Xác định nhóm vi khuẩn gây bệnh đường ruột bằng phương pháp pcr reverse dot blot nghiên cứu khoa học

TRƢỜNG ĐẠI HỌC MỞ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CỦA SINH VIÊN THAM GIA XÉT GIẢI THƢỞNG NGHIÊN CỨU CẤP TRƢỜNG XÁC ĐỊNH NHÓM VI KHUẨN GÂY BỆNH ĐƢỜNG RUỘT BẰNG PHƢƠNG PHÁP PCR REVERSE DOT BLOT Mã số đề tài Thuộc nhóm ngành khoa học: VI SINH –SINH HỌC PHÂN TỬ ỨNG DỤNG TRONG Y DƢỢC TP.HCM, 04/2013 TRƢỜNG ĐẠI HỌC MỞ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CỦA SINH VIÊN THAM GIA XÉT GIẢI THƢỞNG NGHIÊN CỨU CẤP TRƢỜNG XÁC ĐỊNH NHÓM VI KHUẨN GÂY BỆNH ĐƢỜNG RUỘT BẰNG PHƢƠNG PHÁP PCR -REVERSE DOT BLOT Mã số đề tài Thuộc nhóm ngành khoa học: VI SINH –SINH HỌC PHÂN TỬ ỨNG DỤNG TRONG Y DƢỢC Sinh viên thực hiện: TRẦN THỊ PHÚC Nam, Nữ: Nữ Dân tộc: Kinh Lớp, khoa: Khóa 09-Khoa CNSH Năm thứ: /Số năm đào tạo:4 Ngành học: Chuyên ngành Vi sinh-Sinh học phân tử Ngƣời hƣớng dẫn:PGS.TS LÊ HUYỀN ÁI THÚY ThS TRƢƠNG KIM PHƢỢNG MỤC LỤC DANH MỤC HÌNH v DANH MỤC BẢNG BIỂU ix DANH MỤC NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT x MỞ ĐẦU PHẦN I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU I.1 TÌNH HÌNH NGỘ ĐỘC THỰC PHẨM TRÊN THẾ GIỚI VÀ Ở VIỆT NAM: I.1.1 Trên giới: I.1.2 Ở Việt Nam: I.2 CÁC NHÓM VI KHUẨN GÂY BỆNH THƢỜNG GẶP: I.2.1 Bacillus cereus I.2.1.1 Đặc điểm hình thái I.2.1.2 Đặc điểm sinh hóa sinh dƣỡng I.2.1.3 Thông tin máy di truyền[101] I.2.1.4 Đặc điểm gây độc gây bệnh Bacillus cereus:[81] I.2.2 Clostridium botulinum I.2.2.1 Đặc điểm hình thái[81] I.2.2.2 Đặc điểm sinh hóa sinh dƣỡng I.2.2.3 Thông tin máy di truyền[101] I.2.2.4 Đặc điểm gây độc gây bệnh C.botulinum[81] I.2.3 Clostridium perfringens I.2.3.1 Đặc điểm hình thái[81] I.2.3.2 Đặc điểm sinh hóa sinh dƣỡng I.2.3.3 Thông tin máy di truyền[101] I.2.3.4 Đặc điểm gây độc gây bệnh C perfringens[81] I.2.4 Staphylococcus aureus I.2.4.1 Đặc điểm hình thái[81] I.2.4.2 Đặc điểm sinh hóa sinh dƣỡng I.2.4.3 Thông tin máy di truyền[101] I.2.4.4 Đặc điểm gây độc gây bệnh Staphylococcus aureus[84] I.2.5 Listeria monocytogenes -i- I.2.5.1 Đặc điểm hình thái[81] I.2.5.2 Đặc điểm sinh hóa sinh dƣỡng I.2.5.3 Thông tin máy di truyền [101] 10 I.2.5.4 Cơ chế gây độc gây bệnh L monocytogenes[81] 10 I.2.6 Escherichia coli O157:H7 10 I.2.6.1 Đặc điểm hình thái 10 I.2.6.2 Đặc điểm sinh hóa sinh dƣỡng 10 I.2.6.3 Thông tin máy di truyền[101] 11 I.2.6.4 Đặc điểm gây độc gây bệnh Escherichia coli O157:H7 11 I.2.7 Salmonella spp 12 I.2.7.1 Đặc điểm hình thái 12 I.2.7.2 Đặc điểm môi trƣờng sống 12 I.2.7.3 Đặc điểm sinh hóa sinh dƣỡng 13 I.2.7.4 Thông tin máy di truyền[101] 13 I.2.7.5 Độc tố