được dùng làm probitic, s phâ tử có thể coi như là ch
Dựa vào cách chỉ tiêu sinh hóa và m chủng vi khuẩn, chúng tôi đ
tiến hành các thí nghiệm c nghiệm này, chúng tôi sử (CH1 và CH9 là hai chủ thuật PCR-RFLP.
Hình 10. Sơ đồ các phân đo
Alw26I và AflII của gen mã hóa 16S ri
Trên cơ sở xây dự phân đoạn DNA thu đượ Bảng 10dưới đây. Các phân đo thay đổi do các phân đoạ hiệu ở hai đầu của gen chưa r ở hai đầu của gen có thể
hiệu suất hoạt động của enzyme c
50
ệt các chủng đã phân lập bằng kỹ thuật PCR-RF n mức độ chủng là rất cần thiết đối với các ch c dùng làm probitic, sự khác biệt đến mức độ chủng nhờ các kĩ thu
coi như là chỉ thị để nhận diện nhanh các chủng probiotic thương m tiêu sinh hóa và mức độ thể hiện các tính chất có l
n, chúng tôi đã quyết định chọn ra 02 chủng đó là CH16 và CH22 đ m cũng như đánh giá các tính chất tiếp theo. Trong thí ử dụng 04 chủng đối chứng là HU36, HU58
ủng từ một nghiem cứu khác của nhóm) đ
các phân đoạn thu được sau khi xử lí bởi bộ enzyme gi gen mã hóa 16S ribosome của các chủng vi khu
ựng sơ đồ cắt enzyme giới hạn gen mã hóa ợc của mỗi chủng theo lý thuyết được thể hi i đây. Các phân đoạn có chữ màu đỏ là các phân đoạn mà s
ạn này nằm ở hai đầu của gen. Trong khi giả
a gen chưa rõ và mất một đoạn trình tự gắn môi nên hai phân đo ể được cộng thêm khoảng 30-50 nuclêôtít. Trong th a enzyme cắt giới hạn ít khi đạt 100% cho nên s
FLP
i các chủng vi khuẩn ĩ thuật sinh học ng probiotic thương mại. t có lợi của các ng đó là CH16 và CH22 để p theo. Trong thí HU58, CH1 và CH9 để thực hiện kỹ enzyme giới hạn ng vi khuẩn 16S rRNA, các hiện rõ hơn qua n mà số bp có thể ải trình tự thì tín n môi nên hai phân đoạn . Trong thực tế, t 100% cho nên sản phẩm cắt
51
enzyme giới hạn thường thu được số phân đoạn (số băng) nhiều hơn so với lý thuyết. Tuy nhiên, điều chúng ta kỳ vọng ở đây là, các chủng khác nhau có thể thu được số băng khác nhau cũng như kích thước của các băng có khác biệt.
Bảng 10. Các phân đoạn thu được khi cắt gen 16S ribosome của các chủng vi khuẩn bằng bộ enzyme Alf II và Alw 26I theo lý thuyết
Chủng vi khuẩn Các phân đoạn thu được
CH16 269 bp, 275 bp, 907 bp CH22 273 bp, 296 bp, 906 bp HU36 243 bp, 275 bp, 664 bp, 235 bp HU58 262 bp, 275 bp, 919bp CH1 485 bp, 691 bp, 271 bp CH9 224 bp, 664 bp, 105 bp
52
A B
Hình 11. Kết quả điện di các phân đoạn gen 16S rDNA sau khi xử lí bằng bộ
enzyme cắt giới hạn. A: Kết quả thực nghiệm. B: kết quả theo tính toán lí thuyết. M: marker 100bp; 1: CH1; 2: CH9; 3: CH16; 4: CH22; 5: HU36;6: HU58
Từ kết quả điện di sản phẩm được thực hiện bởi phản ứng enzyme cắt giới hạn được thể hiện qua Hình 11, ta thấy dùng kỹ thuật PCR-RFLP hoàn toàn có thể phân biệt các chủng vi sinh vật . Các chủng vi khuẩn tham chiếu như CH1, CH9, HU36 và HU58 cho ra các băng có kích thước khác so với các băng thu được từ các
chủng CH16 và CH22 kể cà trên phương diện lý thuyết (Hình 11B) hay trên kết quả thực nghiệm (Hình 11A). Quan sát Hình 11B thấy rằng, theo tính toán lí thuyết thì,
từ các chủng CH9 và HU39 thu được phân đoạn DNA có kích thước 664 bp, trong khi đó, từ CH16 và CH22 lại không thu được băng này. Quan sát kĩ ta thấy có sự khác biệt rất nhỏ giữu CH16 và CH22 kết cả trên phương diện cũng như thực
nghiệm. Hình ảnh thu được từ kết quả điện di trên phương diện thực nghiệm (Hình 11A) sau khi xử lí gen mã hóa 16S rRNA bằng bộ enzyme Alf II và Awl 26I cho
thấy ở CH16 và CH22 thu được số phân đoạn như nhau nhưng vết cắt trên gen lệch khoảng 10 nt giữa hai trình tự gen của hai chủng thí nghiệm (CH16 và CH22). Điều đó chứng minh rằng, bộ enzyme Alf II và Awl 26I là chỉ thị để phân biệt các
53
chủngCH16 và CH22 cũng như các chủng vi khuẩn khác, nó cũng có ý nghĩa rất quan trọng trong việc xác định nguồn gốc phân lập cũng như là công cụ hữu hiệu để xác định nhanh các chủng này ở góc độ thương mại khi chúng được sử dụng làm probiotic mà không cần các kĩ thuật sinh học phân tử phức tạp và mất thời gian như giải trình tự gen và định danh đến mức độ loài loài.