Thông qua quá trình đánh giá các tính chất sinh hóa, chúng tôi đã loại bỏ thêm 04 chủng do chúng biểu hiện yếu các hoạt tính có lợi như tốc độ sinh trưởng, khả năng tiết các enzyme ngoại bào. Kết quả còm lại 8 chủng được nuôi cấy trên môi trường LB, thu tế bào từ khuẩn lạc mọc riêng rẽ để tách genome.Sau khi tách và tinh sạchgenome, DNA genome của các chủng vi khuẩn được dùng làm khuôn để nhân bản đoạn gen mã hóa 16S rRNA nhờ sử dụng cặp mồi đặc hiệu 27F và 1527R. Sau khi kiểm tra kết quả PCR bằng điện di sản phẩm PCR trên gel agarose, sản phẩm PCR được giải trình tự gen 16S ribosome. Kết quả giải trình tự gen mã hóa 16S rRNA được phân tích và so so sánh với các trình tự tương đồng trên GenBank (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) để định danh ở mức độ loài. Kết
quả BLAST các chủng Bacillus được hiển thị trong Bảng 9.Hình 8 dưới đây là kết
quả điện di genome và điện di sản phẩm PCR của một số chủng đại diện từ 8 chủng vi khuẩn được tách genome và tiến hành PCR.
A
B
B
Hình 8. Kết quả điện di genome (A) và điện di sản phẩm nhân bản gen mã hóa 16S rRNA bằng kĩ thuật PCR (B)
M: Marker (1kb); (+): Đối chứng dương; (-): Đối chứng âm 1: CH16; 2: CH19; 3: CH22; 4: CH24 200 500 1000 2000 M + - 1 2 3 4 200 500 1000 2000 10000 M 1 2 3 4
48
Bảng 9. Kết quả định danh đến mức độ loài bằng kỹ thuật sinh học phân tử
Chủng vi khuẩn Thuộc loài Mã số lưu trữ trên GenBank
So sánh với chủng vi khuẩn trên ngân hàng dữ liệu gen ncbi
Chủng gần nhất Tỉ lệ tương
đồng
CH11 Bacillus subtilis KM492820 Bacillus subtilis 55N1-4 99% CH12 Bacillus subtilis KM492821 Bacillus subtilis CICC 10366 100% CH13 Bacillus subtilis KM492822 Bacillus subtilis 55N1-4 99% CH14 Bacillus subtilis KM492823 Bacillus subtilis 55N1-4 99% CH15 Bacillus subtilis KM492824 Bacillus subtilis 55N1-4 99% CH16 Bacillus subtilis KM492825 Bacillus subtilis 55N1-4 99% CH22 Bacillus licheniformis KM492826 Bacillus licheniformis HT-43 100% CH24 Bacillus licheniformis KM516786 Bacillus
licheniformis CCMMB907 99%
Khi so sánh với các trình tự tương đồng trên GenBank, chủng vi khuẩn phân lập có hệ số tương đồng caoso với chủng tham chiếu, đó là cơ sở để định danh đến mức độ loài. Kết quả định danh này cho thấy tính chính xác và mối quan hệ lôgic giữa định danh dựa trên khóa phân loại của Bergey và định danh bằng phân tích trình tự gen 16S DNA. Từ đó, có thể khẳng định một cách chắc chắn rằng những kết quả xác định tính chất sinh lí sinh hóa là hoàn toàn khách quan và chính
xác.Thông qua kết quả định danh cho thấy, các chủng Bacillus không sắc tố đều thuộc loài Bacillus subtilis hoặc Bacillus licheniformis. Theo như kết của nghiên cứu của tác giả Jiangrang và cộng sự (2003), vi khuẩn Bacillus trong ống tiếu hóa
chiếm tỉ lệ rất nhỏ (0,67 % trong hồi tràng và 1,45 % trong manh tràng) đã làm cho
hy vọng phân lập được các chủng Bacillus có các hoạt tính có lợi là là rất mong
manh. Tuy nhiên, với cách phân lập chính xác và tỉ mỉ, chúng tôi đã phân lập được 14 chủng, sau đó, sàng lọc và định danh được 8 chủng thể hiện các hoạt tính có lợi mạnh hơn.
Để xây dựng cây phát sinh ch BioEdit và MEGA. Mối quan h
trong Hình 9 dưới đây. V
đánh giá các tính chất có l FAO/WHO.
Hình 9. S
49
ng cây phát sinh chủng loại chúng tôi sử dụng các ph i quan hệ chủng loại giữa các chủng vi khuẩn đư
i đây. Với kết quả phân loại này, các chủng Bacillus
t có lợi cũng như các tính chất probiotic theo tiêu chu
Hình 9. Sơ đồ cây phân loại các chủng vi khuẩn
ng các phần mềm n được thể hiện
Bacillus được tiếp tục
3.4. Phân biệt các chViệc phân biệt đến m