Thành phần môi trường Hansen
Glucose: 50g Nước: 1000ml Pepton: 10g Thạch: 15 - 20g KH2PO4: 3g (pH= 5-6) MgSO4.7H2O: 2g 3.5.6. Phương pháp xử lý số liệu Xử lý số liệu trên phần mền SPSS 16.0.
PHẦN 4
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1. Kết quả nghiên cứu khảo sát thành phần hóa học của nguyên liệu
Bã men chứa hàm lượng protein tổng số đạt 8,61%. Hàm lượng ẩm đạt 84,54% và hàm lượng chất khô là 15,46%.
4.2. Kết quả lựa chọn phương pháp xử lý nguyên liệu
4.2.1. Kết quả lựa chọn đường kính lỗ rây cho quá trình lọc bã men bia
Bã nấm men sau khi được rút ra từ đáy tank lên men bia được chuyển về các tank chứa. Khuấy đều và lọc qua sàng rây có các kích thước lỗ sàng khác nhau là 25, 30 và 35µm.
Bảng 4.1: Ảnh hưởng của quá trình lọc đến chất lượng bã men bia
Mẫu Kích thước lỗ rây (µm)
Tính chất của sinh khối nấm men sau khi lọc Tỉ lệ tế bào sống
(%)
Nhận xét, đánh giá cảm quan
1 25 Bí không lọc được
2 30 98,30 Sinh khối nấm men thuần khiết có màu trắng sáng.
3 35 96,70
Sinh khối nấm men có màu trắng sáng, lẫn một số chấm
đen và cặn.
Kết quả bảng 4.1 cho thấy lọc bã men bia với kích thước lỗ rây là 25µm sinh khối nấm men không lọc được nhưng ở kích thước lỗ rây 35µm tốc độ lọc nhanh tỷ lệ tế bào sống đạt 96,70% nhưng sinh khối sau khi lọc lẫn chấm đen và cặn. Với kích thước lỗ rây là 30µm tỷ lệ tế bào sống rất cao là 98,30%, sinh khối nấm men thuần khiết có màu trắng sáng. Tuy nhiên tỷ lệ nước cũng đóng vai trò quan trọng đến tốc độ lọc. Nếu ít nước, nấm men quá đặc, quá trình lọc không được nhanh, tốc độ lọc chậm. Do đó chúng tôi tiến hành xác định lượng nước cần thiết cho quá trình lọc.
4.2.2. Kết quả xác định tỷ lệ nước và bã men bia cho quá trình lọc
Tỷ lệ nước cũng đóng vai trò quan trọng đến khả năng lọc. Do đó chúng tôi tiến hành xác định lượng nước cần thiết cho quá trình lọc, với kích thước lỗ rây là 30µm, kết quả được trình bài ở bảng dưới đây:
Bảng 4.2: Ảnh hưởng của tỷ lệ nước sử dụng cho quá trình lọc bã nấm men bia Tỷ lệ nước: sinh khối
bã nấm men bia (w/w) Thao tác lọc
Đối chứng (không bổ
sung nước) Khó lọc do sinh khối nấm men đặc
2:1 Tốc độ lọc chậm, lỗ rây bị bí do nấm
men bết lại rất nhiều trên mặt sàng
2,5:1 Lọc dễ hơn nhưng tốc độ lọc vẫn
còn chậm
3:1 Lọc dễ, tốc độ lọc nhanh
3,5:1 Lọc dễ, tốc độ lọc nhanh
Kết quả ở bảng 4.2 cho ta thấy tỷ lệ nước: sinh khối ở hai tỷ lệ 3:1; 3,5:1 thì tốc độ lọc nhanh và không còn nấm men bết lại trên mặt sàng. Nhưng ở tỷ lệ 2:1; 2,5:1 thì quá trình lọc diễn ra khó, tốc độ lọc chậm. Nghiên cứu cho thấy tỷ lệ nước: sinh khối bã nấm men bia 3:1 là thích hợp cho quá trình lọc, đồng thời tiết kiệm được lượng nước sử dụng.
