Sau đó, chúng tôi thử nghiệm tác dụng của bào tử CH16 và CH22 lên khả năng tăng trọng của gà siêu thịt ở diện rộng, có so sánh với bào tử HU58 và probiotic thương mại BioPlus® YC. Với tỉ lệ phối trộn theo lý thuyết, mật độ bào tử trong thức ăn có thể đạt đến là 3×106. Trên thực tế, 4 loại cám được kiểm tra mật độ bào tử sau khi phối trộn, mật độ bào tử của cả 4 loại chế phẩm/sản phẩm này sau khi trộn với thức ăn đều đạt khoảng 3 × 106 CFU g-1 , chứng tỏ các chủng này đều bền nhiệt. Các sản phẩm được thử nghiệm trên gà siêu thịt theo như mô tả trong phần phương pháp. Kết quả tổng hợp ở Bảng 12 cho thấy nhóm CH16 có kết quả tốt nhất, với trọng lượng đạt 2.70 kg/con và chỉ số tăng trọng hàng ngày (ADG) là 61.14 g/con/ngày. Trong khi đó, nhóm CH22 đạt trọng lượng 2.40 kg/con và ADG là 57.10 g.con. Sự tăng trọng kém hơn ở nhóm CH22 có thể do khả năng tạo biofilm kém của CH22 trên ruột gà. Một điều ngạc nhiên là trọng lượng gà ở nhóm HU58
61
chỉ đạt 2.18 kg/con với chỉ số ADG chỉ là 51.90 g/con/ngày, kém hơn cả nhóm đối chứng âm. So sánh với nhóm ăn sản phẩm thương mại Bioplus YC và nhóm đối chứng âm, nhóm CH16 có chỉ số cao hơn 3,24% và 9,08%. Đối với hiệu quả tiêu thụ thức ăn, nhóm CH16 cho kết quả tốt nhất với chỉ số FCR(Feed conversion ratio) là 1.696 kg thức ăn/kg gà, thấp hơn đáng kể so với các nhóm còn lại(CH22 [1.792], HU58 [1.868], BioPlus YC [1.807] và nhóm đối chứng âm [1.880]). Mặc dù cả
chủng CH16 và HU58 đều tạo biofilm tốt ở điều kiện in vitro,chủng CH16 có
nguồn gốc từ gà nên đã chứng tỏ khả năng tăng trọng ở gà siêu thịt tốt hơn so với chủng HU58.Thêm một thông tin đáng lưu ý nữa là % gà chết ở nhóm thí nghiệm sử dụng CH16 là thấp nhất [4,9%] so với CH22 [5,3%], HU58 [5,1%], Bioplus YC [5,6%] và nhóm đối chứng âm [5,2%]. Kết quả này cho thấy chế phẩm chứa bào tử CH16 có tác dụng trong tăng trọng và giảm tỉ số tiêu thụ thức ăn đối với gà siêu thịt, tuy nhiên, cần phải được xem xét kĩ lưỡng hơn về tính khách quan của nó, đông thời cần lặp lại cũng như tăng quy mô thử nghiệm để củng cố tính bền vững, khách quan của kết quả thu được. Mặt khác, cần xem xét tác động của CH16 đối với các vi sinh vật gây bệnh trong nỗ lực kiểm soát các bệnh dịch ở gia cầm, nhất là trong bối cảnh bệnh dịch rất dễ bùng phát và lan rộng.
Tổng hợp lại, quả thử nghiệm trên gà siêu thịt cho thấy chủng CH16 có tiềm năng ứng dụng làm probiotic cho gà.
