II. Bố cục của luận văn
1.8. Đánh giá phương pháp phân tích
1.8.1. Khảo sát giới hạn phát hiện (LOD) và (LOQ) của phương pháp
Giới hạn phát hiện (LOD) được định nghĩa là nồng độ nhỏ nhất của chất phân tích mà có tín hiệu sắc ký lớn gấn 3 lần tín hiệu đường nền. LOD
Đường y = f(CT) yx y Cx Cx CTC
xác định theo quy tắc 3 (xicma) đây là thông số đặc trưng cho độ nhạy của phương pháp.
LOD = tin hiệu chiều cao pic/ nhiễu đường nền 3.
Giới hạn định lượng (LOQ) (limit of quantitation) là nồng độ nhỏ nhất đo được của phương pháp, đó là nồng độ tối thiểu của một chất trong một nền mẫu xác định mà thiết bị có thể đo đúng được với một RSD% quy định, thường LOQ là nồng độ chất phân tích mà cho tín hiệu gấn 10 lần tín hiệu đường nền [17, 22].
1.8.2. Đánh giá sai số và độ lặp lại của phép đo
Độ lặp lại được dùng để đánh giá định lượng độ phân tán của các kết quả phân tích. Đại lượng nay đặc trưng cho độ gần về giá trị trung bình của hai hay nhiều phép đo nhận được trong những điều kiện giống nhau.
Đánh giá độ lặp lại dựa trên độ lệch chuẩn tương đối (RSD) hoặc độ biến động.
CHƯƠNG II
PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU VÀ THỰC NGHIỆM 2.1. Thiết bị, dụng cụ và hóa chất
2.1.1. Thiết bị
- Cân phân tích có độ chính xác 0,1 mg. - Cân kỹ thuật độ chính xác 0,001g - Bể siêu âm
- Máy ly tâm (vortex)
- Thiết bị lọc: Màng lọc 13 mm, 0,45 µm (PTFE)
- Hệ thống máy HPLC Agilent 1100 kết nối với đầu dò UV có thể điều chỉnh bước sóng 290 nm
- Cột sắc ký pha đảo RP18 (150 x 4,6 mm; 5 μm) và cột bảo vệ - Phần mềm xử lý số liệu Empower®2
- Máy lọc hút chân không
2.1.2. Dụng cụ
- Dụng cụ thủy tinh các loại
- Bình định mức loại 10 ml, 25 ml, 50 ml, 100 ml. - Pipet: 25 ml, 10 ml,…
- Phễu thủy tinh
- Bình tam giác 50 ml, 25 ml,… - Đũa thủy tinh
- Xy lanh
2.1.3. Hóa chất
- Chất chuẩn dexamethason acetate
Nguồn gốc: Viện kiểm nghiệm thuốc Trung ương Số kiểm soát: 1036/VKN Ngày sản xuất: 11/02/2013 Hạn sử dụng: 11/02/2016 - Nước cất 2 lần khử ion - Methanol - Acetonitrile (Merck)
(Loại dùng cho HPLC, tinh khiết p.a)
- Các hóa chất, dung môi khác: ethanol, methanol,... đạt tiêu chuẩn phân tích.
2.2. Phương pháp lấy mẫu, bảo quản mẫu và xử lý mẫu 2.2.1. Lấy mẫu
Qua thăm dò thực tiễn và xuất phát từ mục đích xác định hàm lượng dexamethoxason acetat trong một số loại mỹ phẩm đang có mặt trên thị trường tỉnh Nghệ An. Chúng tôi tiến hành lấy mẫu chủ yếu ở các địa điểm kinh doanh mỹ phẩm trên địa bàn Thành phố Vinh.
Mẫu mỹ phẩm sau khi lấy được đựng trong túi nilon sạch và đưa về phòng thí nghiệm tiến hành phân loại và mã hóa mẫu.
