Hệ số dung lượng K’

II. Bố cục của luận văn

1.5.2. Hệ số dung lượng K’

Hệ số dung lượng của một chất cho biết khả năng phân bố của chất đó trong hai pha cộng với sức chứa của cột, tức là tỷ lệ giữa lượng chất tan trong pha tĩnh và lượng chất tan trong pha động ở thời điểm cân bằng.

Thường được tính theo công thức sau: t -t

tR R o tR

k' = = = -1

t t t

o o o

Hệ số dung lượng k’ phụ thuộc vào bản chất của chất phân tích, đặc tính của pha tĩnh và pha động.

Nếu k’ nhỏ hơn, tR cũng nhỏ và sự tách kém. K’ lớn thì pic bị loãng, độ nhạy kém. Trong thực tế k’ từ 1 đến 5 là tối ưu. Hai chất chỉ được tách ra khỏi nhau nếu chúng có giá trị khác nhau. Trong phân tích thường chọn cột, pha động và các điều kiện phân tích sao cho: 1< k’ <8.

1.5.3. Độ chọn lọc (α) và độ phân giải (Rs)

Để hoàn toàn phân tích hai cấu tử thì pic của chúng phải không được chồng lên nhau.

Tiêu chuẩn để đánh giá chất lượng phân tích là độ chọn lọc và độ phân giải. Độ chọn lọc α là tiêu chuẩn để đánh giá độ tách với hai đỉnh píc và được định nghĩa. ' 2 R2 o ' 1 R1 o K t - t α = = K t - t

Hai pic tách với nhau khi α > 1. Tuy nhiên, nếu chân pic mà chồng lên nhau thì cũng không thể phân tách hoàn toàn hai cấu tử. Nghĩa là độ chọn lọc không đủ đánh giá chất lượng phân tích. Do đó chất lượng phân tích được đánh giá dựa trên độ phân giải Rs (Resolution) là đại lượng được xét từ toàn bộ píc.

Độ phân giải (Rs) được tính như sau:

 R2 R1  R2 R1

2 1 1/2,2 1/2,1

2 t - t 2 t - t

R s = =

Trong đó:

W là độ rộng của chân pic W1/2 là độ rộng bán pic

Khi Rs = 1 thì 2 pic có độ lớn tương đương sẽ có 5% diện tích bị xen phủ. Để tách hoàn toàn hai cấu tử thì Rs ≥ 1,5.

Nếu R nhỏ thì các pic chưa tách hẳn, việc tính toán diện tích pic sẽ không chính xác.

Nếu R lớn quá thì thời gian phân tích sẽ lâu, tốn nhiều pha động, độ nhạy sẽ kém. Để khắc phục ta có thể thay đổi hệ pha động hay dùng chương trình gradient dung môi. Tuy nhiên trong quá trình chạy sắc ký dùng chương trình dung môi thì một số pha động có tỷ lệ thay đổi sẽ kéo theo sự thay đổi đường nền làm ảnh hưởng rất lớn đến thời gian lưu và diện tích của các pic ta phân tích

Trong thực tế nên hạn chế sử dụng chương trình gradient dung môi mà chủ yếu là chúng ta phải tìm được hệ pha động rửa giải phù hợp, đáp ứng các yêu cầu trong quá trình phân tích.

1.5.4. Số đĩa lý thuyết N

Số đĩa lý thuyết là đại lượng biểu thị hiệu năng của cột trong một điều kiện sắc ký nhất định. Mỗi đĩa lý thuyết trong cột sắc ký giống như một lớp pha tĩnh có chiều cao là H. Tất nhiên lớp này có tính chất động, tức là một khu vực của hệ phân tích mà trong đó một cân bằng nhiệt động được thiết lập giữa nồng độ trung bình của chất tan trong pha tĩnh và pha động. Vì vậy, với một điều kiện sắc ký xác định thì chiều cao H cũng hằng định đối với một chất phân tích và số đĩa lý thuyết của cột cũng xác định.

Số đĩa lý thuyết N được tính theo công thức:

2 2 2 R R R 1/2 t t t N = = 5,54. =16. δ W W                   Trong đó:

tR thời gian lưu của chất phân tích W1/2 là độ rộng tại điểm 1/2 của pic

1.5.5. Hệ số bất đối xứng T

Hệ số đối xứng T cho biết mức độ không đối xứng của pic trên sắc đồ thu được. T được tính bằng tỷ số độ rộng của hai nửa pic tại điểm 1/10 hoặc 1/20 chiều cao của pic.

T =

a b

Pic dạng đối xứng hình Gaus trên thực tế khó đạt được, vì vậy phải quan tâm đến hệ số không đối xứng T.

Khi T  2,5 thì phép định lượng được chấp nhận.

