II. Bố cục của luận văn
1.4.2. Phân loại
Dựa vào sự khác nhau về cơ chế tách chiết sử dụng trong HPLC, người ta chia HPLC thành 4 loại:
Sắc ký hấp phụ hay sắc ký lỏng rắn(adsorption/liquid chromatography). Sắc ký phân bố (partition chromatography).
Sắc ký ion (ion chromatography).
Sắc ký rây phân tử (size exclusion/gel permeation chromatography). Trong đó, sắc ký phân bố (SKPB) được ứng dụng nhiều nhất vì có thể phân tích được những hợp chất từ không phân cực đến những hợp chất rất phân cực, hợp chất ion có khối lượng phân tử không quá lớn (< 3000).
SKPB được chia thành hai loại dựa trên độ phân cực tương đối giữa pha tĩnh và pha động: sắc ký pha thường (hay còn gọi là sắc ký pha thuận) - SKPT (normal phase chromatography) và sắc ký pha đảo - SKPĐ (reversed phase chromatography).
Trong sắc ký ion: Pha tĩnh là các chất hữu cơ mang các nhóm hoạt động khác nhau: cation để tách các kim loại kiềm và kiềm thổ, amonium, các amin-anion để tách các anion vô cơ, phosphate hữu cơ.
Trong SKPT, pha tĩnh sử dụng có độ phân cực cao hơn pha động. Pha tĩnh loại này sẽ có ái lực với các hợp chất phân cực. SKPT dùng để tách và phân tích các hợp chất có độ phân cực cao với phân tử lượng không lớn lắm.
SKPĐ là thuật ngữ để chỉ một loại sắc ký trong đó pha tĩnh ít phân cực hơn pha động. Phương pháp này dùng phân tích các hợp chất từ không phân cực đến phân cực. Hầu hết các hợp chất hữu cơ có mạch carbon dài (ít phân cực) rất thích hợp cho phân tích bằng SKPĐ. Dung môi sử dụng trong SKPĐ là các dung môi phân cực, trong đó dung môi nước đóng vai trò quan trọng mà lại rẻ tiền. Do đó, SKPĐ được ứng dụng nhiều và phổ biến hơn SKPT [10, 15, 16, 17].
1.4.3. Pha tĩnh trong sắc ký pha đảo
Trong sắc ký phân bố nói chung, pha tĩnh là những hợp chất hữu cơ được gắn lên chất mang rắn silica hoặc cấu thành từ silica theo hai kiểu:
Pha tĩnh được giữ lại trên chất mang rắn bằng cơ chế hấp phụ vật lý → sắc ký lỏng-lỏng (liquid-liquid chromatography). Pha tĩnh liên kết hóa học với chất nền → sắc ký pha liên kết (bonded phase chromatography).
Trong quá trình sử dụng, người ta nhận thấy sắc ký pha liên kết có nhiều ưu điểm hơn sắc ký pha lỏng - lỏng vì một số nguyên nhân sau:
Pha tĩnh trong hệ sắc ký lỏng-lỏng dễ bị hòa tan bởi pha động nên dễ bị mất mát pha tĩnh trong thời gian sử dụng và gây nhiễm đối với hợp chất phân tích.
Do pha tĩnh của sắc ký lỏng - lỏng dễ tan trong pha động nên người ta không thể ứng dụng phương pháp rửa giải gradient dung môi.
Vì vậy, ta thường chỉ quan tâm đến loại sắc ký phân bố pha liên kết và phần lớn các loại cột sử dụng hiện nay trong sắc ký phân bố đều có cấu trúc dạng này.
Bề mặt các hạt silica - SiO2 (các hạt này có đường kính 3, 5 hoặc 10 µm) được xử lý (thủy phân) bằng cách đun nóng với HCl 0,1M trong một hoặc hai ngày để tạo ra những nhóm SiOH như sau (thông thường chỉ có khoảng 8 µmol SiOH/m2 bề mặt):
Sau đó bề mặt silica đã thủy phân này sẽ được cho phản ứng với các organochlorosilan để tạo ra các pha tĩnh không phân cực, phân cực trung bình hoặc rất phân cực tùy theo nhóm R gắn vào.
Hình 1.9. Tạo nhánh trên bề mặt silica
Thường chỉ khoảng 50% nhóm -OH mất H+ để tạo ra HCl (tức < 4 µmol/m2 bề mặt bị silan hóa) vì sự kết hợp sẽ dần dần bị ảnh hưởng bởi hiệu ứng lập thể. Ngoài nhóm Cl người ta còn sử dụng -OCH3.