62 Tên nhóm (số lượng congà) Thành phần Nồng độ probiotics (CFU g-1) Độ sống của bào tử trong thức ăn (CFU g-1) Trọng lượng trung bình ngày 45 (kg) ADG (Average Daily Gain) (g/con/ngày) FCR (Food conversion ratio) % Ỉa chảy % Chết CH16 (n = 1800) B. subtilis CH16 > 3 × 109 1,0 × 106 2,70 61,14 1,696 0 4,9 CH22 (n = 1150) B. subtilis CH22 > 3 × 109 2,9 × 105 2,40 57,10 1,792 0 5,3 HU58 (n = 1150) B. subtilis HU58 > 3 × 109 9,7 × 105 2,18 51,90 1,868 0 5,1 BioPlus YC (n = 1600) B. subtilis DSM5749 B. licheniformis DSM5750 > 3.2 × 109 1,1 × 106 2,64 59,32 1,807 0 5,6 Đối chứng âm (n = 3200)
Không chứa probiotic ~ 103 2,54 56,05 1,880 0 5,2
63
KẾT LUẬN
1. Chúng tôi đã phân lập được 14 chủng Bacillus không màu có hiệu suất tạo bào tử
cao (> 80%) và đặt tênchủng làCH11, CH12, CH13, CH14, CH15, CH16, CH17, CH18, CH19, CH20, CH21, CH22,CH23 và CH24. Các chủng đều được xác định đặc tính sinh lý sinh hóa, cũng như phân tích trình tự ribosome 16S, chứng tỏ rằng
chúng thuộc loài Bacillus subtilis hoặcBacillus licheniformis.
2. Trong số 14 chủng thì CH16 và CH22 có hoạt tính enzyme amilase, gelatinase aseinase và protease tốt nhất và tạo biofilm nhanh trong thời gian 16 giờ. Bào tử của chúng bền ở nhiệt độ 80oC, pH 2.0, và nồng độ muối cao NaCl 5%.
3. Chủng CH16 và CH22 được tối ưu điệu kiện sinh trưởng ở môi trường TSA, pH 7.5-8.5, nhiệt độ 37°C ở quy mô phòng thí nghiệm để sản xuất trong nồi lên men và sau đó sấy phun. Nồng độ bào tử CH16 và CH22 thu được là >4 x 1011 bào tử/g.
4. Thử nghiệm diện rộng trên gà siêu thịt (n> 1500 con/nhóm), bào tử CH16 ở nồng
độ > 3 x 106 bào tử/g thức ăn có tác dụng tăng rõ rệt trọng lượng hàng ngày của gà Average Daily Gain (ADG)là 9.17% và giảm hệ số tiêu thụ thức ănFeed Conversion Ratio (FCR)xuống 9.79% so với ADG và FCR tiêu chuẩn.
Các công trình khoa học đã công bố có liên quan đến luận văn:
1. Nguyen Van Duc, Tran Thi My, Le Cong Luc, Nguyen Hoa Anh, Phan Tuan Nghia, Nguyen Thi Van Anh (2014) Screening and characterization of non-
pigmented Bacillus strains isolated from chicken gastrointestinal tracts. VNU Journal of Science: Natural Sciences and Technology, 30 (3S), 145-152.
2. Isolation and characterization of Bacillus subtilis CH16 strain from chicken
gastrointestinal tracts for use as a feed supplement to promote weight gain in broilers (2014) Anh Thi Van Nguyen, Duc Van Nguyen, My Thi Tran, Loan Thi
Nguyen, Anh Hoa Nguyen, and Tuan-Nghia Phan. Letters of Applied Microbiology,
64
HƯỚNG NGHIÊN CỨU TIẾP THEO
1. Lặp lại thử nghiệm trên gà siêu thịt ở các đơn vị khác để chứng minh hiệu quả của chế phẩm probiotic CH16.
2. Tìm hiểu cơ chế bào tử nảy mầm, nhân lên và tương tác với ruột gà của chủng CH16.
65
TÀI LIỆU THAM KHẢO
TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT
1. Phan Tuấn Nghĩa (2012), Giáo trình hóa sinh học thực nghiệm, NXB Giáo
Dục Việt Nam.
2. Trần Quốc Việt, Bùi Thị Thu Huyền, Dương Văn Hợp và Vũ Thành Lâm (2009), “Phân lập, tuyển chọn và đánh giá các đặc tính probiotic của một số chủng vi sinh vật hữu ích để sản xuất các chế phẩm probiotic dùng trong chăn
nuôi”, Tạp chí Khoa học Công nghệ Chăn nuôi, 16, tr. 1-12.