Nếu T > 2,5 thì điểm cuối của pic rất khó xác định. Vì vậy cần thay đổi các điều kiện sắc ký để làm cho pic cân đối xứng hơn theo cách sau:

+ Làm giảm thể tích chiết, tức là đoạn nối từ cột đến detecter. + Thay đổi thành phần pha động sao cho khả năng rửa giải tăng lên.

+ Giảm bớt lượng mẫu đưa vào cột bằng cách pha loãng mẫu phân tích hoặc giảm thể tích.

1.6. Hệ thống thiết bị HPLC

Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao gồm có các bộ phận cơ bản như sau:

Trong đó:

1: Bình chứa pha động 2: Bộ phận khử khí 3: Bơm cao áp 4: Bộ phận tiêm mẫu 5: Cột sắc ký (pha tĩnh) 6: Đầu dò

7: Hệ thống máy tính có phần mềm ghi nhận tín hiệu, xử lý dữ liệu và điều khiển hệ thống. 8: In dữ liệu. [10, 15, 16, 17].

1.6.1. Bình đựng dung môi

Hiện tại máy HPLC thường có 4 đường dung môi vào đầu bơm cao áp. Cho phép chúng ta sử dụng 04 bình chứa dung môi cùng 1 lần để rửa giải theo tỷ lệ mong muốn và tổng tỷ lệ dung môi của 04 đường là 100%.

Tuy nhiên theo kinh nghiệm thì chúng ta ít khi sử dụng 4 đường dung môi cùng một lúc mà chúng ta chỉ sử dụng tối đa là 3 và 2 đường để cho hệ pha động luôn được pha trộn đồng nhất hơn, hệ pha động đơn giản hơn để quá trình rửa giải ổn định. Hiện 4 đường dung môi phục vụ chủ yếu cho việc rửa giải gradial dung môi theo thời gian và công tác xây dựng tiêu chuẩn.

Lưu ý:

- Tất cả các dung môi dùng cho HPLC đều phải là dung môi tinh khiết và có ghi rõ trên nhãn là dùng cho HPLC hay dung môi tinh khiết phân tích.

- Tất cả các hóa chất dùng để pha mẫu và pha hệ đệm phải được sử dụng là hóa chất tinh khiết phân tích.

- Nhằm mục đích tránh hỏng cột sắc ký hay nhiễu đường nền, tạo ra các píc tạp trong quá trình phân tích.

1.6.2. Bộ khử khí degasse

Mục đích của bộ khử khí nhằm loại trừ các bọt nhỏ còn sót lại trong dung môi pha động. Nếu như trong quá trình phân tích mà dung môi pha động còn sót các bọt khí thì một số hiện tượng sau đây sẽ xảy ra:

- Tỷ lệ pha động của các đường dung môi lấy không đúng sẽ làm cho thời gian lưu của píc thay đổi.

- Trong trường hợp bọt quá nhiều bộ khử khí không thể loại trừ hết được thì có thể sẽ không hút được dung môi, khi đó áp suất không lên và máy sắc ký sẽ ngừng hoạt động.

Trong bất cứ trường hợp nào nêu trên cũng cho kết quả phân tích sai

1.6.3. Bơm (pump)

Mục đích để bơm pha động vào cột thực hiện quá trình chia tách sắc ký. Pump phải tạo được áp suất cao khoảng 3000-6000 PSI hoặc 250 at đến - 500 at (1 at = 0.98 bar) và pump phải tạo dòng liên tục. Lưu lượng bơm từ 0.1 đến 9.999 ml/phút (hiện nay đã có nhiều loại pump có áp suất rất cao lên đến 1200 bar).

Máy sắc ký lỏng của chúng ta hiện nay thường có áp suất tối đa 412 bar. Tốc độ dòng: 0.1-9.999 ml/phút. Tốc độ bơm là hằng định theo thông số đã được cài đặt. Hiện tại bơm có 2 piston để thay phiên nhau đẩy dung môi liên tục.

1.6.4. Bộ phận tiêm mẫu (injection)

Dùng để đưa mẫu vào cột phân tích. Có 2 cách lấy mẫu vào trong cột: Bằng tiêm mẫu thủ công (tiêm bằng tay) và tiêm mẫu tự động (autosample).

1.6.5. Cột sắc ký

Có rất nhiều nhãn hiệu cột khác nhau hiện bán trên thị trường. Chúng được chia làm nhiều loại theo mục đích sử dụng, trong đó chủ yếu là: cột pha đảo RP C18 (ODS), cột pha thường C8, các loại cột chuyên dụng cho từng nhóm chất. Cột C18 và C8 được sử dụng cho phần lớn các hợp chất thông thường.

Cột chứa pha tĩnh được coi là trái tim của hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao.

Cột pha tĩnh thông thường làm bằng thép không rỉ, chiều dài cột khoảng 10-30 cm, đường kính trong 1-10 mm.