Salmonella spp 13 I.2.8 Shigella spp 13 I.2.8.1 Đặc điểm hình thái 13 I.2.8.2 Đặc điểm sinh hóa sinh dƣớng 14 I.2.8.3 Thông tin máy di truyền [101] 14 I.2.8.4 Độc tố Shigella spp 14 I.2.9 Yersinia enterocolitica 14 I.2.9.1 Đặc điểm hình thái 14 I.2.9.2 Đặc điểm sinh hóa sinh dƣỡng 15 I.2.9.3 Thông tin máy di truyền[101] 15 I.2.9.4 Cơ chế gây độc gây bệnh Yersinia enterocolitica 15 I.2.10 Vibrio cholerae 15 I.2.10.1 Đặc điểm hình thái[81] 15 I.2.10.2 Đặc điểm sinh hóa sinh dƣỡng 15 I.2.10.3 Thông tin máy di truyền[101] 16 I.2.10.4 Cơ chế gây độc gây bệnh Vibrio cholerae[81] 16 I.2.11 Vibrio parahaemolyticus 16 I.2.11.1 Đặc điểm hình thái[81] 16 I.2.11.2 Đặc điểm sinh hóa sinh dƣỡng 16 -ii- I.2.11.3 Thông tin máy di truyền[101] 16 I.2.11.4 Độc tố Vibrio parahaemolyticus[81] 17 I.2.12 Brucella spp 17 I.2.12.1 Đặc điểm hình thái 17 I.2.12.2 Đặc điểm sinh hóa sinh dƣỡng 17 I.2.12.3 Thông tin máy di truyền[101] 17 I.2.12.4 Đặc điểm gây độc gây bệnh Brucella spp 17 CÁC PHƢƠNG PHÁP PHÁT HIỆN VI SINH VẬT 17 I.3 I.3.1 Phƣơng pháp truyền thống 18 I.3.2 Phƣơng pháp phân tử đại phát vi sinh vật gây bệnh 19 I.3.2.1 Phƣơng pháp PCR 19 a Định nghĩa 19 b Các thành phần phản ứng PCR 20 Ưu điểm nhược điểm phương pháp PCR 22 c I.3.2.2 Multiplex PCR: 23 I.3.2.3 Phƣơng pháp ELISA (Enzym Linked Immunosorbent Assay) 23 I.3.2.4 Phƣơng pháp microarray 24 I.3.2.5 Phƣơng pháp Reverse dot blot 25 I.4 VÙNG TRÌNH TỰ 16S 23S rDNA 26 I.4.1 Vùng gen 16S rRNA 26 I.4.2 Vùng gen 23S rRNA 28 I.5 NHỮNG CÔNG TRÌNH NGHIÊN CỨU VỀ VIỆC PHÁT HIỆN CÁC VI SINH VẬT GÂY BỆNH BẰNG CÔNG CỤ SINH HỌC PHÂN TỬ 28 PHẦN II: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 30 II.1 VẬT LIỆU 30 II.1.1 Các công cụ tin sinh học: 30 II.2 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 30 II.2.1 Khai thác liệu báo khoa học 30 II.2.2 Thu nhận trình tự gen 16, 23S rDNA 12 vi khuẩn mục tiêu: 30 II.2.3 Thiết kế mồi mẫu dò 32 PHẦN III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 33 III.1 KẾT QUẢ KHAI THÁC DỮ LIỆU 33 III.2 KHẢO SÁT IN SILICO 35 -iii- III.2.1 Tìm hiểu đánh giá hệ mồi cho phản ứng PCR 35 III.2.2 Tìm hiểu đánh giá hệ mẫu dò cho phản ứng RDB 39 III.2.2 Kết khảo sát hệ mẫu dò Bacillus cereus 41 III.2.2 Kết khảo sát hệ mẫu dò CB1 Clostridium botulinum 43 III.2.2 Kết khảo sát hệ mẫu dò CP1 Clostridium perfringens 45 III.2.2 Kết khảo sát hệ mẫu dò STA1 Staphylococcus aureus 47 III.2.2 Kết khảo sát hệ mẫu dò LIS1 Listeria monocytogenes 49 III.2.2 Kết khảo sát hệ mẫu dò Escherichia coli O157:H7 51 III.2.2 Kết khảo sát hệ mẫu dò SAL1 Salmonella spp 55 III.2.2 Kết khảo sát hệ mẫu dò SHI1 Shigella