TÀI LIỆU TIẾNG ANH
3. Agata Dankowiakowska, Izabela Kozlowska Và Marek Bednarczyk (2013), “Probiotics, prebiotics and synbiotics in Poultry-Mode of action, limitation,
and achievements”, Journal of Central European Agriculture, 14(1), pp. 467-
478.
4. Alex Yeow-Lim Teo and Hai-Meng Tan (2005), “Inhibition of Clostridium
perfringens by a Novel Strain of Bacillussubtilis Isolated from the
Gastrointestinal Tracts of Healthy Chickens”, APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY, 71 (8), pp. 4185–4190.
5. Anita Menconi, Marion J. Morgan, Neil R. Pumford, Billy M. Hargis, and
Guillermo Tellez (2013), “Physiological Properties and Salmonella Growth Inhibition of Probiotic Bacillus Strains Isolated fromEnvironmental and Poultry Sources”, International Journal of Bacteriology, pp. 1-8.
6. Apajalahti, J. H. A., A. Kettunen, M. R. Bedford, and W. E. Holben (2001), “Percent G + C profiling accurately reveals diet-related differences in the
gastrointestinal microbial community of broiler chickens”, Appl. Environ.
Microbiol, 67, pp. 5656–5667.
7. Ashlee M. Earl, Richard Losickand Roberto Kolter (2008), “Ecology and
66
8. Azizpour K., Bahrambeygi S. , Mahmoodpour S. , Azizpour A.
(2009),“History and Basic of Probiotics”, Research Journal of Biological Sciences, 4(4), pp. 409-426.
9. Barnes, E. M. (1979), “The intestinal microflora of poultry and game birds
during life and after storage”, J. Appl. Bacteriol, 46, pp. 407–419.
10. Barnes, E. M., G. C. Mead, D. A. Barnum, and E. G. Harry (1972), “The intestinal flora of the chicken in the period 2 to 6 weeks of age, with
particular reference to the anaerobic bacteria”, Br. Poult. Sci, 13, pp. 311–326.
11. Bergey's Manual of Determinative Bacteriology.
http://www.uiweb.uidaho.edu/micro_biology/250/IDFlowcharts.pdf
12. Boirivant, M., & Strober, W. (2007) “The mechanism of action of probiotics”
Current Opinion in Gastroenterology, 23(6), pp. 679–692.
13. Christensen, H.R.; Frokiaer, H.; Pestka, J.J. 9(2002), “Lactobacilli differentially modulate expression of cytokines and maturation surface
markers in murine dendritic cells”’ J. Immuno.l, 168, pp. 171-178.
14. Chung YW, Choi JH, Oh TY, et al. (2008), “Lactobacillus casei prevents the development of dextran sulphate sodium-induced colitis in Toll-like
receptor 4 mutant mice”, Clin. Exp. Immunol., 151, pp. 182–189.
15. Ciprandi, G., Scordamaglia, A., Venuti, D., Caria, M. and Canonica, G.W. (1986), “In vitro effects of Bacillus subtilis on the immune response”.
Chemioterapia, 5, pp. 404–407.
16. Cutting Simon M. (2011), “Bacillus probiotics”, Food Microbiology, 28, pp.
214-220.
17. D. Stanley, M.S. Geier, R.J. Hughes and R.J. Moore (2012) “ The role of gastrointestineal microbiota in chicken productivity”, Aust. Poult. Sci. Symp., pp. 262-265.
18. Diana C Donohue (2006), “Safety of probiotics”, Asia Pac J Clin Nutr, 15 (4),
67
19. Donnet-Hughes A, Rochat F, Serrant P, Aeschlimann JM, Schiffrin EJ (1999), “Modulation of nonspecific mechanisms of defense by lactic acid bacteria:
Effective dose”, J. Dairy Sci., 82, pp. 863-869.