2.2.2. Các sơ đồ xử lý mẫu
A. Sơ đồ xử lý chất chuẩn
B. Sơ đồ xử lý các mẫu mỹ phẩm
Chuẩn bị chất chuẩn dexamethason acetat, hàm lượng 99,36%
Cân chính xác 50 mg chất chuẩn dexamethason acetat vào bình định
mức 100 ml
Dung dịch chuẩn 0,5 mg/ml
Dãy dung dịch chuẩn 0,5; 1,0; 2,0; 3,0; 5,0; 6,0; 6,5 µg/ml
Mẫu chuẩn HPLC
Thêm 70 ml dung môi methanol HPLC lắc siêu âm, thêm dung
môi methanol HPLC vừa đủ
Lấy 0,1; 0,2; 0,4; 0,6; 1,0; 1,2; 1,3 ml cho BĐM 50 ml thêm dung môi methanol HPLC vừa
đủ.
B. Sơ đồ xử lý mẫu mỹ phẩm Chuẩn bị mẫu mỹ phẩm (mẫu thử) Cân chính xác 1,0 g mỹ phẩm vào cốc thủy 100 ml Dung dịch thử Lọc qua màng lọc 0,45 µm Mẫu thử HPLC
Thêm 15 ml ethanol tuyệt đối, lắc siêu âm 30 phút ở nhiệt độ 700C, cho vào ống nghiệm ly tâm, làm lạnh ở trong môi trường nước đá (t< 50C), ly tâm 10 phút. Lọc, chiết. Tiến hành đun cách thủy đến khi thu được cắn. Hoàn tan cắn với 5 ml methanol, chuyển vào bình định mức 25 ml, tráng cốc thêm 2 lần, mỗi lần 5 ml methanol, thêm methanol vừa đủ
2.3. Phương pháp phân tích
Để phân tích định lượng dexamethason acetat trong mẫu thử dùng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC.
2.3.1. Khảo sát các điều kiện tối ưu
+ Bước sóng đầu dò UV + Pha động
+ Thể tích tiêm mẫu + Tốc độ dòng
2.3.2. Xây dựng đường chuẩn
Để xác định được hàm lượng của dexamethason acetat trong mẫu người ta dựa vào mối quan hệ giữa nồng độ và diện tích pic trên đường chuẩn đã được thiết lập sẵn. Dựa vào đường chuẩn và diện tích pic đo được ta sẽ tính được hàm lượng dexamethason acetat.
2.3.3. Khảo sát giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) của phương pháp
2.3.3.1. Giới hạn phát hiện (LOD)
Giới hạn phát hiện (LOD) (limit of detection) được định nghĩa là nồng độ nhỏ nhất của chất phân tích mà có tín hiệu sắc ký lớn gấp 3 lần tín hiệu đường nền (S/N=3). Đây là một thông số đặc trưng cho độ nhạy của phương pháp. Chất nào nhạy hơn sẽ có giới hạn phát hiện nhỏ hơn (LOD = tín hiệu chiều cao pic/ nhiễu đường nền ≥ 3). Thường xác định LOD theo hai cách.
Phương pháp trực tiếp.
Dùng chính chất phân tích để pha thành loãng với nồng độ nhỏ nhất mà vẫn thu được tín hiệu lớn gấp 3 lần tín hiệu đường nền (S/N=3).
Phương pháp tính toán.
y
3×S LOD=
A
Độ lệch chuẩn SD: n 2 i i=1 y x -x S = n-1 n i i=1 bt X X = n Trong đó:
n là số lần phân tích lặp lại của mẫu i k là số bậc tự do (k= n-1)
xi là giá trị phân tích lần thứ i
xtblà giá trị phân tích trung bình của i lần Độ lệch tương đối: tt td S S = ×100 x
2.3.3.2. Giới hạn định lượng LOQ
Giới hạn định lượng (LOQ) (limit of quantitation) là nồng độ nhỏ nhất đo được của phương pháp, đó là nồng độ tối thiểu của một chất trong một nền mẫu xác định mà thiết bị có thể đo đúng được với một RSD% quy định nồng độ chất phân tích mà cho tín hiệu gấp 10 lần tín hiệu đường nền.
