pH trong dạ dày gia cầm khoảng 2,5-3,5 và thức ăn lưu trữ ở đó khoảng 90 phút kể từ khi đi vào cho tới khi xuống tá tràng sau đó được tiêu hóa gần như hoàn toàn và di chuyển tới hỗn tràng, nơi mà vi sinh vật có thể sinh trưởng (Vabelle M. 1999). Với khoảng thời gian 2h thí nghiệm, các vi sinh vật dưới dạng bào tử được ngâm trong các dung dịch pH để đánh giá độ bền của bào tử. Nếu bào tử chịu được pH dạ dày, chúng có nhiều cơ hội để di chuyển tới hỗn tràng, nảy mầm, sinh trưởng ở đó- nơi giàu chất dinh dưỡng. Với ý định đánh giá độ bền của bào tử CH16 và
CH22 trong các môi trường có pH khác khau như là một thử nghiệm in vitro cho độ
bền của bào tử trong môi các mô trường có pH thay đổi nhằm mục tiêu bổ sung cho bằng chứng của probiotic ưu việt như đã giới thiệu ở phần tổng quan tai liệu.Các
thông số được thể hiện qua Hình 13. Trong thí nghiệm này, mật độ bào tử của các
chủng vi khuẩn ở thời điểm bắt đầu thí nghiệm là 108bào tử/ml. Thực tế thí nghiệm cho thấy, mật độ bào tử sau 2h thí nghiệm ở pH 2 đối với hai chủng CH16 và CH22 đều lớn hơn 107bào tử/ml, cụ thể mật độ của CH16 là 5,1×107 bào tử/ml và CH22 là 3,6×107 bào tử/ml. Điều này chứng tỏ bào tử vi khuẩn sẽ vượt qua dạ dày với một số lượng lớn hơn 107bào tử/ml để đến hỗn tràng nơi giàu chất dinh dưỡng cho sinh sôi nảy nở. Một kết quả đáng khích lệ là ở bào tử có độ bền cao ở pH 6 và cũng chỉ giảm đôi chút ở pH 8. Điều này có ý nghĩa quan trọng đối việc sinh trưởng của probiotic trong hỗn tràng cũng như manh tràng, nơi có pH từ 6,0 đến 8,0 để chúng tăng về số lượng nhằm tạo ra hiệu quả có lợi cho vật chủ.
Hình 13. Độ bền của bào t
3.5.4. Độ bền của b
Để có cơ hội nảy m chịu được pH thấp ở dạ nồng độ muối cao trong ru (Simon and Versteeg 1989 in hoàn toàn phản ánh được đ mật độ bào tử lúc khởi đầ
ở các nồng độ muối khác nhau phương pháp pha loãng theo dãy (5%), số lượng tế bào sống c đối chứng (ngâm vi khuẩ Kết quả này cung cấp thêm b thể tồn tại bền vững cho t nghiệm. 1.E+00 1.E+01 1.E+02 1.E+03 1.E+04 1.E+05 1.E+06 1.E+07 1.E+08 1.E+09 2 4 Mật độ bào tử (bào tử/ml) 57
ào tử của chủng CH16 và CH22 trong khoảng pH t
ủa bào tử trong dung dịch muối
y mầm và sinh trưởng ở hỗn tràng thì bào tử ạ dày nó còn phải có khả năng chịu được s i cao trong ruột non. Thức ăn tồn tại trong ruột non là kho
(Simon and Versteeg 1989 in Vanbelle M.), với khoảng thời gian 2h thí nghi c độ bền muối của bào tử vi khuẩn. Trong thí nghi ầu thí nghiệm là 108 bào tử/ml. Số lượng bào t i khác nhau sau khoảng thời gian thí nghiệm đư
ãng theo dãy. Kết quả ở Hình 14 cho thấy ở nồng đ
ng của các chủng CH16 và CH22 không giả
ẩn trong nước RO). Sau khoảng thời gian 2h thí nghi p thêm bằng chứng rằng bào tử của các chủng này hoàn toàn có ng cho tới khi di chuyển tới hỗn tràng của đố
6 8 10 ĐC Mật độ bào tử (bào tử/ml) pH ng pH từ 2 đến 10 ngoài khả năng c sự tác động của t non là khoảng 5-8 phút i gian 2h thí nghiệm n. Trong thí nghiệm này, bào tử còn tồn tại được đếm bằng ng độ muối cao ảm nhiều so với i gian 2h thí nghiệm, . ng này hoàn toàn có ối tượng gà thí