4.2.3. Kết quả xác định số lần rửa sinh khối nấm men bia
Sau khi xác định được tỷ lệ nước: sinh khối tối ưu, để sinh khối nấm men được sạch hoàn toàn khỏi dịch bia, tiếp tục rửa nấm men nhiều lần để loại bỏ hoàn toàn các tạp chất còn trong bã men và đánh giá kết quả của quá trình lọc bằng cách xác định độ trong của nước rửa sau khi lắng, kết quả được trình bày ở bảng dưới đây:
Bảng 4.3: Ảnh hưởng của một số lần rửa đến chất lượng của nấm men bia Số lần rửa Độđục của nước sau khi rửa (OD275) 1 1,65 2 0,45 3 0,24 4 0,19
Kết quả ở bảng 4.3 cho thấy độ đục của nước rửa giảm đáng kể sau khi rửa. Độ đục của nước rửa lần 1 là cao nhất OD275 = 1,65, rửa lần thứ 2 thì cho độ đục là OD275 = 0,45, rửa lần 3 cho độ đục là OD275 = 0,24, rửa lần 4 cho độ đục của nước rửa là thấp nhất OD275 = 0,19. Với tỷ lệ nước rửa: bã men bia là 3:1 chọn lần rửa bã men bia là 3 lần vì tiết kiệm thời gian, đạt hiệu quả về kinh tế và chất lượng nấm
men được đảm bảo nên dừng quá trình rửa ở giai đoạn này để tiếp tục thực hiện quá trình tách đắng ở giai đoạn tiếp theo.
4.3. Kết quả xác định phương pháp loại bỏ chất đắng trong bã men bia
4.3.1. Kết quả lựa chọn dung môi để loại bỏ chất đắng trong bã nấm men
Để xác định phương pháp hiệu quả tách vị đắng, chúng tôi đã sử dụng các hóa chất khác nhau để thử nghiệm. Sau đó xác định các thông số độ đục của nước rửa, độ đắng (EBU) để lựa chọn dung môi phù hợp được thể hiện ở bảng 4.4 dưới đây.
Bảng 4.4: Các hóa chất dùng loại bỏ chất đắng của sinh khối nấm men bia:
STT Hóa chất xử lý Độđục của nước xử lý Độ màu của nước xử lý pH Độđắng (EBU) 1 Dung dịch axit acetic 1% 7,36 Vàng nhạt 4,30 7,80 2 Dung dịch NaOH 0,1N 29,12 Nâu nhạt 10,60 23,10 3 Dung dịch muối NaCl 0,04% 21,28 Vàng đậm 6,40 15,60 4 Dung dịch KOH 0,1N 24,64 Nâu nhạt 10,80 18,40
Chú thích: nhiệt độ của quá trình xử lý là 20oC, nồng độ các dung dịch thí nghiệm kế thừa từ các nghiên cứu của Bishop, L.R. (1967) [19].
Kết quả quả ở bảng 4.4 cho thấy độ đục và độ đắng của dung dịch sau khi xử lý bằng NaOH 0,1N và KOH 0,1N là cao nhất và màu của nước rửa có màu nâu nhạt tuy nhiên xử lý bằng KOH (OD = 24,64; EBU = 18,40) cho độ đục thấp hơn NaOH 0,1N (OD = 29,12; EBU = 23,50). Trong khi đó các phương pháp còn lại cho giá trị OD thấp hơn nhiều, cụ thể là xử lý bằng NaCl 0,04% (OD = 21,28; EBU = 15,60), axit acetic 1% (OD = 7,36; EBU = 7,80). Kết quả này có thể giải thích là trong phương pháp xử lý bằng dung dịch kiềm thành phần isohumulones gắn trên mặt tế bào nấm men không bền do vậy tách khỏi tế bào nấm men và chuyển vào dung dịch [19]. Chính vì vậy, nước xử lý nấm men có màu nâu nhạt và độ đục của nước tăng cao. Nhưng trong quá trình tự phân nấm men thì phương pháp xử lý bằng NaCl 0,04% tỏ ra hiệu quả cho sản phẩm có màu vàng tươi và cho mùi thơm của axit amin còn dung dịch kiềm thì cho mùi khó chịu và màu nâu đen. Mặt khác sử dụng dung dịch kiềm thì tốn
nhiều hóa chất để đưa về pH tối ưu của phương pháp tự phân. Do đó chúng tôi chọn loại đắng bằng phương pháp NaCl 0,04%.
