2.2.2.1. Thủy phân tinh bột
Chuẩn bị môi trường LB 0,2% tinh bột. Sau khi khử trùng, môi trường được đổ ra đĩa Pêtri. Cấy riêng rẽ các chủng tạo thành từng vạch lên đĩa thạch, ghi kí hiệu. Ủ vi khuẩn trong tủ 370C qua đêm sau đó nhuộm bằng lugol trong khoảng 60 giây, tiếp tục tráng qua bằng nước RO. Nếu tinh bột bị phân giải, I2 trong thuốc thử sẽ không bắt màu nên khu vực đó sẽ có màu sáng và ngược lại, vùng tinh bột không bị phân giải sẽ cho màu tối. So sánh độ lớn của vùng màu sáng với kích thước khuẩn lạc ta biết được mức độ sinh enzyme amylase thủy phân tinh bột khác nhau giữa các chủng.
2.2.2.2. Thủy phân casein
Các chủng vi khuẩn được chấm riêng rẽ trên môi trường LB chứa 1% sữa gầy. Đĩa vi khuẩn được ủ ở 300C từ 3 đến 4 ngày. Vòng trong suốt hình thành quanh khuẩn lạc đánh giá khả năng phân giải casein của các chủng vi khuẩn. Protease được sinh ra sẽ thủy phân casein thành các đoạn peptide ngắn hơn, các amino acid, do đó vùng casein xung quanh khuẩn lạc bị protease phân giải sẽ trở nên trong suốt, không còn màu trắng sữa và ngược lại, vùng casein không bị phân giải sẽ giữ màu trắng sữa ban đầu. So sánh tỉ lệ đường kính vòng thạch trong với đường kính khuẩn lạc ta biết được mức độ sinh enzyme protease phân giải casein khác nhau giữa các chủng.
2.2.2.3. Tan huyết
Các chủng vi khuẩn được chấm riêng rẽ trên môi trường thạch máu cừu và ủ ở 370C qua đêm. Bacillus cereus được chọn làm đối chứng dương, Bacillus subtilis
PY79 là đối chứng âm. Vi khuẩn có khả năng phân giải máu là do chúng sinh enzyme haemolysin phá hủy lớp phospholipid màng tế bào hồng cầu. Máu cừu được chọn làm thí nghiệm vì chúng chứa nhiều (50 - 54%) sphingomyelin phospholid. Sau thời gian ủ, dựa vào vòng sáng tan máu, ta xác định được kiểu phân giải máu của từng chủng.
35
Dạng tan máu α (tan máu không hoàn toàn): vết tan xuất hiện mờ dưới chân khuẩn lạc.
Dạng tan máu β (tan máu hoàn toàn): vòng tan máu trong, rõ ràng quanh khuẩn lạc.
Dạng tan máu γ (không tan máu): không có vết tan máu.
2.2.2.4. Chuyển hóa glucose (Voges-Proskauer test, VP test)
Thí nghiệm nhằm kiểm tra khả năng chuyển hóa glucose thành sản phẩm 2,3-butanediol của các chủng vi khuẩn. Đây là một đặc tính nhằm phân loại các chủng vi sinh vật. Tuy nhiên 2,3-butanediol (sản phẩm cuối của quá trình lên men glucose) không dễ phát hiện, vì vậy quá trình nhận biết phải dựa trên sản phẩm trung gian của quá trình chuyển hóa đó là acetylmethylcarbinol (acetoin). Do đó, 2,3-butanediol được phát hiện gián tiếp thông qua aectoin bằng phản ứng chuyển
màu đỏ.
Cấy riêng rẽ chủng vi khuẩn vào từng ống thạch P.V. Ủ ở 370C trong 48h. Lấy 1ml dịch nuôi cấy vi khuẩn cho sang ống nghiệm sạch, thêm 0,6 ml α- naphtol, lắc mạnh. Thêm vào mỗi ống nghiệm 0,2 ml KOH 40% và lắc mạnh. Đặt nghiêng các ống phản ứng để tăng diện tích tiếp xúc với không khí. Sau 15-60 phút quan sát màu đỏ xuất hiện ở các ống nghiệm ( phản ứng dương tính).
2.2.2.5. Đồng hóa citrat
Chuẩn bị dịch huyền phù vi khuẩn trong nước muối sinh lý vô trùng. Cấy riêng rẽ từng chủng lên ống thạch nghiêng Simmons citrat, ủ trong 7 ngày sau đó quan sát màu. Phản ứng dương tính: Màu xanh lam xuất hiện trong thạch chứng tỏ xitrat- nguồn cacbon duy nhất đã bị đồng hóa, môi trường trở nên kiềm.