Theo lý thuyết thống kê trong hóa phân tích thì LOQ là nồng độ chất phân tích mà cho tin hiệu gấp 10 lần tín hiệu đường nền. (S/N=10) tức là:
10
LOQ = ×LOD 3
2.4. Xử lý số liệu thực nghiệm
- Độ lặp lại được dùng để đánh giá độ phân tán của các kết quả. Đại lượng này đặc trưng cho độ gần về giá trị trung bình của hai hay nhiều phép đo nhận được trong những điều kiện giống nhau.
- Đánh giá độ lặp dựa trên độ lệch chuẩn tương đối (RSD%).
- Các công thức tính toán trong xử lý thông kê kết quả thực nghiệm: + Giá trị trung bình: n i i=1 bt X X = n
+ Độ lệch chuẩn: n n 2 2 i i i=1 i=1 tt x -x x -x S = = n-1 k Trong đó:
n là số lần phân tích lặp lại của mẫu i k là số bậc tự do (k= n-1)
xi là giá trị phân tích lần thứ i
x là giá trị phân tích trung bình của i lần + Độ lệch tương đối:
t td t
S = S ×100 X
+ Với chuẩn Student:
tt x-μ t = S Trong đó: t là chuẩn Student
giá trị thực của đại lượng cần đo + Độ chính xác :
t×S
ε =
n
Ta suy ra khoảng tin cậy của giá trị phân tích
CHƯƠNG III
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 3.1. Khảo sát tìm điều kiện tối ưu của phương pháp phân tích
Để đánh giá sự phù hợp và ổn định của hệ thống thiết bị phân tích, chúng ta cần khảo sát lại các yếu tố ảnh hưởng quan trọng có thể dẫn đến sai số của phép phân tích.
- Dung dịch chuẩn gốc: Cân chính xác 50 mg (0,1 mg) chất chuẩn dexamethason acetat vào bình định mức dung tích 100,0 ml, thêm khoảng 70 ml methanol, lắc đến tan hoàn toàn và thêm methanol vừa đủ đến vạch, lắc đều, được dung dịch chuẩn gốc hydrocortison acetat có nồng độ khoảng 0,5 mg/ml.
- Dung dịch chuẩn làm việc: Pha các dung dịch chuẩn làm việc dexamethason acetat
Dung dịch chuẩn 1: Có nồng độ 0,5 ppm bằng cách lấy 0,1 ml Dung dịch chuẩn 2: Có nồng độ 1,0 ppm bằng cách lấy 0,2 ml Dung dịch chuẩn 3: Có nồng độ 2,0 ppm bằng cách lấy 0,4 ml Dung dịch chuẩn 4: Có nồng độ 3,0 ppm bằng cách lấy 0,6 ml Dung dịch chuẩn 5: Có nồng độ 5,0 ppm bằng cách lấy 1,0 ml Dung dịch chuẩn 6: Có nồng độ 6,0 ppm bằng cách lấy 1,2 ml Dung dịch chuẩn 7: Có nồng độ 6,5 ppm bằng cách lấy 1,3 ml Dung dịch chuẩn gốc vào mỗi bình định mức dung tích 50,0 ml tương ứng, thêm methanol vừa đủ đến vạch, lắc đều. Lọc các dung dịch qua màng lọc 0,45 μm để tiêm sắc ký. Có ghi các ký hiệu của mỗi mẫu chuẩn.
3.1.1. Khảo sát vạch phổ hấp thụ
Pha dung dịch chuẩn làm việc dexamethason acetat có nồng độ 2,0 ppm. Tiến hành vận hành thiết bị ở các điều kiện theo các tài liệu đã tham khảo [6, 15, 17, 22]:
- Cột sắc ký: Cột C18 (250 x 4,6 mm, 5 μm I.D.). - Tốc độ dòng: 1,2 ml/phút.
- Thể tích tiêm mẫu: 20 μl.
- Detecter: Thay đổi các bước sóng xung quanh giá trị 240 nm.
Khảo sát tìm bước sóng tối ưu xác định hàm lượng của dexamethason acetat. Kết quả thu được trình bày trong bảng 3.1.