Hợp chất cần phân tích khi đi qua pha tĩnh sẽ bị giữ lại bởi những lực lượng tương tác khác nhau tùy thuộc tính chất, đặc điểm của chất tan và pha tĩnh. Trong SKPĐ, nhóm thế R trong hợp chất siloxan hầu như không phân cực hoặc ít phân cực. Đó là các ankyl dây dài như C8 (n-octyl), C18 (n- octadecyl) còn gọi là ODS (octadecylsilan) hoặc các nhóm alkyl ngắn hơn như C2; ngoài ra còn có cyclohexyl, phenyl trong đó nhóm phenyl có độ phân cực cao hơn nhóm alkyl. Người ta nhận thấy các alkyl dây dài cho kết quả tách ổn định hơn các loại khác nên đây là loại được sử dụng nhiều nhất.
Hình 1.10. Cấu trúc của cột ODS
Tuy nhiên do hiệu ứng lập thể nên trong cấu trúc của pha tĩnh còn nhóm -OH chưa phản ứng, gây ảnh hưởng xấu đến quá trình tách sắc ký tùy môi trường pH phân tích.
Trong môi trường quá acid (pH < 2) thì có sự phân ly các nhóm ether (-O-Si-C18) ra khỏi nền. Lúc này cột sẽ mất hoạt tính dẫn đến chất cần phân tích không còn tương tác tốt với pha tĩnh nữa.
Trong môi trường bazơ (pH > 7), chính nền silic mang pha tĩnh có thể bị hòa tan (SiO2 thành silicat), hệ quả là số đĩa lý thuyết N giảm và số nhánh ghép cũng giảm, mũi sắc ký rộng ra và thời gian lưu cũng có thể giảm. Kết quả phân tích như vậy sẽ mất đi độ chính xác.
Một trong những cách khắc phục hiện tượng này là dùng các chất như trimethylchlorosilan ClSi(CH3)3 hoặc hexamethyldisilazan (ít sử dụng hơn) để tương tác với nhóm -OH này (gọi là hiện tượng end-capping). Lúc này ta sẽ có loại cột ít tương tác với chất phân tích có tính bazơ (cột LC-DB của hãng SUPELCO).
Hình 1.11. Cấu trúc cột LC-DB
Có một cách khác để loại trừ bớt ảnh hưởng của nhóm -OH mà không cần tương tác với nó là thay những nhóm methyl của -Si(CH3)2-C18 bằng những nhóm thế lớn hơn như isopropyl để những nhóm này sẽ che đi những nhóm -OH, cản trở tương tác của nhóm -OH với chất cần phân tích.
Hình 1.12. Cấu trúc cột có gốc isopropyl
Người ta còn ghép lên dây C18 một số nhóm phân cực để tăng thêm độ phân cực của dây C18, làm cột có khả năng tách chọn lọc hơn đối với những hợp chất phân cực mạnh (cột EPS - Expended Polar Selectivity).
Ngoài sườn silica, thời gian gần đây người ta có sử dụng đến nền nhựa polystyren (Polystyren Reversed Phase - PRP) cho phép phân tích trong môi trường pH từ 1 - 13. Cột này dễ sử dụng trong môi trường acid và bazơ mạnh [16, 17, 18].
1.4.4. Pha động trong sắc ký pha đảo
Dựa vào các tài liệu, dược điển, thành phần và tính chất của các chất có trong mẫu phân tích... từ đó ta lựa chọn pha động phù hợp để cho quá trình rửa giải tách hoàn toàn các chất có trong mẫu. Quy trình đó phải đáp ứng đầy đủ các tiêu chuẩn của pic đã trình bày đồng thời phải có thời gian phân tích phù hợp nhằm tiết kiệm được dung môi hóa chất, thời gian phân tích mẫu, giảm thiểu sự hoạt động của thiết bị.
Pha động trong sắc ký lỏng nói chung phải đạt những yêu cầu sau: Hòa tan mẫu phân tích.
Phù hợp với đầu dò.
Không hòa tan hay làm mòn pha tĩnh.
Có độ nhớt thấp để tránh áp suất dội lại cao. Tinh khiết dùng cho sắc ký (HPLC grade).
Do đó, trong một pha tĩnh đã chọn nếu ta chọn được pha động có thành phần phù hợp thì ta sẽ có hiệu suất tách sắc ký tốt nhất, đối với hỗn hợp các chất cần phân tích.
Chính vì vậy pha động cần có cầu yêu cầu sau:
Pha động phải trơ với pha tĩnh đã có, không được làm cho pha tĩnh bị biến đổi hóa học.
Pha động phải hòa tan được các chất phân tích thì mới rửa giải được chúng (đặc biệt phải chú ý khi thay đổi pha động phải rửa cột bằng dung môi phù hợp để không làm tủa các chất có trong cột, hay pha động có sẵn trong cột Ví dụ: đệm phosphat rửa ngay bằng ACN hay MeOH sẽ bị kết tủa trên column).