20. Duc, L.H., Hong, H.A., Barbosa, T.M., Henriques, A.O. and Cutting, S.M. (2004), “Characterization of Bacillus probiotics available for human use”,
Appl. Environ., Microbiol., 70, pp. 2161–2171.
21. Fang, H., Elina, T., Heikki, A., & Seppo, S. (2000), “Modulation of humoral
immune response through probiotic intake”, FEMS Immunology and Medical Microbiology, 29(1), pp. 47–52.
22. FAO/WHO (2001), Report of a Joint FAO/WHO Expert Consultation on Evaluation of Health and Nutritional Properties of Probiotics in Food Including Powder Milk with Live Lactic Acid Bacteria (October 2001).
23. FAO/WHO (2002), Joint FAO/WHO (Food and Agriculture Organization/World Health Organization) working group report on drafting guidelines for the evaluation of probiotics in food, London, Ontario, Canada.
24. FEFANA (2005), Probiotics in animal nutrition.
25. Foligne, B., Dewulf, J., Breton, J., Claisse, O., Lonvaud-Funel, A., & Pot, B. (2010), “Probiotic properties of non-conventional lactic acid bacteria:
Immunomodulation by Oenococcus oeni”, International Journal of Food Microbiology, 140(2–3), pp. 136–145.
26. Fuller R (1989), “Probiotics in man and animals”, J Appl Bacteriol, 66, pp.
365–378.
27. Galdeano, C. M., de Leblanc Ade, M., Carmuega, E., Weill, R., & Perdigon, G. (2009), “Mechanisms involved in the immunostimulation by probiotic
fermented milk”, The Journal of Dairy Research, 76(4), pp. 446–454.
28. GauthierRobert (2007), Organic Acids and Essential Oils, Let’s Not Be Chicken With Antibiotic Growth Promoter Free Poultry!, Poultry Service
68
29. Gill HS, Cross ML, Rutherfurd KJ, Gopal PK (2001), “Dietary probiotic
supplementation to enhance cellular immunity in the elderly”. Br J Biomed Sci, 57(2), pp. 94-96.
30. Gong, J., R. J. Forster, H. Yu, J. R. Chambers, P. M. Sabour, R. Wheatcroft, and S. Chen (2002), “Diversity and phylogenetic analysis of bacteria in the mucosa of chicken ceca and comparison with bacteria in the cecal lumen”,
FEMS Microbiol. Lett., 208, pp. 1–7.
31. Havenaar R, Huis in’t Veld JHJ (1992), Probiotics: A general view. In: Wood BJB: The Lactic Acid Bacteria, Vol. 1: The Lactic Acid Bacteria in Health and
Disease, Chapman & Hall, New York, pp. 209–224.
32. Hong Huynh A.,Khaneja Reena, Tam Nguyen M.K.,Cazzato Alessia, TanSisareuth,Urdaci Maria,Brisson Alain,Gasbarrini Antonio,Barnes Ian,
Cutting Simon M. (2008), “Bacillus subtilis isolated from the human gastrointestinal tract”, Research in Microbiology , 160, pp. 134-143.
33. Huynh A. Hong, Le Hong Duc, Simon M. Cutting (2005), “The use of
bacterial spore formers as probiotics”, FEMS Microbiology Reviews, 29, pp.
813–835
34. Jiangrang Lu, Umelaalim Idris, Barry Harmon, Charles Hofacre, John J. Maurer and Margie D. Lee (2003), “Diversity and Succession of the
Intestinal Bacterial Community of the Maturing Broiler Chicken”, APPLIED
AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY, 69 (11), p p. 6816–6824.
35. Jobin, C. (2010) “Probiotics and ileitis: Could augmentation of
TNF/NFkappaB activity be the answer?” Gut Microbes, 1 (3), pp. 196–199.
36. Kabir S. M. Lutful (2009), “The Role of Probiotics in the Poultry Industry”,
Int. J. Mol. Sc., 10, pp. 3531-3546.