4.3.2. Kết quả xác định tỉ lệ dung môi của dịch nấm men thích hợp cho quá trình tách đắng tách đắng
Bã nấm men bia sau quá trình tiền xử lý, sau đó được tách đắng bằng dung dịch NaCl 0,04% ở các tỷ lệ 1:1; 2:1; 3:1; 4:1 ở nhiệt độ trong thời gian. Khả năng loại đắng trong quá trình xử lý được trình bày ở bảng 4.5.
Bảng 4.5: Ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi: sinh khối nấm men
Tiêu chí 1:1 2:1 3:1 4:1 Độ đắng (EBU) 12,20 13,50 16,30 15,60 OD275 14,72 18,56 21,60 19,84 pH 5,90 6,40 6, 83 7,40 Tỷ lệ đắng bị loại bỏ (%) 63,70 72,10 89,40 87,60 Màu sắc Vàng nhạt Vàng Vàng đậm Vàng đậm
Kết quả bảng 4.5 cho thấy khi xử lý bã men bia ở các nồng độ dung dịch NaCl 0,04% khác nhau làm cho giá trị pH trong dịch thay đổi. Tỷ lệ dung dịch NaCl 0,04%: sinh khối nấm men càng lớn thì pH càng cao. Nấm men được loại đắng tốt nhất khi pH xử lý là 6,83, tương ứng với tỷ lệ dung dịch NaCl 0,04%: sinh khối nấm men là 3:1. Với tỷ lệ 1:1; 2:1 thì sản phẩm vẫn còn đắng. Điều này chứng tỏ khi tỷ lệ dung dịch NaCl 0,04%: sinh khối nấm men thấp thì pH của dung dịch xử lý thấp, lượng NaCl 0,04% không đủ để phản ứng với thành phần isohumulones, dẫn đến hiệu quả của quá trình loại đắng không cao. Tuy nhiên, khi tỷ lệ NaCl 0,04%: sinh khối nấm men tăng lên 4:1 thì giá trị pH của phản ứng là 7,4 hiệu quả tách đắng không tăng mà còn giảm đi, do vậy tỷ lệ dung NaCl 0,04%: nấm men là 3:1 (pH = 6,83) là thích hợp cho hiệu quả tách đắng.
4.3.3. Ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian đến hiệu quả tách đắng
Nghiên cứu nhiệt độ và thời gian là rất cần thiết, bởi đây là những yếu tố ảnh hưởng đến hiệu suất tách đắng. Chúng tôi khảo sát ở nhiệt độ 5o
C, 10oC, 15oC, 20oC, 25oC và 30oC trong thời gian 15, 30 và 45 phút cho kết quả dưới đây:
Bảng 4.6: Ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian đến hiệu quả tách đắng CT Tỷ lệ tế bào sống (%) Vị của nấm men CT1 99,17a Đắng CT2 98,07ab Đắng CT3 96,80b Đắng CT4 98,27ab Đắng CT5 93,43c Hơi đắng CT6 91,27d Không đắng CT7 96,73b Đắng CT8 91,13d Hơi đắng CT9 86,27e Không đắng CT10 98,20ab Hơi đắng CT11 94,55b Hơi đắng CT12 89,88d Không đắng CT13 97,84ab Không đắng CT14 90,40d Không đắng CT15 83,44f Không đắng CT16 90,88d Không đắng CT17 85,04f Không đắng CT18 80,42g Không đắng
Chú thích: Trong cùng một cột các điểm trung bình có chữở mũ giống nhau thì không có sự sai khác nhau ở mức ý nghĩa 5%.