Bảng 3.1. Kết quả khảo sát vạch đo phổ của dexamethason acetat
(nm) 237 238 239 240 241 242
Spic - 2,0 ppm 50189 50209 50252 50485 50247 50212
RSD% 0.2194 0.2193 0.2191 0.2181 0.2191 0.2193
Nhận xét:
Như vậy qua kết quả khảo sát, chúng tôi chọn vạch hấp thụ 240 nm. Đây là vạch phổ đảm bảo cho độ hấp thụ cao, độ lặp tốt, phù hợp với phép phân tích. Kết quả này cũng phù hợp với một số tài liệu đã công bố [6],[22]. Các nghiên cứu tiếp theo chúng tôi chọn λ = 240 nm.
3.1.2. Khảo sát tỉ lệ pha động
Pha dung dịch chuẩn làm việc dexamethason acetat có nồng độ 2,0 ppm. Tiến hành vận hành thiết bị ở các điều kiện theo các tài liệu đã tham khảo:
- Thành phần pha động: Thay đổi tỉ lệ pha động acetonitril - nước xung quanh giá trị (35: 65).
- Cột sắc ký: Cột C18 (250 x 4,6 mm, 5μm I.D.). - Tốc độ dòng: 1,2 l/phút.
- Thể tích tiêm mẫu: 20 μl. - Detecter: 240 nm.
Khảo sát tìm tỷ lệ pha động tối ưu để xác định hàm lượng của dexamethason acetat. Kết quả thu được trình bày trong bảng 3.2.
Bảng 3.2. Kết quả khảo sát tỉ lệ pha động của dexamethason acetat
ACN: H2O 32:68 33:67 34:66 35:65 36:64 37:63
Spíc - 2,0 μg/ml 50123 50434 50492 50474 50231 50206
RSD% 0.3164 0.3145 0.3141 0.3142 0.3157 0.3159
Nhận xét:
Như vậy qua kết quả khảo sát, chúng tôi chọn tỉ lệ pha động ACN: H2O (34:66). Đây là tỉ lệ pha động đảm bảo cho độ hấp thụ cao, độ lặp tốt, phù hợp với phép phân tích. Kết quả này cũng phù hợp với một số tài liệu đã công bố. Các nghiên cứu tiếp theo chúng tôi sử dụng tỷ lệ pha động này [6, 10, 17, 22].
3.1.3. Khảo sát tốc độ dòng
Pha dung dịch chuẩn làm việc dexamethason acetat có nồng độ 2,0 μg/ml. Tiến hành vận hành thiết bị ở các điều kiện theo các tài liệu đã tham khảo:
- Thành phần pha động: Tỉ lệ pha động acetonit - nước (34 : 66). - Cột sắc ký: Cột C18 (250 x 4,6 mm, 5 μm I.D.).
- Tốc độ dòng: Thay đổi tốc độ xung quang 1,2 ml/phút. - Thể tích tiêm mẫu: 20 μl.
- Detecter: 240 nm.
Qua kết quả khảo sát cũng như dựa vào các tài liệu tham khảo yêu cầu xác định hàm lượng của dexamethason acetat ta thấy tốc độ dòng tại giá trị 1,2 ml/phút có độ hấp thụ lớn nhất được nêu trong bảng 3.3
Bảng 3.3. Kết quả khảo sát tốc độ dòng
V(ml/phút) 1,0 1,1 1,2 1,3 1,4 1,5
Spíc - 2,0 ppm 50347 50452 50512 50491 50281 50263
Nhận xét:
Như vậy qua kết quả khảo sát, chúng tôi chọn tốc độ dòng tại giá trị 1,2 ml/phút. Đây là tỉ lệ pha động đảm bảo cho độ hấp thụ cao, độ lặp tốt, phù hợp với phép phân tích. Kết quả này cũng phù hợp với một số tài liệu đã công bố [22]. Các nghiên cứu tiếp theo chúng tôi chọn tốc độ dòng tại giá trị 1,2 ml/phút.
3.1.4. Khảo sát xác định khoảng nồng độ tuyến tính
Chúng tôi tiến hành pha dãy dung dịch có nồng độ xác định tiến hành đo phổ hấp thụ của các dung dịch trên ở điều kiện tối ưu đã được khảo sát.