37. Kabir, S.M.L., Rahman, M.M., Rahman, M.B., Rahman, M.M., Ahmed, S.U. (2004), “The dynamics of probiotics on growth performance and immune
69
38. Kelly D, Campbell JI, King TP, et al. (2004), “Commensal anaerobic gut bacteria attenuate inflammation by regulating nuclear-cytoplasmic
shuttling of PPAR-gamma and RelA”, Nat. Immunol., 5, pp. 104–112.
39. KyungWoo Lee, Soo Kee Lee and Bong Duk Lee (2006), “Aspergillus oryzae as Probiotic in Poultry - A Review”, International Journal of Poultry Science,
5 (1), pp. 01-03.
40. Lilly DM, Stillwell RH (1965), PProbiotics: Growth promoting factors
produced by microorganisms”, Science, 147, pp. 747-748.
41. Linge P. (2005), “The use of probioticsand yeast derivatives in India”, World Poultry, 21 (10), pp. 12-15.
42. Maassen, C.B., van Holten-Neelen, C., Balk, F., den Bak-Glashouwer, M.J., Leer, R.J., Laman, J.D., Boersma, W.J., Claassen, E. (2000), “Strain dependent induction of cytokine profiles in the gut by orally administered
Lactobacillus strains”, Vaccine, 18, pp. 2613-2623.
43. Martin Král, Mária Angelovičová, Ľubica Mrázová (2012), “Application of Probiotics in Poultry Production”, Papers: Animal Science and Biotechnologies, 45 (1), pp. 55-57.
44. Mead, G. C. (1989), “Microbes of the avian cecum: types present and
substrates utilized”, J. Exp. Zool, 3(Suppl.), pp. 48–54.
45. Mead, G. C. (2000), “Prospects for competitive exclusion treatment to control
salmonellas and other foodborne pathogens in poultry”, Vet. J.,159, pp. 111–
123.
46. Micheal Brown (2011), “ Modes of Action of Probiotics: Recent
Developments”, Journal of Animal and Veterinary Advances, 10(14), pp.
1859-1900.
47. Musa H. H.,Wu S.L., Wu C.H., SeriH. I. and Seri G. Q. (2009), “The Potential
Benefits of Probiotics in Amnimal Production and Health”, Journal of Animal and Veterinary Advances, 8 (2), pp. 313-321.
70
48. National Committee for Clinical Laboratory Standards (1997), Performance standards for antimicrobial disk susceptibility tests. Approved standard M2- A6, National Committee for Clinical Laboratory Standards, Wayne, Pa.
49. Neish AS, Gewirtz AT, Zeng H, et al. (2000), “Prokaryotic regulation of
epithelial responses by inhibition of IkappaB-alpha ubiquitination”, Science,
289, pp. 1560–1563.
50. Netherwood, T.,Gilbert H. J.,Parker D. S., andO’Donnell A. G. (1999), “Probiotics shown to change bacterial community structure in the avian
gastrointestinal tract”, Appl. Environ. Microbiol, 65, pp. 5134–5138.
51. Neungnut Chaiyawan, Punnathorn Taveeteptaikul, Bhusita Wannissorn,Supatjaree Ruengsomwong, Prapaipat Klungsupya, Wannaluk Buaban,Pariyaporn Itsaranuwat (2010), Characterization and Probiotic
Properties of Bacillus StrainsIsolated from Broiler”, Thai J. Vet. Med., 40 (2), pp. 207-214.
52. NgS.C., HartA.L.,Kamm M.A.,Stagg A.J., and Knight S.C. (2009)
“Mechanisms of Action of Probiotics: Recent Advances”, Inflamm Bowel Dis.,
15(2), pp. 300–310.
53. Nicholson, W.L., Setlow, P. (1990), “Sporulation, germination and
outgrowth”, In C.R. Harwood, & S.M. Cutting (Eds.), Molecular Biological Methods for Bacillus, Chichester, UK: John Wiley & Sons Ltd., pp. 391-450
54. PattersonJ. A. andBurkholder K. M. (2003), “Application of Prebiotics and
Probiotics in Poultry Production”, Poultry Science, 82, pp. 627–631.