Từ bảng 4.6 ta thấy nhiệt độ và thời gian xử lý là hai nhân tố quan trọng có ảnh hưởng rất lớn đến việc tách thành phần isohumulones ra khỏi sinh khối tế bào. Ở nhiệt độ thấp 4 - 10oC, phản ứng xảy ra chậm, quá trình loại đắng cần nhiều thời gian (45 phút). Nhiệt độ cao thúc đẩy phản ứng diễn ra nhanh hơn, quá trình loại đắng thực hiện hiệu quả trong thời gian ngắn. Nhưng xử lý nấm men ở điều kiện nhiệt độ cao ảnh hưởng tới tỷ lệ tế bào sống trong sinh khối
nhưng thời gian xử lý ngắn lại là yếu tố để nấm men không phải tồn tại lâu trong dung dịch trung tính. Ở điều kiện nhiệt độ 25oC trong 15 phút, sinh khối nấm men được tách đắng hoàn toàn, đồng thời tỷ lệ tế bào sống cũng còn rất cao là 97,84%. Tuy nhiên, khi xử lý ở nhiệt độ 25oC trong thời gian dài hơn 30 phút thì sinh khối nấm men chết nhiều hơn 7,8%.
Qua kết quả xử lý thống kê cho thấy tỷ lệ tế bào nấm men sống ở 20oC trong 15 phút và 25oC trong 15 phút khác nhau không có ý nghĩa ở mức α = 0,05. Nhưng ở 20oC trong 15 phút thì sinh khối nấm men còn hơi đắng nên phương pháp xử lý nấm men bằng dung dịch NaCl 0,04% ở điều kiện nhiệt độ 25oC trong thời gian 15 phút rất phù hợp với quy mô công nghiệp vì tiết kiệm được chi phí làm lạnh và thời gian loại đắng.
4.4. Nghiên cứu điều kiện tự phân nấm men
Tự phân là quá trình xảy ra khi tế bào nấm men đã chết, vách tế bào không còn khả năng tự bảo vệ và sẽ bi phá vỡ bởi chính các enzym trong tế bào. Lúc này các chất trong tế bào chất như protein, nucleotide, carbohydrate... cũng sẽ bị chính hệ thống enzym tấn công và phân hủy. Quá trình tự phân chịu ảnh hưởng tới nhiều yếu tố khác nhau như nồng độ nấm men trong dung dịch, các yếu tố thúc đẩy quá trình tự phân như ethyl acetate, chitosan..., nhưng yếu tố quan trọng nhất vẫn là nhiệt độ, pH, thời gian. Đối với từng loại nấm men khác nhau thì các yếu tố chi phối cũng khác nhau [18].
4.4.1. Khảo sát quá trình diệt men trước khi tự phân
Sau khi kết thúc quá trình xử lý nguyên liệu chúng tôi tiến hành diệt men trước khi tự phân ở nhiệt độ 50oC, 55oC, 60oC và 65oC trong thời gian 10, 15 và 20 phút, kết quả tỷ lệ tế bào nấm men chết được thể hiện ở bảng 4.7:
Bảng 4.7: Kết quả khảo sát nhiệt độ và thời gian diệt men trước khi tự phân CT Tỷ lệ nấm men chết (%) CT Tỷ lệ nấm men chết (%) CT19 64,40i CT25 93,70c CT20 67,70h CT26 95,30bc CT21 76,10g CT27 96,80b CT22 82,30f CT28 98,60a CT23 86,80e CT29 100a CT24 88,70d CT30 100a
Chú thích: Trong cùng một cột các điểm trung bình có chữở mũ giống nhau thì không có sự sai khác nhau ở mức ý nghĩa 5%
70 72.5 75 77.5 80 82.5 85 87.5 90 92.5 95 97.5 100 50 55 60 65 Nhiệt độ điệt m e n T ỷ l ệ n ấ m m e n c h ế t (% ) 10 15 20
Hình 4.1: Ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian diệt men đến tỷ lệ tế bào nấm men chết
Nhận xét: từ bảng 4.7 và hình 4.1 trên ta thấy nhiệt độ và thời gian ảnh hưởng đến quá trình diệt men. Tỷ lệ nấm men chết đạt 100% sau thời gian ngắn nhất là 15 phút 65oC. Nếu tăng nhiệt lên quá cao sẽ gây lãng phí nhiệt lượng, hơn nữa có thể phá hủy một số thành phần dinh dưỡng bên trong nấm men.