+ Phải bền vững theo thời gian: càng bền lâu càng tốt nhưng ít nhất là chúng là pha động không bị phân hủy trong suốt thời gian phân tích mẫu.
+ Phải có độ tinh khiết cao: dung môi cho HPLC, hoá chất tinh khiết phân tích.
+ Phải nhanh đạt cân bằng trong quá trình sắc ký.
+ Phải phù hợp với loại detector: Ví dụ: UV - Vis thì dung môi không được hấp thụ quang (Ví dụ: acid acetic ở bước sóng thấp < 220 nm). Detector huỳnh quang thì dung môi không được phát quang.
+ Phải kinh tế, không quá hiếm và đắt.
Trong sắc ký pha đảo, dung môi pha động có độ phân cực cao. Trên lý thuyết chúng ta có thể sử dụng khá nhiều dung môi nhưng kinh nghiệm thực tế cho thấy methanol (MeOH), acetonitril (ACN) và tetrahydrofuran (THF) là đạt yêu cầu nhất. Nước là một dung môi được cho vào các dung môi hữu cơ để giảm khả năng rửa giải.
Mỗi dung môi đều đặc trưng bởi các hằng số vật lý như chỉ số khúc xạ (refractive index), độ nhớt (viscocity), nhiệt độ sôi (boiling point), độ phân cực (polarity index), độ rửa giải (eluent strength) …
Trong đó độ phân cực và độ rửa giải có tác động lớn lên khả năng phân tách của các mũi sắc ký [15, 24].
Có ba thông số gây ảnh hưởng lớn đến tách các mũi sắc ký: số đĩa lý thuyết N, hệ số dung lượng K’, độ chọn lọc α. Khi sự thay đổi thành phần pha động không đem lại kết quả tách mũi theo yêu cầu thì chúng ta phải thay đổi bản chất pha động (sử dụng dung môi khác), tức thay đổi α. Đôi khi có thể phải thay đổi cả pha tĩnh.
Trong quá trình tách của SKPĐ, sự tương tác giữa hợp chất cần phân tích và pha động phụ thuộc rất nhiều vào moment lưỡng cực, tính acid (cho proton) hoặc tính bazơ (nhận proton) của dung môi.
Thông thường pha động trong SKPĐ bao gồm một hỗn hợp nước hoặc dung dịch đệm với một hoặc nhiều dung môi hữu cơ phân cực tan được trong nước. Nước là một dung môi rất phân cực nên nó không tương tác với những nhóm alkyl không phân cực trong pha tĩnh, do đó nó được coi như pha động yếu nhất và có tốc độ rửa giải chậm nhất trong tất cả các dung môi động của SKPĐ. Hỗn hợp nước và dung môi hữu cơ thường làm gia tăng độ nhớt dẫn đến việc tăng áp suất cột.
Hình 1.13. Độ nhớt của hỗn hợp nước và dung môi hữu cơ ở 25oC Việc lựa chọn dung môi và thành phần dung môi trong pha động được tối ưu hóa cho những hợp chất cần phân tích. Thông thường, người ta sử dụng hỗn hợp dung môi MeOH/nước trước, rồi ACN/nước hay THF/nước. Với một hỗn
hợp chất phân tích phức tạp thì sẽ có sự trộn lẫn của các dung môi hữu cơ với nước. Khi lựa chọn thì phải chọn các hỗn hợp MeOH, ACN và THF với nước có độ rửa giải tương đồng.
Thành phần pha động có thể cố định trong suốt quá trình chạy sắc ký (chế độ isocratic) hoặc được thay đổi theo một chương trình đã định sẵn (chương trình gradien dung môi) để có hiệu quả tách tốt hơn.
1.5. Các đại lượng đặc trưng của sắc ký đồ
Kết quả của quá trình tách các chất được detector phát hiện ghi thành sắc ký đồ. Từ các thông số của các pic, nhiều đại lượng đặc trưng về lý thuyết được đưa ra để đánh giá một quá trình sắc ký. Dưới đây là một số đại lượng thường dùng trong thực tế và cách thay đổi các đại lượng này có lợi cho quá trình phân tích sắc ký [16, 17, 21].
1.5.1. Thời gian lưu: Retenion time (Rt)
Thời gian lưu của một chất là thời gian tính từ khi bơm mẫu vào cột cho đến khi chất đó ra khỏi cột đạt giá trị cực đại.
Thời gian lưu của mỗi chất là hằng định và các chất khác nhau thì thời gian lưu sẽ khác nhau trên cùng một điều kiện sắc ký đã chọn. Vì vậy thời gian lưu là đại lượng để phát hiện định tính các chất.
Thời gian lưu phụ thuộc vào các yếu tố: Bản chất sắc ký của pha tĩnh.
Bản chất, thành phần, tốc độ của pha động. Cấu tạo và bản chất phân tử của chất tan.