55. Rakoff-Nahoum S, Paglino J, Eslami-Varzaneh F, et al. (2004), “Recognition of commensal microflora by toll-like receptors is required for intestinal
homeostasis”, Cell, pp. 229–241.
56. Rantala, M., Nurmi, E. (1973), “Prevention of the growth of Salmonella infantis in chickens by flora of the alimentary tract of chickens”, Br. Poult. Sci., 14, pp. 627-630.
71
57. Ricardo Vianna Nunes, Carina Scherer, Paulo Cesar Pozza, Cinthia Eyng, Luís DanielGiusti Bruno, Flávio Medeiros Vieites (2012), “Use of probiotics to
replace antibiotics for broilers”, Revista Brasileira de Zootecnia, 41(10), pp.
2219-2224.
58. Richard A. Bailey (2010), Intestinal microbiota and the pathogenesis of dysbacteriosis in broiler chickens, A thesis submitted to the University of East
Anglia for the degree of Doctor of Philosophy, Institute of Food Research, Norwich Research Park, United Kingdom.
59. Romanin, D., Serradell, M., Gonzalez Maciel, D., Lausada, N., Garrote, G. L., & Rumbo, M. (2010). “Down-regulation of intestinal epithelial innate
response by probiotic yeasts isolated from kefir”, International Journal of Food Microbiology, 140(2–3), pp. 102–108.
60. Sanders Mary Ellen (2008), “Probiotics: Definition, Sources, Selection, and
Uses”, Clinical Infectious Diseases, 46, pp. S58-61.
61. Sanders Mary Ellen (2010), History of Probiotics, Regulationof of Probiotics
meeting Probiotics meeting, University of Maryland.
62. Sartor, R.B. (1996) “Cytokine regulation of experimental intestinal inflammation in genetically engineered and T-lymphocyte reconstituted
rodents”, Aliment,Pharmacol, Therap, 10, pp. 36–42.
63. Stephen T. Cartman, Roberto M. La Ragione, and Martin J. Woodward
(2008), “Bacillus subtilis Spores Germinate in the Chicken Gastrointestinal Tract”, APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY, 74 (16), pp.
5254–5258.
64. Tellez G, Rodríguez-Fragoso L, Kuttappan VA, Kallapura G, Velasco XH, Menconi A, Latorre JD, Wolfenden AD, Hargis BM and Reyes-Esparza J (2013), “Probiotics for Human and Poultry Use in the Control
of Gastrointestinal Disease: A Review of Real-World Experiences”, Altern Integ Med, 2, pp. 1-6.
72
65. Tellez G., Pixley C., WolfendenR.E.,Layton S.L., Layton B.M. (2012),
“Probiotics/direct fed microbials for Salmonella control in poultry”,Food Research International, 45, pp. 628–633.
66. Teresa M. Barbosa, Cláudia R. Serra, Roberto M. La Ragione, Martin J.
Woodward and Adriano O. Henrique (2005), “Screening for Bacillus Isolates in the Broiler Gastrointestinal Tract”, APPLIED AND ENVIRONMENTAL
MICROBIOLOGY, 71 (2), pp. 968–978.
67. Vanbelle M. (1999), The use of feed additives in the E.U. Regulations, problems and future, Eastern Nutrition Conference, Animal Nutrition
Association of Canada, Niagara Falls, Ontario.
68. Wolfenden R.E., Pumford N.R.,Morgan M.J.,Shivaramaiah S., WolfendenA.D.,Tellez G. andHargis B.M. (2010), “Evaluation of a Screening and Selection Method for Bacillus Isolates for Use as Effective Direct-fed
Microbials in Commercial Poultry”, International Journal of Poultry Science, 9 (4), pp. 317-323.
69. World Gastroenterology Organisation (2008), Probiotics and prebiotics,
World Gastroenterology Organisation Practice Guideline.
70. Zhu, X. Y., T. Zhong, Y. Pandya, and R. D. Joerger (2002), “16S rRNA-based