Thông thường chất nhồi cột là silicagel (pha thuận) hoặc là silicagel đã được silan hóa hoặc được bao một lớp mỏng hữu cơ (pha đảo), ngoài ra người ta còn dùng các loại hạt khác như: nhôm oxit, polyme xốp, chất trao đổi ion.

Đối với một số phương pháp phân tích đòi hỏi phải có nhiệt độ cao hoặc thấp hơn nhiệt độ phòng thì cột được đặt trong bộ phận điều nhiệt (oven column).

1.6.6. Đầu dò (detector)

Là bộ phận phát hiện các chất khi chúng ra khỏi cột và cho các tín hiệu ghi trên sắc ký đồ để có thể định tính và định lượng. Tùy theo tính chất của các chất cần phân tích mà người ta sử dụng loại detector thích hợp và phải thoả mãn điều kiện trong một vùng nồng độ nhất định của chất phân tích.

A = k.C Trong đó:

A: Là tín hiệu đo được C: Nồng độ chất phân tích

K: Là hằng số thực nghiệm của detector đã chọn

Tín hiệu này có thể là: độ hấp thụ quang, cường độ phát xạ, cường độ điện thế, độ dẫn điện, độ dẫn nhiệt, chiết suất,…

Trên cơ sở đó người ta chế tạo các loại detector sau:

- Detector quang phổ tử ngoại 200 - 380 nm để phát hiện UV.

- Detector quang phổ tử ngoại khả kiến (UV - VIS): 190 - 900 nm để phát hiện các chất hấp thụ quang và đây là loại thông dụng nhất.

- Detector huỳnh quang dễ phát hiện các chất hữu cơ phát huỳnh quang tự nhiên cũng như các chất có huỳnh quang và là loại detector có độ chọn lọc cao nhất.

Loại hiện đại hơn có detector diod array, ELSD (detector tán xạ bay hơi) các detector này có khả năng quét chồng phổ để định tính các chất theo độ hấp thu cực đại của các chất. Ngoài ra còn có một số loại detector khác là:

- Detector điện hóa: đo dòng, cực phổ, độ dẫn, điện lượng,…

- Detector chiết suất vi sai: detector khúc xạ (thông thường dùng cho đo các chất đường).

1.6.7. Bộ phận ghi tín hiệu

Dùng để ghi tín hiệu phát hiện do detector truyền sang. Trong các máy thế hệ cũ thì sử dụng máy ghi đơn giản có thể vẽ sắc ký đồ, thời gian lưu, diện tích của pic, chiều cao,…

Các máy thế hệ mới đều dùng phần mềm chạy trên máy tính nó có thể lưu tất cả các thông số của pic như tính đối xứng, hệ số phân giải... trong quá trình phân tích đồng thời xử lý, tính toán các thông số theo yêu cầu của người sử dụng như: nồng độ, RSD,...

1.6.8. In kết quả

Sau khi đã phân tích xong các mẫu ta sẽ in kết quả do phần mềm tính toán ra giấy để hoàn thiện.

1.7. Các phương pháp định lượng

Có 4 phương pháp định lượng [18]:

1.7.1. Phương pháp đường chuẩn

Chuẩn bị một dãy dung dịch chuẩn, xây dựng đồ thị chuẩn sự phụ thuộc giữa nồng độ chất chuẩn và diện tích pic thu được, sau đó xử lý thống kê.

Phương trình hồi qui của đường chuẩn theo diện tích pic có dạng: y = ax + b

Trong đó: x: nồng độ y: diện tích pic a, b: hằng số

Đo diện tích pic của chất nghiên cứu trong mẫu (trong cùng điều kiện thực nghiệm) như đường chuẩn, thay y vào phương trình trên ta tìm được CM(X).

1.7.2. Phương pháp một mẫu chuẩn

Nếu gọi hX, hch là chiều cao pic ta xác định CM(X) theo phương trình sau:

X X ch ch h C = C . h

1.7.3. Phương pháp thêm

Do y = K.C X X

Ta thêm vào dung dịch nghiên cứu một lượng dung dịch chuẩn Cch ta được: X+ch X ch y = K(C + C ) Vậy ta có: X ch X X+ch X y C = C . ( y - y )

1.7.4. Phương pháp thêm chuẩn

Thêm vào V ml dung dịch nghiên cứu lần lượt C1, C2,….,Cn dung dịch chuẩn. Sau đó đo các diện tích peak thu được.