spp 57 III.2.2 Kết khảo sát hệ mẫu dò VCH1 Vibrio cholerae 59 III.2.2 10 Kết khảo sát hệ mẫu dò VPA1 Vibrio parahaemolyticus 61 III.2.2 11 Kết khảo sát hệ mẫu dò YER1 Yersinia enterocolitica 63 III.2.2 12 Kết khảo sát hệ mẫu dò BRU1 Brucella spp 65 III.2.2 13 Tìm hiểu đánh giá mẫu dò phát chứng dƣơng, chứng âm, chứng màu (color control) 67 III.2.2 14 Tổng hợp kết phân tích, đánh giá thơng số vật lý mồi mẫu dị 68 PHẦN IV: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 70 IV.1 KẾT LUẬN 70 IV.2 ĐỀ NGHỊ 70 TÀI LIỆU THAM KHẢO 71 PHỤ LỤC 82 -iv- DANH MỤC HÌNH Trang Hình 1: Bacillus cereus Hình 2: Clostridium botulinum Hình 3: Clostridium perfringens Hình 4: Staphylococcus aureus Hình 5: Listeria monocytogenes Hình 6: E.coli 10 Hình 7: Salmonella spp 12 Hình 8: Shigella spp 14 Hình 9: Yersinia enterocolitica 14 Hình 10: Vibrio cholerae 15 Hình11: Vibrio parahaemolyticus 16 Hình 12: Brucella spp 17 Hình 13: Sơ đồ mơ tả phản ứng PCR 22 Hình 14: Minh họa phƣơng pháp RDB 26 Hình 15: Cấu trúc vùng gen 16, 23S rRNA 28 Hình 16 Kết chạy Bioedit mồi 16SF 12 trình tự 16S rDNA 12 lồi vi khuẩn mục tiêu 38 Hình 17 Kết chạy Bioedit mồi 16SR 12 trình tự 16S rDNA 12 loài vi khuẩn mục tiêu 38 Hình 18 Kết chạy Bioedit mồi 23SF 12 trình tự 23S rDNA 12 lồi vi khuẩn mục tiêu 39 Hình 19 Kết chạy Bioedit mồi 23SR 12 trình tự 23S rDNA 12 lồi vi khuẩn mục tiêu 39 -v- Hình 20 Kết Blast mẫu dị BC1 Bacillus cereus 41 Hình 21 Kết chạy Bioedit mẫu dò BC1 Bacillus cereus 42 Hình 22 Kết gióng cột cặp mồi 16S rDNA mẫu dò BC1 Bacillus cereus với đoạn trình tự 16S rDNA Bacillus cereus có mã số AY425946.1 42 Hình 23 Kết Blast mẫu dị CB1 C botulinum 43 Hình 24 Kết chạy Bioedit mẫu dị CB1 C botulinum 44 Hình 25 Kết gióng cột cặp mồi 16S rDNA mẫu dị CB1 C botulinum với đoạn trình tự 16S rDNA C botulinum có mã số CP002011.1 44 Hình 26 Kết chạy Bioedit mẫu dò CP1 C perfringens 45 Hình 27 Kết Blast mẫu dị CP2 C perfringens 46 Hình 28 Kết chạy Bioedit mẫu dị CP2 C perfringens 46 Hình 29 Kết gióng cột cặp mồi 16S rDNA mẫu dị CP2 C perfringens với đoạn trình tự 16S rDNA C perfringens có mã số AB566417.1 47 Hình 30 Kết Blast mẫu dò STA1 S aureus 48 Hình 31 Kết chạy Bioedit mẫu dị STA1 S aureus 48 Hình 32 Kết gióng cột cặp mồi 16S rDNA mẫu dò STA1 S aureus với đoạn trình tự 16S rDNA S aureus có mã số CP002643.1 49 Hình 33 Kết Blast mẫu dị LIS1 L monocytogenes 50 Hình 34 Kết chạy Bioedit mẫu dị LIS1 L monocytogenes 50 Hình 35 Kết gióng cột cặp mồi 16S rDNA mẫu dị LIS1 L monocytogenes với đoạn trình tự 16S rDNA L monocytogenes có mã số S55472.1 51 Hình 36 Kết chạy Bioedit mẫu dị ECO1 E coli O157:H7 