CH16 CH22
Hình 14. Độ bền của bào t
3.5.5. Khả năng tạo biofilm
Tạo biofilm làm tăng tính bám c thời tăng khả năng chống ch
làm tăng tính đối kháng v mọc được trong môi trườ
hiếu khí/yếm khí. Do đó chúng tôi đ
biofilm trong điều kiện in vitro
tranh với các vi khuẩn gây b PY79 và HU58 được sử đã được công bố bởi Hong cấy 1 khuẩn lạc ở trung tâm đ kín đĩa tạo thành một lớ
Ngược lại, chủng PY79 và CH22 ch dày. Số liệu chỉ ra rằng CH16 có kh 1.E+00 1.E+01 1.E+02 1.E+03 1.E+04 1.E+05 1.E+06 1.E+07 1.E+08 1.E+09 1.E+10 1% Mật độ bảo tử (bào tử/ml) 58 a bào tử của chủng CH16 và CH22 ởcác nồng đ
ả năng tạo biofilm
o biofilm làm tăng tính bám của vi khuẩn trên bề mặt niêm m ng chịu với các điều kiện bất lợi của ngoại c
i kháng với các vi khuẩn có hại cho vật nuôi.Chủng CH16 không ờng yếm khí còn chủng CH22 mọc trong c
m khí. Do đó chúng tôi đã lựa chọn 2 chủng để phân tích kh
in vitro, bởi khả năng tạo bioflim tốt sẽ giúp cho ch
n gây bệnh trong đường ruột. Trong thí nghiệ dụng làm đối chứng âm và dương do tính ch
Hong et al., (2008). Kết quả thể hiện ở Hình 15
trung tâm đĩa thạch CMK, chủng vi khuẩn CH16 hay HU58 m ớp mỏng trên bề mặt đĩa ở cả 2 điều kiện 37
ng PY79 và CH22 chỉ mọc thành một khuẩn lạc lớn hơn và ng CH16 có khả năng tạo biofilm ở thân nhiệt củ
2% 3% 4% 5% ĐC Mật độ bảo tử (bào tử/ml) ng độ muối t niêm mạc ruột đồng i cảnh cũng như ng CH16 không c trong cả hai điều kiện phân tích khả năng tạo giúp cho chủng cạnh ệm ngày, chủng ng âm và dương do tính chất tạo biofilm
Hình 15 cho thấy khi
n CH16 hay HU58 mọc n 37oC và 42oC. n hơn và có bề mặt ủa gà. CH16 CH22
59
Hình 15: Biofilm tạo thành trên đĩa thạch CMK của các chủng HU58 và CH16, và khuẩn lạc tạo thành trên đĩa thạch của các chủng PY79 và CH22 ở điều kiện 37°C (ảnh hàng trên) và 42°C (ảnh hàng dưới).
3.6. Điều kiện sinh trưởng tối ưu và chế phẩm probiotic dạng bột chứa bào tử
Trong quá trình thí nghiệm, việc tối ưu các điều kiện sinh trưởng của các chủng vi khuẩn là cần thiết. Các chủng vi khuẩn được nuôi trong các môi trường LB, TSA và DSM, pH từ 6,0 đến 10,0 ở nhiệt độ từ 300C đến 420C. Kết quả cho thấy, các chủng đều sinh trưởng mạnh nhất ở môi trường TSA, pH từ 7,5 đến 8,5 và nhiệt độ tối ưu cho sinh trưởng là 370C.
Dựa trên các tính chất khác biệt về tốc độ sinh trưởng, khả năng sinh các enzyme ngoại bào có lợi cũng như một số tính chất probiotic của 2 chủng CH16 và CH22, chúng tôi quyết định lựa chọn 2 chủng này cho nghiên cứu thử nghiệm trên diện rộng khả năng tăng trọng và tăng sức khỏe của gà siêu thịt. Hai chủng này được làm giống để lên men sản xuất bào tử và sấy phun để tạo dạng bột bổ sung vào thức ăn cho gà siêu thịt. Mật độ bào tử thu được sau sấy phun là 4.9 × 1011 bào tử/gvới chủng CH16 và 3.8 × 1011bào tử/g với chủng CH22 (Hình 16B). Chúng tôi
đã xác nhận lại hình thái của khuẩn lạc và tỷ lệ bào tử tinh khiết là gần như 100% ở cả 2 dạng bột bào tử.