Ta có: , ( 1), ( 2),..., ( )

n X X C X C X C

y y  y  y 

Xây dựng đồ thị y=f(CTC), xác định CX theo đồ thị đó

Hình 1.15. Đồ thị kỹ thuật đường chuẩn thêm chuẩn

1.8. Đánh giá phương pháp phân tích

1.8.1. Khảo sát giới hạn phát hiện (LOD) và (LOQ) của phương pháp

Giới hạn phát hiện (LOD) được định nghĩa là nồng độ nhỏ nhất của chất phân tích mà có tín hiệu sắc ký lớn gấn 3 lần tín hiệu đường nền. LOD

Đường y = f(CT) yx y Cx Cx CTC

xác định theo quy tắc 3 (xicma) đây là thông số đặc trưng cho độ nhạy của phương pháp.

LOD = tin hiệu chiều cao pic/ nhiễu đường nền 3.

Giới hạn định lượng (LOQ) (limit of quantitation) là nồng độ nhỏ nhất đo được của phương pháp, đó là nồng độ tối thiểu của một chất trong một nền mẫu xác định mà thiết bị có thể đo đúng được với một RSD% quy định, thường LOQ là nồng độ chất phân tích mà cho tín hiệu gấn 10 lần tín hiệu đường nền [17, 22].

1.8.2. Đánh giá sai số và độ lặp lại của phép đo

Độ lặp lại được dùng để đánh giá định lượng độ phân tán của các kết quả phân tích. Đại lượng nay đặc trưng cho độ gần về giá trị trung bình của hai hay nhiều phép đo nhận được trong những điều kiện giống nhau.

Đánh giá độ lặp lại dựa trên độ lệch chuẩn tương đối (RSD) hoặc độ biến động.

CHƯƠNG II

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU VÀ THỰC NGHIỆM 2.1. Thiết bị, dụng cụ và hóa chất

2.1.1. Thiết bị

- Cân phân tích có độ chính xác 0,1 mg. - Cân kỹ thuật độ chính xác 0,001g - Bể siêu âm

- Máy ly tâm (vortex)

- Thiết bị lọc: Màng lọc 13 mm, 0,45 µm (PTFE)

- Hệ thống máy HPLC Agilent 1100 kết nối với đầu dò UV có thể điều chỉnh bước sóng 290 nm

- Cột sắc ký pha đảo RP18 (150 x 4,6 mm; 5 μm) và cột bảo vệ - Phần mềm xử lý số liệu Empower®2

- Máy lọc hút chân không

2.1.2. Dụng cụ

- Dụng cụ thủy tinh các loại

- Bình định mức loại 10 ml, 25 ml, 50 ml, 100 ml. - Pipet: 25 ml, 10 ml,…

- Phễu thủy tinh

- Bình tam giác 50 ml, 25 ml,… - Đũa thủy tinh

- Xy lanh

2.1.3. Hóa chất

- Chất chuẩn dexamethason acetate

Nguồn gốc: Viện kiểm nghiệm thuốc Trung ương Số kiểm soát: 1036/VKN Ngày sản xuất: 11/02/2013 Hạn sử dụng: 11/02/2016 - Nước cất 2 lần khử ion - Methanol - Acetonitrile (Merck)

(Loại dùng cho HPLC, tinh khiết p.a)

- Các hóa chất, dung môi khác: ethanol, methanol,... đạt tiêu chuẩn phân tích.

2.2. Phương pháp lấy mẫu, bảo quản mẫu và xử lý mẫu 2.2.1. Lấy mẫu

Qua thăm dò thực tiễn và xuất phát từ mục đích xác định hàm lượng dexamethoxason acetat trong một số loại mỹ phẩm đang có mặt trên thị trường tỉnh Nghệ An. Chúng tôi tiến hành lấy mẫu chủ yếu ở các địa điểm kinh doanh mỹ phẩm trên địa bàn Thành phố Vinh.

Mẫu mỹ phẩm sau khi lấy được đựng trong túi nilon sạch và đưa về phòng thí nghiệm tiến hành phân loại và mã hóa mẫu.

2.2.2. Các sơ đồ xử lý mẫu

A. Sơ đồ xử lý chất chuẩn

B. Sơ đồ xử lý các mẫu mỹ phẩm

Chuẩn bị chất chuẩn dexamethason acetat, hàm lượng 99,36%

Cân chính xác 50 mg chất chuẩn dexamethason acetat vào bình định

mức 100 ml

Dung dịch chuẩn 0,5 mg/ml

Dãy dung dịch chuẩn 0,5; 1,0; 2,0; 3,0; 5,0; 6,0; 6,5 µg/ml

Mẫu chuẩn HPLC

Thêm 70 ml dung môi methanol HPLC lắc siêu âm, thêm dung

môi methanol HPLC vừa đủ

Lấy 0,1; 0,2; 0,4; 0,6; 1,0; 1,2; 1,3 ml cho BĐM 50 ml thêm dung môi methanol HPLC vừa

đủ.

B. Sơ đồ xử lý mẫu mỹ phẩm Chuẩn bị mẫu mỹ phẩm (mẫu thử) Cân chính xác 1,0 g mỹ phẩm