cho tín hiệu phân tích khác có nghĩa với tín hiệu của mẫu trắng hay tín hiệu nền.
Giới hạn phát hiện dexamethoxason acetat bằng phép đo HPLC theo đường chuẩn:
y
3×S 3×2987
LOD = = = 0.29 ppm A 30623
Giá trị (LOD) này cho thấy có thể dùng phương pháp để phát hiện lượng vết dexamethoxason acetat trong đối tượng phân tích.
3.2.2 Giới hạn định lượng (LOQ)
LOQ được xem là nồng độ của chất phân tích mà hệ thống phân tích còn cho tín hiệu phân tích khác có ý nghĩa định lượng với mẫu trắng hay tín hiệu nền và đạt độ tin cậy ≥ 95%.
Giới hạn định lượng dexamethoxason acetat bằng phép đo HPLC theo đường chuẩn:
y
10×S 10×2987
LOQ = = = 0.97 ppm
A 30623
Giá trị (LOQ) này cho thấy có thể dùng phương pháp để định lượng dexamethoxason acetat đối tượng phân tích.
3.3. Đánh giá sai số và độ lặp lại của phép đo
Để đánh giá sai số và độ lặp lại của phương pháp từ đó xác định khoảng tin cậy của giá trị phân tích, chúng tôi chọn khảo sát ở tại ba giá trị nồng độ nằm ở đầu, giữa và cuối khoảng tuyến tính của đường chuẩn ở mỗi loại nồng độ tiến hành đo lặp lại 5 lần.
Các kết quả thực nghiệm được xử lý thống kê và trình bày trong bảng 3.6.
Bảng 3.6. Kết quả đánh giá sai số và độ lặp lại của phép đo Nồng độ chuẩn bị (ppm) 0,500 3,000 6,500 Nồng độ xác định được (ppm) 0,504 3.052 6,500 0,505 3.023 6,498 0,502 3.013 6,504 0,501 3.056 6,502 0,502 3.045 6,505 Giá trị nồng độ trung bình: x 0,503 3.036 6,502 Độ lệch chuẩn: SD 1,54.10-4 1.6.10-2 1.9.10-4
Độ lệch chuẩn tương đối: RSD% 0,0307 0,557 0,044 Chuẩn student: t 1,7 2.1 0.6
Nhận xét:
Từ kết quả ở trong bảng 3.6 ta thấy rằng: Các giá trị thu được có độ lặp tương đối tốt.
So sánh t với t(,k) = 2,45 (k=6; α= 0,95) cho thấy t < t,k do đó phương pháp không mắc sai số hệ thống.
Khoảng tin cậy của giá trị phân tích của các phép đo hoàn toàn có thể đánh giá thông qua các giá trị x và tương ứng.
3.4. Tổng kết các điều kiện áp dụng phân tích dexamethason acetat trong mẫu phân tích mẫu phân tích
Từ các kết quả nghiên cứu trên, chúng tôi tổng hợp các điều kiện phù hợp để đo dexamethason acetat bằng phương pháp HPLC thể hiện trong bảng 3.7.
Bảng 3.7. Các điều kiện đo dexamethason acetat phương pháp HPLC
Chất phân tích các yếu tố Dexamethason acetat
Điều kiện sắc
ký
Tỉ lệ pha động Acetonitril : Nước (34 : 66)
Cột sắc ký Cột C18 (250 × 4,6 nm, 5 µm I.D)
Dedecter 240 nm
Thể tích tiêm mẫu 20 µl
Tốc độ dòng 1,2 ml/phút
Giới hạn phát hiện LOD (ppm) 0,29
Giới hạn định lượng LOQ (ppm) 0,97
Khoảng nồng độ tuyến tính (ppm) 0,5 - 6,5
3.5. Áp dụng kết quả nghiên cứu để phân tích một số mẫu mỹ phẩm 3.5.1. Xác định hàm lượng dexamethason acetat một số mẫu mỹ phẩm
Chúng tôi tiến hành phân tích các mẫu mỹ phẩm để xác định mẫu chứa chất cấm dexamethason acetat theo quy trình đã xây dựng và dựa vào đường chuẩn để xác định hàm lượng dexamethason acetat có trong mỹ phẩm.
Cân chính xác 1,000 g mẫu vào cốc thủy tinh 100 ml, thêm 5 ml ethanol tuyệt đối, lắc siêu âm 30 phút ở nhiệt độ 700C làm lạnh ở trong môi trường nước đá (t< 50C), ly tâm 5 phút. Lọc, chiết. Tiến hành đun cách thủy đến khi thu được cắn. Hoàn tan cắn với 10 ml methanol, chuyển vào bình định mức 25 ml, tráng cốc thêm 2 lần, mỗi lần 5 ml methanol, thêm methanol vừa đủ. Lọc qua màng lọc G4 [22].