60
Hình 16: Ảnh chụp chế phẩm chứa bào tử dạng bột (A), ảnh bào tử dưới kính hiển vi quang học (B) và ảnh khuẩn lạc mọc trên đĩa thạch (C) của 2 chủng CH16 và CH22
3.7. Tăng trọng trên gà siêu thịt và giảm chỉ số tiêu thụ thức ăn
Sau đó, chúng tôi thử nghiệm tác dụng của bào tử CH16 và CH22 lên khả năng tăng trọng của gà siêu thịt ở diện rộng, có so sánh với bào tử HU58 và probiotic thương mại BioPlus® YC. Với tỉ lệ phối trộn theo lý thuyết, mật độ bào tử trong thức ăn có thể đạt đến là 3×106. Trên thực tế, 4 loại cám được kiểm tra mật độ bào tử sau khi phối trộn, mật độ bào tử của cả 4 loại chế phẩm/sản phẩm này sau khi trộn với thức ăn đều đạt khoảng 3 × 106 CFU g-1 , chứng tỏ các chủng này đều bền nhiệt. Các sản phẩm được thử nghiệm trên gà siêu thịt theo như mô tả trong phần phương pháp. Kết quả tổng hợp ở Bảng 12 cho thấy nhóm CH16 có kết quả tốt nhất, với trọng lượng đạt 2.70 kg/con và chỉ số tăng trọng hàng ngày (ADG) là 61.14 g/con/ngày. Trong khi đó, nhóm CH22 đạt trọng lượng 2.40 kg/con và ADG là 57.10 g.con. Sự tăng trọng kém hơn ở nhóm CH22 có thể do khả năng tạo biofilm kém của CH22 trên ruột gà. Một điều ngạc nhiên là trọng lượng gà ở nhóm HU58
61
chỉ đạt 2.18 kg/con với chỉ số ADG chỉ là 51.90 g/con/ngày, kém hơn cả nhóm đối chứng âm. So sánh với nhóm ăn sản phẩm thương mại Bioplus YC và nhóm đối chứng âm, nhóm CH16 có chỉ số cao hơn 3,24% và 9,08%. Đối với hiệu quả tiêu thụ thức ăn, nhóm CH16 cho kết quả tốt nhất với chỉ số FCR(Feed conversion ratio) là 1.696 kg thức ăn/kg gà, thấp hơn đáng kể so với các nhóm còn lại(CH22 [1.792], HU58 [1.868], BioPlus YC [1.807] và nhóm đối chứng âm [1.880]). Mặc dù cả
chủng CH16 và HU58 đều tạo biofilm tốt ở điều kiện in vitro,chủng CH16 có
nguồn gốc từ gà nên đã chứng tỏ khả năng tăng trọng ở gà siêu thịt tốt hơn so với chủng HU58.Thêm một thông tin đáng lưu ý nữa là % gà chết ở nhóm thí nghiệm sử dụng CH16 là thấp nhất [4,9%] so với CH22 [5,3%], HU58 [5,1%], Bioplus YC [5,6%] và nhóm đối chứng âm [5,2%]. Kết quả này cho thấy chế phẩm chứa bào tử CH16 có tác dụng trong tăng trọng và giảm tỉ số tiêu thụ thức ăn đối với gà siêu thịt, tuy nhiên, cần phải được xem xét kĩ lưỡng hơn về tính khách quan của nó, đông thời cần lặp lại cũng như tăng quy mô thử nghiệm để củng cố tính bền vững, khách quan của kết quả thu được. Mặt khác, cần xem xét tác động của CH16 đối với các vi sinh vật gây bệnh trong nỗ lực kiểm soát các bệnh dịch ở gia cầm, nhất là trong bối cảnh bệnh dịch rất dễ bùng phát và lan rộng.
Tổng hợp lại, quả thử nghiệm trên gà siêu thịt cho thấy chủng CH16 có tiềm năng ứng dụng làm probiotic cho gà.