Trong một số trường hợp thời gian lưu còn phụ thuộc vào pH của pha động. Trong một phép phân tích nếu Rt nhỏ quá thì sự tách kém, còn nếu Rt quá lớn thì pic bị doãng và độ lặp lại của pic rất kém, thời gian phân tích rất dài đồng thời kéo theo nhiều vấn đề khác như hao tốn dung môi, hóa chất, độ chính xác của phép phân tích kém. Để thay đổi thời gian lưu ta dựa vào các yếu tố trên.
1.5.2. Hệ số dung lượng K’
Hệ số dung lượng của một chất cho biết khả năng phân bố của chất đó trong hai pha cộng với sức chứa của cột, tức là tỷ lệ giữa lượng chất tan trong pha tĩnh và lượng chất tan trong pha động ở thời điểm cân bằng.
Thường được tính theo công thức sau: t -t
tR R o tR
k' = = = -1
t t t
o o o
Hệ số dung lượng k’ phụ thuộc vào bản chất của chất phân tích, đặc tính của pha tĩnh và pha động.
Nếu k’ nhỏ hơn, tR cũng nhỏ và sự tách kém. K’ lớn thì pic bị loãng, độ nhạy kém. Trong thực tế k’ từ 1 đến 5 là tối ưu. Hai chất chỉ được tách ra khỏi nhau nếu chúng có giá trị khác nhau. Trong phân tích thường chọn cột, pha động và các điều kiện phân tích sao cho: 1< k’ <8.
1.5.3. Độ chọn lọc (α) và độ phân giải (Rs)
Để hoàn toàn phân tích hai cấu tử thì pic của chúng phải không được chồng lên nhau.
Tiêu chuẩn để đánh giá chất lượng phân tích là độ chọn lọc và độ phân giải. Độ chọn lọc α là tiêu chuẩn để đánh giá độ tách với hai đỉnh píc và được định nghĩa. ' 2 R2 o ' 1 R1 o K t - t α = = K t - t
Hai pic tách với nhau khi α > 1. Tuy nhiên, nếu chân pic mà chồng lên nhau thì cũng không thể phân tách hoàn toàn hai cấu tử. Nghĩa là độ chọn lọc không đủ đánh giá chất lượng phân tích. Do đó chất lượng phân tích được đánh giá dựa trên độ phân giải Rs (Resolution) là đại lượng được xét từ toàn bộ píc.
Độ phân giải (Rs) được tính như sau:
R2 R1 R2 R1
2 1 1/2,2 1/2,1
2 t - t 2 t - t
R s = =
Trong đó:
W là độ rộng của chân pic W1/2 là độ rộng bán pic
Khi Rs = 1 thì 2 pic có độ lớn tương đương sẽ có 5% diện tích bị xen phủ. Để tách hoàn toàn hai cấu tử thì Rs ≥ 1,5.
Nếu R nhỏ thì các pic chưa tách hẳn, việc tính toán diện tích pic sẽ không chính xác.
Nếu R lớn quá thì thời gian phân tích sẽ lâu, tốn nhiều pha động, độ nhạy sẽ kém. Để khắc phục ta có thể thay đổi hệ pha động hay dùng chương trình gradient dung môi. Tuy nhiên trong quá trình chạy sắc ký dùng chương trình dung môi thì một số pha động có tỷ lệ thay đổi sẽ kéo theo sự thay đổi đường nền làm ảnh hưởng rất lớn đến thời gian lưu và diện tích của các pic ta phân tích
Trong thực tế nên hạn chế sử dụng chương trình gradient dung môi mà chủ yếu là chúng ta phải tìm được hệ pha động rửa giải phù hợp, đáp ứng các yêu cầu trong quá trình phân tích.
1.5.4. Số đĩa lý thuyết N
Số đĩa lý thuyết là đại lượng biểu thị hiệu năng của cột trong một điều kiện sắc ký nhất định. Mỗi đĩa lý thuyết trong cột sắc ký giống như một lớp pha tĩnh có chiều cao là H. Tất nhiên lớp này có tính chất động, tức là một khu vực của hệ phân tích mà trong đó một cân bằng nhiệt động được thiết lập giữa nồng độ trung bình của chất tan trong pha tĩnh và pha động. Vì vậy, với một điều kiện sắc ký xác định thì chiều cao H cũng hằng định đối với một chất phân tích và số đĩa lý thuyết của cột cũng xác định.
Số đĩa lý thuyết N được tính theo công thức:
2 2 2 R R R 1/2 t t t N = = 5,54. =16. δ W W Trong đó:
tR thời gian lưu của chất phân tích W1/2 là độ rộng tại điểm 1/2 của pic
1.5.5. Hệ số bất đối xứng T
Hệ số đối xứng T cho biết mức độ không đối xứng của pic trên sắc đồ