Lượng cân các mẫu mỹ phẩm được nêu trong bảng 3.8.
Bảng 3.8. Lượng cân các mẫu mỹ phẩm
TT Ký hiệu mẫu Lượng mẫu (g) Thể tích pha loãng (ml)
1 KR05 1,0012 25
2 SR01 1,0017 25
3 ST04 1,0019 25
4 KD02 1,0011 25
5 KD03 1,0016 25
Tiến hành phân tích mẫu mỹ phẩm theo phương pháp đã nghiên cứu trên ở điều kiện tối ưu của thiết bị đo. Dựa vào phương trình đường chuẩn đã thiết lập xác định được nồng độ dexamethason acetat có trong lượng mẫu phân tích.
Xác định hàm lượng dexamethason acetat có trong mẫu mỹ phẩm theo công thức: mp tpm t t
C .v
C =
m
Trong đó:
- Cmp (ppm): Hàm lượng dexamethason acetat có trong mẫu mỹ phẩm
- Ctmp (ppm): Hàm lượng dexamethason acetat có trong lượng mẫu mỹ phẩm
đem phân tích.
- vt (ml): Thể tích pha loãng của mẫu - mt(g): Lượng mẫu mỹ phẩm phân tích
Kết quả phân tích được trình bày trong bảng 3.9.
Bảng 3.9. Kết quả đo của mẫu phân tích
TT Ký hiệu mẫu Tổng diện tích píc Hàm lượng dexamethason acetat
có trong mẫu phân tích (Cxdmp -ppm) Hàm lượng dexamethason acetat có trong mẫu mỹ phẩm (Cmp-ppm) 1 KR05 KPH KPH 2 SR01 KPH KPH 3 ST04 KPH KPH 4 KD02 21263 0,604 15,083 5 KD03 KPH KPH Nhận xét:
Kết quả thu ở bảng 3.9 được cho thấy, trong 05 mẫu mỹ phẩm được nghiên cứu thì chỉ có 01 mẫu mỹ phẩm (KD02) phát hiện chất cấm dexamethason acetate với hàm lượng 15.083 ppm.
3.5.2. Xác định độ lặp lại hàm lượng dexamethason acetat có trong mẫu mỹ phẩm
Dựa vào kết quả khảo sát sơ bộ, chúng tôi xác định hàm lượng dexamethason acetate có trong mẫu mỹ phẩm bằng cách tiến hành phân
tích 5 lần lặp lại trên mẫu KD2. Theo quy trình khảo sát và dựa vào phương trình đường chuẩn đã xây dựng chúng tôi thu được kết quả trình bày trong bảng 3.10.
Bảng 3.10. Kết quả phân tích dexamethason acetate có trong mẫu KD2
TT Lượng cân Tổng diện tích píc Hàm lượng examethason acetat trong mẫu
phân tích (Cxdmp -ppm) Hàm lượng Dexamethason acetat có trong mẫu mỹ phẩm (Cmp-ppm) 1 1,0013 21233 0.6033 15.06 2 1,0016 21247 0.6038 15.07 3 1,0011 21296 0.6054 15.12 4 1,0003 21265 0.6044 15.10 5 1,0009 21213 0.6027 15.05 Xtb 15.08 SD 0.028 RSD% 0.185 Nhận xét:
Kết quả thu ở bảng 3.10 chúng tôi thấy giá trị độ lệch chuẩn tương đối
RSD < 5% là chấp nhận được. Chúng tôi xác định được trong mỹ phẩm (mẫu
kí hiệu KD02) chứa chất cấm dexamethason acetate với hàm lượng 15,08
ppm.
3.6. Các sắc đồ của phép đo HPLC 3.6.1. Sắc đồ mẫu trắng 3.6.1. Sắc đồ mẫu trắng
Hình 3.3. Sắc đồ mẫu trắng
3.6.2. Các sắc đồ mẫu chuẩn dexamethason acetat có nồng độ khác nhau
Hình 3.5. Sắc đồ mẫu chuẩn dexamethason acetat có nồng độ 1,0 ppm
Hình 3.7. Sắc đồ mẫu chuẩn dexamethason acetat có nồng độ 3,0 ppm
Hình 3.9. Sắc đồ mẫu chuẩn dexamethason acetat có nồng độ 6,0 ppm