4.4.2. Kết quảảnh hưởng của nhiệt độ tới quá trình tự phân nấm men
Tiến hành khảo sát nhiệt độ tự phân là 45, 50 và 55oC, xác định hàm lượng axit amin bằng phương pháp phương pháp ninhydrin trong các khoảng thời gian 24, 36, 48, 60 và 72 giờ. Kết quả được trình bày ở bảng 4.8 dưới đây:
Bảng 4.8: Ảnh hưởng của nhiệt độđến hiệu quả tự phân nấm men CT Hàm lượng axit amin
(g/100 g men KTĐ) CT
Hàm lượng axit amin (g/100 g men KTĐ) CT31 15,47h CT39 48,65e CT32 16,41h CT40 54,06d CT33 16,11h CT41 59,03a CT34 35,02g CT42 55,81bc CT35 37,08f CT43 55,46bc CT36 35,67g CT44 56,6b CT37 48,44e CT45 55,06cd CT38 55,78bc
Chú thích: Trong cùng một cột, các điểm trung bình có chữ ở mũ giống nhau thì không có sự sai khác nhau ở mức ý nghĩa 5%.
Kết quả ở bảng 4.8 cho thấy ở các nhiệt độ và thời gian khác nhau thì hàm lượng axit amin khác nhau. So sánh 3 mức nhiệt độ tự phân 45, 50 và 55oC ta thấy hàm lượng axit amin tạo thành nhiều nhất ở nhiệt độ 50oC. Cụ thể, sau 60 giờ tự phân hàm lượng axit amin tạo thành 54,06g ở 45oC; 59,03g ở 50o
C; 55,81g ở 55o
C, nhưng sau 60 giờ thì hàm lượng axit amin giảm do thời gian tự phân dài dẫn đến việc axit amin bị phân hủy tạo thành nhiều sản phẩm phụ, gây thoát axit amin.
Qua kết quả xử lý thống kê cho thấy hàm lượng axit amin ở nhiệt độ 45oC, 50oC và 55oC trong khoảng thời gian 24, 36, 48, 60 và 72 giờ khác nhau có ý nghĩa ở mức α = 0,05. Do đó nhiệt độ tự phân được chọn là 50oC và thời gian tự phân 60 giờ.
4.4.2. Kết quả xác định pH của quá trình tự phân
Sau khi chọn được nhiệt độ tự phân 50oC và thời gian tự phân 60 giờ, chúng tôi tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng của pH đến quá trình tự phân.
Bảng 4.9: Ảnh hưởng của pH đến quá trình tự phân của nấm men
CT Hàm lượng axit amin (g/100 g men KTĐ) CT Hàm lượng axit amin (g/100 g men KTĐ) CT46 13,18i CT54 31,43d CT47 15,03h CT55 32,61d CT48 15,14h CT56 37,07c CT49 15,05h CT57 38,19c CT50 24,07g CT58 48,61b CT51 24,93fg CT59 57,99a CT52 25,88f CT61 47,98b CT53 27,60e
Chú thích: Trong cùng một cột các điểm trung bình có chữ ở mũ giống nhau thì không có sự sai khác nhau ở mức ý nghĩa 5%.
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 24 36 48 60 Thời gian (giờ) H à m l ư ợ n g a x it a m in ( g /1 0 0 g m e n K T Đ ) pH 4,5 pH 5,0 pH 5,5 pH 6,0
Hình 4.2: Ảnh hưởng của pH đến quá trình tự phân nấm men
Nhận xét: kết quả ở bảng 4.9 và hình 4.2 cho thấy pH tự phân khác nhau ảnh hưởng đến hàm lượng axit amin sinh ra, pH là yếu tố ảnh hưởng đến mức độ phá vỡ màng tế bào nấm men và khả năng chuyển hóa protein thành axit amin. Thay đổi pH dẫn tới sự thay đổi H+ (C. N. Khobragade và S G Chandel 2002) [20]. Ở pH 5,5 hàm lượng axit amin đạt cao nhất 57,99g ở nhiệt độ 50oC và thời gian 60 giờ, ngược