PCR-RFLP là kỹ thuật sinh học phân tử giúp phân biệt nhanh tới mức độ chủng giữa các đối tượng vi sinh vật quan tâm, nhất là các vi khuẩn được dùng làm probiotic do tính hiệu quả của nó. Trong kỹ thuật này, sau khi trình tự gen 16S ribosome của các chủng vi khuẩn được giải, nó được sử dụng để thiết kế bộ
94oC 94oC 56oC 72oC 72oC 4oC 3:00 1:00 0:45 1:30 5:00 ∞ 30 chu kì
40
enzyme giới hạn giúp cắt gen 16S ribosome của các chủng vi khuẩn quan tâm thành các đoạn DNA khác nhau. Dựa vào kết quả điện di sản phẩm cắt enzyme giới hạn để phân biệt giữa các chủng. Với điều kiện phản ứng tối ưu, hiệu suất phản ứng của các enzyme cắt giới hạn là 100%, điều này có nghĩa là sản phẩm điện di sẽ thu được các băng DNA (các đoạn DNA) theo như thiết kế lý thuyết. Tuy nhiên, khi hiệu suất cắt của các enzyme giới hạn không đạt được 100% thì kết quả điện di sản phẩm cắt enzyme giới hạn sẽ thu được số băng nhiều hơn.
Đoạn gen 16S rRNA của các chủng vi khuẩn sau khi giải trình tự được sử dụng để thiết kế bộ enzyme cắt giới hạn nhờ sử dụng phần mềm SnapGene Viewer.
Sản phẩm nhân dòng đoạn gen 16S rRNA bằng kỹ thuật PCR của các chủng vi khuẩn được sử dụng cho phản ứng cắt bằng enzyme giới hạn. Thành phần của phản ứng cắt bằng enzyme giới hạn như sau: Buffer (3 µl), BSA ( 0,3 µl), Alf II ( 1,5 µl), Alw 26I ( 1,5 µl), sản phẩm PCR ( 15 µl) và bổ sung nước tới 30 µl. Hỗn hợp cắt bằng enzyme giới hạn được ủ ở 370C trong thời gian 8-16h. Sản phẩm cắt enzyme giới hạn được điện di trên gel agarose 3,2 % để đánh giá hiệu quả và phân biệt các chủng dựa trên kỹ thuật PCR-RFLP.