62 Tên nhóm (số lượng congà) Thành phần Nồng độ probiotics (CFU g-1) Độ sống của bào tử trong thức ăn (CFU g-1) Trọng lượng trung bình ngày 45 (kg) ADG (Average Daily Gain) (g/con/ngày) FCR (Food conversion ratio) % Ỉa chảy % Chết CH16 (n = 1800) B. subtilis CH16 > 3 × 109 1,0 × 106 2,70 61,14 1,696 0 4,9 CH22 (n = 1150) B. subtilis CH22 > 3 × 109 2,9 × 105 2,40 57,10 1,792 0 5,3 HU58 (n = 1150) B. subtilis HU58 > 3 × 109 9,7 × 105 2,18 51,90 1,868 0 5,1 BioPlus YC (n = 1600) B. subtilis DSM5749 B. licheniformis DSM5750 > 3.2 × 109 1,1 × 106 2,64 59,32 1,807 0 5,6 Đối chứng âm (n = 3200)
Không chứa probiotic ~ 103 2,54 56,05 1,880 0 5,2
63
KẾT LUẬN
1. Chúng tôi đã phân lập được 14 chủng Bacillus không màu có hiệu suất tạo bào tử
cao (> 80%) và đặt tênchủng làCH11, CH12, CH13, CH14, CH15, CH16, CH17, CH18, CH19, CH20, CH21, CH22,CH23 và CH24. Các chủng đều được xác định đặc tính sinh lý sinh hóa, cũng như phân tích trình tự ribosome 16S, chứng tỏ rằng
chúng thuộc loài Bacillus subtilis hoặcBacillus licheniformis.
2. Trong số 14 chủng thì CH16 và CH22 có hoạt tính enzyme amilase, gelatinase aseinase và protease tốt nhất và tạo biofilm nhanh trong thời gian 16 giờ. Bào tử của chúng bền ở nhiệt độ 80oC, pH 2.0, và nồng độ muối cao NaCl 5%.
3. Chủng CH16 và CH22 được tối ưu điệu kiện sinh trưởng ở môi trường TSA, pH 7.5-8.5, nhiệt độ 37°C ở quy mô phòng thí nghiệm để sản xuất trong nồi lên men và sau đó sấy phun. Nồng độ bào tử CH16 và CH22 thu được là >4 x 1011 bào tử/g.
4. Thử nghiệm diện rộng trên gà siêu thịt (n> 1500 con/nhóm), bào tử CH16 ở nồng
độ > 3 x 106 bào tử/g thức ăn có tác dụng tăng rõ rệt trọng lượng hàng ngày của gà Average Daily Gain (ADG)là 9.17% và giảm hệ số tiêu thụ thức ănFeed Conversion Ratio (FCR)xuống 9.79% so với ADG và FCR tiêu chuẩn.
Các công trình khoa học đã công bố có liên quan đến luận văn:
1. Nguyen Van Duc, Tran Thi My, Le Cong Luc, Nguyen Hoa Anh, Phan Tuan Nghia, Nguyen Thi Van Anh (2014) Screening and characterization of non-
pigmented Bacillus strains isolated from chicken gastrointestinal tracts. VNU Journal of Science: Natural Sciences and Technology, 30 (3S), 145-152.
2. Isolation and characterization of Bacillus subtilis CH16 strain from chicken
gastrointestinal tracts for use as a feed supplement to promote weight gain in broilers (2014) Anh Thi Van Nguyen, Duc Van Nguyen, My Thi Tran, Loan Thi
Nguyen, Anh Hoa Nguyen, and Tuan-Nghia Phan. Letters of Applied Microbiology,
64
HƯỚNG NGHIÊN CỨU TIẾP THEO
1. Lặp lại thử nghiệm trên gà siêu thịt ở các đơn vị khác để chứng minh hiệu quả của chế phẩm probiotic CH16.
2. Tìm hiểu cơ chế bào tử nảy mầm, nhân lên và tương tác với ruột gà của chủng CH16.
65
TÀI LIỆU THAM KHẢO
TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT
1. Phan Tuấn Nghĩa (2012), Giáo trình hóa sinh học thực nghiệm, NXB Giáo
Dục Việt Nam.
2. Trần Quốc Việt, Bùi Thị Thu Huyền, Dương Văn Hợp và Vũ Thành Lâm (2009), “Phân lập, tuyển chọn và đánh giá các đặc tính probiotic của một số chủng vi sinh vật hữu ích để sản xuất các chế phẩm probiotic dùng trong chăn
nuôi”, Tạp chí Khoa học Công nghệ Chăn nuôi, 16, tr. 1-12.