Kết quả đo phổ được trình bày trong bảng 3.4
Bảng 3.4. Khảo sát khoảng nồng độ tuyến tính
TT Nồng độ dung dịch chuẩn (ppm) Spíc 1 0,1 13768 2 0,3 16876 3 0,5 18981 4 1,0 32356 5 2,0 60513 6 3,0 99813 7 5,0 154136 8 6,0 187125 9 6,5 201324 10 6,7 203131 11 7,0 207122
Từ số liệu ở bảng 3.4 ta sử dụng chương trình Microsoft Excel 2003 vẽ được đồ thị hình 3.4. 0 50000 100000 150000 200000 250000 0 1 2 3 4 5 6 7 8 ppm Spic
Hình 3.1. Đồ thị khảo sát khoảng nồng độ tuyến tính của dexamethason axetat
Nhận xét:
Qua đồ thị hình 3.1 ta thấy khoảng tuyến tính thể hiện mối quan hệ diện tích pic nồng độ của dexamethason axetat là 0,5 ppm đến 6,5 ppm.
3.2. Xây dựng đường chuẩn, xác định giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) của dexamethason acetat hạn định lượng (LOQ) của dexamethason acetat
Pha các dung dịch chuẩn làm việc dexamethason acetat có nồng độ 0,5 ppm, 1,0 ppm; 2,0 ppm; 3,0 ppm; 5,0 ppm; 6,0 ppm; 6,5 ppm. Tiến hành vận hành thiết bị ở các điều kiện đã khảo sát và theo các tài liệu đã tham khảo:
- Thành phần pha động: Tỉ lệ pha động acetonit - nước (34: 66). - Cột sắc ký: Cột C18 (250 x 4,6 mm, 5μm I.D.).
- Tốc độ dòng: Thay đổi 1,2 ml/phút. - Thể tích tiêm mẫu: 20 μl.
- Detecter: 240 nm
Từ kết quả thu được ở trên để chúng tôi dùng phần mềm origin 7.5 để xây dựng phương trình hồi quy đầy đủ cho đường chuẩn của dexamethason
acetat, đồng thời xác định giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng. Kết quả thu được trình bày trong bảng 3.5.
Bảng 3.5. Số liệu xây dựng đường chuẩn
TT Nồng độ dung dịch
chuẩn (ppm) Tổng Spíc Số liệu thống kê
1 0.5 18981 y = 30623x + 2757.8 r = 0.9993 2 1.0 32356 3 2.0 60513 4 3.0 99813 5 5.0 154136 6 6.0 187125 7 6.5 201324
Từ số liệu ở bảng 3.5 ta sử dụng chương trình Microsoft Excel vẽ được đồ thị mối quan hệ tuyến tính giữa diện tích pic và nồng độ chất chuẩn được thể hiện trên hình 3.2. y = 30623x + 2757.8 R2 = 0.9987 0 50000 100000 150000 200000 250000 0 1 2 3 4 5 6 7 ppm Spic
Phương trình đường chuẩn Data_B: Y= A*X + B R: Độ lệch chuẩn tương đối
SD: Độ lệch chuẩn tuyệt đối N: Số lần thực nghiệm (N =7) P: Độ sai số cho phép
Thông số Giá trị Sai số
A B 30623 2757.8 503 2062 R SD N P 0,99933 2987 7 <0.0001
Tra bảng phân phối Student ta được giá trị t (P = 0,95; f = N-1 = 6) = 2,45 Theo kết quả tính toán của phần mềm origin 7.5 ta có:
∆A = t(0,95;6)*SA = 2,45*503 = 1232.4 ∆B = t(0,95;6)*SB = 2,45*2062 = 5051.9
Vậy phương trình hồi quy đầy đủ của đường chuẩn có dạng: Ai = (30623± 1232.4)* X +( 2757.8 ± 5051.9) Trong đó:
Ai là diện tích píc của phân tích
X là nồng độ của dexamethoxason acetat (ppm)
3.2.1. Giới hạn phát hiện (LOD)
LOD được xem là nồng độ của chất phân tích mà hệ thống phân tích còn cho tín hiệu phân tích khác có nghĩa với tín hiệu của mẫu trắng hay tín hiệu nền.
Giới hạn phát hiện dexamethoxason acetat bằng phép đo HPLC theo