52 -vi- Hình 37 Kết Blast mẫu dị ECO2 E coli O157:H7 53 Hình 38 Kết chạy Bioedit mẫu dò ECO2 E coli O157:H7 54 Hình 39 Kết gióng cột cặp mồi 23S rDNA mẫu dò ECO2 E coli O157:H7 với đoạn trình tự 23S rDNA E coli O157:H7 có mã số NR_076322.1 54 Hình 40 Kết Blast mẫu dị SAL1 Salmonella spp 55 Hình 41 Kết chạy Bioedit mẫu dò SAL1 Salmonella spp 56 Hình 42 Kết gióng cột cặp mồi 16S rDNA mẫu dò SAL1 Salmonella spp với đoạn trình tự 16S rDNA Salmonella spp.có mã số NR_074935.1 56 Hình 43 Kết Blast mẫu dị SHI1 Shigella spp 57 Hình 44 Kết chạy Bioedit mẫu dị SHI1 Shigella spp 58 Hình 45 Kết gióng cột cặp mồi 16S rDNA mẫu dị SHI1 Shigella spp với đoạn trình tự 16S rDNA Shigella boydii có mã số NR_074893.1 58 Hình 46 Kết Blast mẫu dị VCH1 V cholerae 59 Hình 47 Kết chạy Bioedit mẫu dò VCH1 củaV cholerae 60 Hình 48 Kết gióng cột cặp mồi 16S rDNA mẫu dò VCH1 V cholerae với đoạn trình tự 16S rDNA V cholerae có mã số NR_044050.1 60 Hình 49 Kết Blast mẫu dị VPA1 V parahaemolitycus 61 Hình 50 Kết chạy Bioedit mẫu dị VPA1 V Parahaemolitycus 62 Hình 51 Kết gióng cột cặp mồi 16S rDNA mẫu dị VPA1 V.parahaemolitycus với đoạn trình tự 16S rDNA V.parahaemolitycus có mã số NR_074196.1 62 Hình 52 Kết Blast mẫu dị YER1 Y Enterocolitica 63 -vii- Hình 53 Kết chạy Bioedit mẫu dò YER1 Y enterocolitica 64 Hình 54 Kết gióng cột cặp mồi 16S rDNA mẫu dò YER1 Y enterocolitica với đoạn trình tự 16S rDNA Y enterocolitica có mã số HQ222845.1 65 Hình 55 Kết Blast mẫu dị BRU1 Brucella spp 66 Hình 56 Kết chạy Bioedit mẫu dị BRU1 Brucella spp 66 Hình 57 Kết gióng cột cặp mồi 16S rDNA mẫu dị BRU1 Brucella spp.với đoạn trình tự 16S rDNA Brucella ceti có mã số NR_042463 67 Hình 58 Kết chạy Bioedit mẫu dò phát chứng dƣơng CD1 68 Hình 59 Kết chạy Bioedit mẫu dị phát chứng âm CA1 68 -viii- -103- -104- -105- Phụ lục 15 Kết Blast thể độ đặc hiệu mồi 23SF 12 vi khuẩn mục tiêu -106- -107- -108- -109- -110- -111- Phụ lục 16 Kết Blast thể độ đặc hiệu mồi 23SR 12 vi khuẩn mục tiêu -112- -113- -114- -115- -116- -117- ... ĐẠI HỌC MỞ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CỦA SINH VI? ?N THAM GIA XÉT GIẢI THƢỞNG NGHIÊN CỨU CẤP TRƢỜNG XÁC ĐỊNH NHÓM VI KHUẨN GÂY BỆNH ĐƢỜNG RUỘT BẰNG PHƢƠNG PHÁP... dụng nhiều nghiên cứu hay ứng dụng phân loại, định danh vi khuẩn? ??vvv Trong khuôn khổ chuyên đề sinh vi? ?n nghiên cứu khoa học này, tập trung nghiên cứu 12 đối tƣợng vi khuẩn gây bệnh đƣờng ruột chủ... Sinh học Phân tử phát vi khuẩn gây bệnh đƣờng ruột dựa PCR: PCR – điện di, Real-time PCR, Multiplex -PCR? ?? Đề tài hƣớng đến công nghệ khác, kết hợp PCR lai ngƣợc theo lỗ màng (PCR- Reverse Dot Blot)