2.2.2.6. Sinh trưởng khi có mặt NaCl 6,5%
Cấy chủng vi khuẩn lên môi trường LB chứa 6,5% NaCl, chú ý điều chỉnh pH môi trường khi cho NaCl trước khi khử trùng. Ủ vi khuẩn ở 370C và 550C trong 24-28h. Quan sát sự sinh trưởng của các chủng vi khuẩn.
36
2.2.2.7. Thủy phân gelatin
Mục đích của thí nghiệm này nhằm kiểm tra khả năng sử dụng gelatin như là một nguồn cacbon cho sinh trưởng của vi khuẩn. Để phân giải ngoại bào gelatin, các vi khuẩn này phải có khả năng sinh enzyme ngoại bào gelatinase.
Chủng vi khuẩn được cấy riêng rẽ vào ống nghiệm chứa thạch gelatin, ống đối chứng không cấy. Ủ ống vi khuẩn ở 370C từ 5-7 ngày. Đọc kết quả: đặt các ống nghiệm vào trong tủ lạnh 1-2h. Ở nhiệt độ thấp gelatin sẽ đông lại. Nếu gelatin bị phân giải thì tính chất này mất đi. Đặt các ống nghiệm lên thước kẻ và đánh giá mức độ phân giải gelatin của các chủng vi khuẩn.
2.2.2.8. Tính nhạy cảm đối với kháng sinh
Lấy 100 µl dịch vi khuẩn nuôi trong môi trường LB ( OD600 0,6) cấy trải trên đĩa môi trường TSA, đặt các khoanh giấy kháng sinh cách đều nhau (6 loại kháng sinh/đĩa). Ủ các đĩa môi trường vi khuẩn có chứa kháng sinh trong tủ ấm 370C trong 24-36h. Đường kính vòng vô khuẩn được đo bằng thước điện tử Digmatic Caliper. Kết quả được so sánh với tiêu chuẩn National Committee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS, 1997) nhằm xác định mức phản ứng với kháng sinh của các chủng.
2.2.2.9. Hiệu suất tạo bào tử
Các chủng vi khuẩn được nuôi lắc qua đêm trong môi trường LB ở điều kiện 37oC, đưa về OD600 0,6 sau đó lấy 100 µl cho vào 10 ml DSM. Nuôi lắc dịch vi khuẩn ở điều kiện 37oC, 180 vòng/phút. Mẫu được thu ở các thời điểm 4h, 8h, 16h, 24h và 48h. Lấy 100 µl pha loãng theo dãy nồng độ để đếm tế bào tổng số và lấy 100 µl nữa cho vào ống Eppendorf, ngâm trong bình ổn nhiệt ở 70oC trong 20 phút để giết tế bào sinh dưỡng sau đó pha loãng theo dãy để đếm số bào tử hình thành. Hiệu suất tạo bào tử ở mỗi thời điểm được tính bằng số bào tử chia cho tế bào tổng số và nhân với 100%.
37
Các chủng vi khuẩn dưới dạng bào tử được ngâm trong các dung dịch pH từ 2, 4, 6, , 8, 10 và trong nước RO (thí nghiệm đối chứng) trong 2h ở nồng độ 108CFU/ml sau đó đếm độ sống theo dãy pha loãng để xác định số vi khuẩn còn sống. Các dung dịch pH được chuẩn bị dựa theo tác giả Phan Tuấn Nghĩa (2012).
38
2.2.2.11. Độ bền của bào tử ở trong muối
Bào tử vi khuẩn cũng được ngâm trong các dung dịch muối ăn ở các nồng độ 1%, 2%, 3%, 4%, 5% và nước RO (đối chứng) ở nồng độ 108 bào tử/ml trong 2h sau đó pha loãng theo dãy để đếm độ sống của vi khuẩn.
2.2.2.12. Sự tạo thành biofilm
Sự hình thành biofilm của các chủng vi khuẩn được thực hiện như mô tả của
Honget al., 2008. Dịch vi khuẩn được đưa về nồng độ 108CFU/ml, sau đó lấy 10 µl nhỏ vào giữa đĩa môi trường CMK, để khô dịch vi khuẩn sau đó ủ ở tủ 370C từ 24- 28h. Quan sát sự hình thành biofilm của các chủng vi khuẩn và phân tích kết quả.
2.2.3. Phân tích trình tự 16S rRNA 2.2.3.1. Tách chiết và tinh sạch genome