TÀI LIỆU TIẾNG ANH
3. Agata Dankowiakowska, Izabela Kozlowska Và Marek Bednarczyk (2013), “Probiotics, prebiotics and synbiotics in Poultry-Mode of action, limitation,
and achievements”, Journal of Central European Agriculture, 14(1), pp. 467-
478.
4. Alex Yeow-Lim Teo and Hai-Meng Tan (2005), “Inhibition of Clostridium
perfringens by a Novel Strain of Bacillussubtilis Isolated from the
Gastrointestinal Tracts of Healthy Chickens”, APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY, 71 (8), pp. 4185–4190.
5. Anita Menconi, Marion J. Morgan, Neil R. Pumford, Billy M. Hargis, and
Guillermo Tellez (2013), “Physiological Properties and Salmonella Growth Inhibition of Probiotic Bacillus Strains Isolated fromEnvironmental and Poultry Sources”, International Journal of Bacteriology, pp. 1-8.
6. Apajalahti, J. H. A., A. Kettunen, M. R. Bedford, and W. E. Holben (2001), “Percent G + C profiling accurately reveals diet-related differences in the
gastrointestinal microbial community of broiler chickens”, Appl. Environ.
Microbiol, 67, pp. 5656–5667.
7. Ashlee M. Earl, Richard Losickand Roberto Kolter (2008), “Ecology and
66
8. Azizpour K., Bahrambeygi S. , Mahmoodpour S. , Azizpour A.
(2009),“History and Basic of Probiotics”, Research Journal of Biological Sciences, 4(4), pp. 409-426.
9. Barnes, E. M. (1979), “The intestinal microflora of poultry and game birds
during life and after storage”, J. Appl. Bacteriol, 46, pp. 407–419.
10. Barnes, E. M., G. C. Mead, D. A. Barnum, and E. G. Harry (1972), “The intestinal flora of the chicken in the period 2 to 6 weeks of age, with
particular reference to the anaerobic bacteria”, Br. Poult. Sci, 13, pp. 311–326.
11. Bergey's Manual of Determinative Bacteriology.
http://www.uiweb.uidaho.edu/micro_biology/250/IDFlowcharts.pdf
12. Boirivant, M., & Strober, W. (2007) “The mechanism of action of probiotics”
Current Opinion in Gastroenterology, 23(6), pp. 679–692.
13. Christensen, H.R.; Frokiaer, H.; Pestka, J.J. 9(2002), “Lactobacilli differentially modulate expression of cytokines and maturation surface
markers in murine dendritic cells”’ J. Immuno.l, 168, pp. 171-178.
14. Chung YW, Choi JH, Oh TY, et al. (2008), “Lactobacillus casei prevents the development of dextran sulphate sodium-induced colitis in Toll-like
receptor 4 mutant mice”, Clin. Exp. Immunol., 151, pp. 182–189.
15. Ciprandi, G., Scordamaglia, A., Venuti, D., Caria, M. and Canonica, G.W. (1986), “In vitro effects of Bacillus subtilis on the immune response”.
Chemioterapia, 5, pp. 404–407.
16. Cutting Simon M. (2011), “Bacillus probiotics”, Food Microbiology, 28, pp.
214-220.
17. D. Stanley, M.S. Geier, R.J. Hughes and R.J. Moore (2012) “ The role of gastrointestineal microbiota in chicken productivity”, Aust. Poult. Sci. Symp., pp. 262-265.
18. Diana C Donohue (2006), “Safety of probiotics”, Asia Pac J Clin Nutr, 15 (4),
67
19. Donnet-Hughes A, Rochat F, Serrant P, Aeschlimann JM, Schiffrin EJ (1999), “Modulation of nonspecific mechanisms of defense by lactic acid bacteria:
Effective dose”, J. Dairy Sci., 82, pp. 863-869.
20. Duc, L.H., Hong, H.A., Barbosa, T.M., Henriques, A.O. and Cutting, S.M. (2004), “Characterization of Bacillus probiotics available for human use”,
Appl. Environ., Microbiol., 70, pp. 2161–2171.
21. Fang, H., Elina, T., Heikki, A., & Seppo, S. (2000), “Modulation of humoral
immune response through probiotic intake”, FEMS Immunology and Medical Microbiology, 29(1), pp. 47–52.
22. FAO/WHO (2001), Report of a Joint FAO/WHO Expert Consultation on Evaluation of Health and Nutritional Properties of Probiotics in Food