KẾT QUẢ TRÍCH LY TỪ CỎ NGỌT

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ - BÀN LUẬN 3.1 Kết kiểm tra số tiêu ban đầu nguyên liệu khô: Việc kiểm tra tiêu nguyên liệu khô ban đầu sở quan trọng trình tiến hành nghiên cứu Trong nghiên cứu này, quan tâm đến độ ẩm, xơ, tro, pectin đường tổng tiêu ảnh hưởng đến hiệu trình tách chiết dịch đường sau Kết thu sau kiểm tra số tiêu nguyên liệu ban đầu trình bày bảng 3.1: Bảng 3.1: Kết kiểm tra số tiêu ban đầu nguyên liệu STT 10 (*) Các tiêu Độ ẩm Protein thô(*) Xơ thô(*) Tro Vitamin C Đường tổng(*) Đường khử Béo Pectin Polyphenol tổng Hàm lượng (%) 4.84 11.5 9.2 7.04 0.17 16.0 6.23 3.53 0.01 2.95 Kết xác định Sắc Ký Hải Đăng So sánh kết kiểm tra với nghiên cứu tác giả bảng 3.2 chung loại Stevia rebaudiana Bertoni ta thấy hàm lượng tiêu có phần khác nhau, khác biệt giải thích điều kiện thổ nhưỡng, khí hậu kỹ thuật trồng trọt tùy vùng lãnh thổ Bảng 3.2: Kết thành phần hóa học cỏ khô (% theo khối lượng) tham khảo Theo tác giả Thành phần Độ ẩm Protein Béo Tro Carbohydrat e Xơ thô Abou- Tadhani Arab et and al Subhash 9.8 2.5 10.5 (2010) 5.37 11.4 3.73 7.41 (2006) 20.4 4.34 13.1 53 52 61.9 35.2 - 15 18.5 15.5 - - Mishra Goyal et al et al (2010) (2010) 10 11 4.65 11.2 1.9 6.3 11.2 5.6 - 52 - 18 15.2 Serio (2010) Savita et al (2004) Kaushik et al (2010) 7.7 12 2.7 8.4 (Nguồn: Roberto Lemus – Mondaca cộng sự, 2011) Kết thu nhận kiểm tra độ ẩm nguyên liệu 4.84%, kết khác biệt so với tác giả, chế độ sấy khác nhau, nhiên sấy với thời gian dài dẫn đến việc hao hụt số thành phần có nguyên liệu ban đầu nhìn chung độ ẩm thích hợp cho việc bảo quản sản phẩm khô đồng thời không làm hư hại cấu trúc sản phẩm trình vận chuyển Hàm lượng xơ thô nguyện liệu thu 9.2%, kết nhỏ nhiều so với tác giả thuận tiện trình trích ly Cellulose thành phần chủ yếu cấu tạo nên vách tế bào thực vật, hàm lượng cellulose nhỏ trình thẩm thấu dung mơi trích ly qua thành tế bào thực vật bị ngăn cản q trình khuếch tán chất từ tế bào mơi trường trích ly dễ dàng, hiệu suất chiết tách cao Ngoài ra, hàm lượng pectin tro yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến khả giải phóng hợp chất khỏi nguyên liệu sử dụng phương pháp trích ly dung mơi Thành phần pectin thực vật có chức tự nhiên chất keo để giữ thành tế bào tế bào lại với nhau, kết hàm lượng pectin thu 0.01%, sở việc lựa chọn enzyme trích ly nghiên cứu Tro biểu thị cho hàm lượng khống có ngun liệu, bao gồm khống đa lượng khoáng vi lượng, kết hàm lượng tro nhận 7.04%, kết có khác biệt so với tác giả, việc khác đất đai, khí hậu, trồng trọt lãnh thổ dẫn đến thành phần nguyên liệu nghiên cứu không giống Hàm lượng đường tổng thu nhận 16%, kết không khác biệt nhiều so với kết mà tác giả A.Esmat Abou-Arab cộng (2010) thực 15.65% loại 3.2 Kết khảo sát trích ly nước: 3.2.1 Khảo sát tỉ lệ cỏ : nước trích ly: Thí nghiệm đánh giá ảnh hưởng tỉ lệ cỏ : nước để tối ưu hóa điều kiện trích ly stevioside tổng từ ngun liệu cỏ khảo sát Vì chúng tơi cần chọn tỉ lệ cỏ : nước trích ly cho lượng nước sử dụng đạt hiệu trích ly cao mà phù hợp với lợi ích kinh tế cho thí nghiệm Kết tính tốn thu trình bày bảng 3.3: Bảng 3.3: Kết khảo sát tỉ lệ cỏ : nước trích ly Tỉ lệ (w/v) : 50 : 100 : 150 : 200 : 250 : 300 : 350 Hàm lượng stevioside tổng (%) 5.52 ± 0.09b 5.72 ± 0.08c 6.61 ± 0.1de 6.66 ± 0.13e 6.55 ± 0.09de 6.46 ± 0.1d 5.04 ± 0.14a (Ghi chú: % stevioside tổng tính khối lượng mẫu cân ban đầu) Mẫu có chữ in thường khác khác P-value = 0.05 - kết phân tích LSD Khảo sát tỉ lệ cỏ : nước trích ly 6.61 Hàm lượng stevioside (%) 5.52 5.72 2:50 2:100 6.66 6.55 6.46 5.04 2:150 2:200 2:250 2:300 2:350 Tỉ lệ nguyên liệu : nước (w/v) Hình 3.1: Ảnh hưởng tỉ lệ cỏ : nước đến hiệu trích ly stevioside Mỗi mốc thí nghiệm khảo sát tiến hành ba lần kết thu bảng 3.3 giá trị trung bình ba lần lặp Số liệu xử lý ANOVA để nhận xét khác biệt mẫu, giá trị P-value < 0.05 nghĩa tỉ lệ cỏ : nước có ảnh hưởng đến q trình trích ly stevioside tổng (Phụ lục 2.1) Khi tăng tỉ lệ nước sử dụng từ 2:50 lên tỉ lệ 2:200 hàm lượng stevioside trích ly tăng theo từ 5.52% lên 6.66% tiếp tục tăng tỉ lệ khảo sát lên 2:250, 2:300 2:350 hàm lượng stevioside trích ly lại giảm từ 6.55% xuống 5.04% Phân tích LSD kiểm tra khác biệt tỉ lệ (Phụ lục 2.2), chúng tơi thấy có khác mẫu Để giải thích cho kết thu từ khảo sát này, cần nhắc lại động lực q trình trích ly rắn - lỏng Theo tác giả Joés (2003), ba đường vận chuyển chất tan từ bên tế bào thực vật bên ngồi dung mơi đường khuếch tán đường Động lực q trình khuếch tán chênh lệch gradient nồng độ hợp chất cần trích ly ngun liệu mơi trường trích ly bên ngồi Do đó, lượng dung mơi dùng để trích ly mẫu nhiều chênh lệch gradient nồng độ lớn dẫn đến động lực trích ly cao ngược lại (Cacace Mazza, 2003; Al-Frarsi Chang, 2007) Ngoài ra, lượng dung môi sử dụng tăng tạo hội cho thành phần nguyên liệu tiếp xúc với dung mơi trích ly tốt hơn, làm cho tốc độ thấm lọc chất tan cao (Zhang cộng sự, 2007) Tuy nhiên, hàm lượng chất trích ly khơng tăng q trình đạt trạng thái cân (Herodez cộng sự, 2003) Theo tác giả Hamdam (2008), tỉ lệ nguyên liệu : dung mơi ảnh hưởng đáng kể đến số cân đặc trưng cho mối quan hệ hàm lượng chất trích ly với lượng dung mơi sử dụng tăng theo cấp số mũ sau ổn định dần để đạt hiệu trích ly tối đa Do đó, hàm lượng stevioside trích ly tăng ta tăng tỉ lệ nước tăng luôn tỉ lệ thuận với tỉ lệ nước sử dụng Sau trình khảo sát tỉ lệ cỏ : nước tối ưu mà tìm 2:150 w/v (1:75 w/v) Kết khác biệt với nghiên cứu trích ly đường stevioside phương pháp HPLC tác giả A Esmat Abou-Arab cộng (2010) với tỉ lệ cỏ : nước sử dụng tốt 1:35 w/v Như biết hàm lượng đường stevioside cỏ chịu ảnh hưởng nhiều giống, thổ nhưỡng, cách chăm sóc, thời điểm thu hoạch lá, Vì vậy, việc sử dụng tỉ lệ nước nhiều hay để lơi kéo lượng đường stevioside cho tốt nhất, tránh trạng thái cân nồng độ chất bên cỏ nước trích ly bên ngồi cịn phụ thuộc vào yếu tố Do đó, chúng tơi chọn tỉ lệ cỏ : nước trích ly 2:150 w/v (1:75 w/v) với hàm lượng stevioside tổng thu 6.61% 3.2.2 Khảo sát nhiệt độ trích ly: Thí nghiệm đánh giá ảnh hưởng nhiệt độ để tối ưu hóa điều kiện trích ly stevioside tổng từ nguyên liệu cỏ khảo sát Chúng tơi cần chọn nhiệt độ trích ly cho đảm bảo mặt kinh tế đạt hiệu trích ly cao Kết tính tốn thu trình bày bảng 3.4: Bảng 3.4: Kết khảo sát nhiệt độ trích ly Nhiệt độ (oC) 55 65 75 85 95 100 Hàm lượng stevioside tổng (%) 6.27 ± 0.13a 7.32 ± 0.34b 7.78 ± 0.19c 8.15 ± 0.17d 7.94 ± 0.1cd 7.18 ± 0.07b Mẫu có chữ in thường khác khác P-value = 0.05 - kết phân tích LSD Khảo sát nhiệt độ trích ly Hàm lượng stevioside (%) 7.32 7.78 8.15 7.94 7.18 6.27 55 65 75 85 95 100 Nhiệt độ (oC) Hình 3.2: Ảnh hưởng nhiệt độ đến hiệu trích ly stevioside Mỗi mốc thí nghiệm khảo sát tiến hành ba lần kết thu bảng 3.4 giá trị trung bình ba lần lặp Phân tích phương sai ANOVA để nhận xét khác biệt mẫu, giá trị P-value < 0.05 nghĩa nhiệt độ có ảnh hưởng đến q trình trích ly stevioside tổng (Phụ lục 3.1) Khi tăng nhiệt độ từ 55oC lên 85oC hàm lượng stevioside trích ly tăng từ 6.27% lên 8.15%, tiếp tục tăng nhiệt độ lên 95oC 1000C (mẫu trắng) hàm lượng stevioside giảm từ 7.94% xuống 7.18% Phân tích LSD kiểm tra khác biệt mẫu khảo sát nhiệt độ (Phụ lục 3.2), chúng tơi thấy có khác mẫu Nhiệt độ yếu tố quan trọng cần xem xét kĩ q trình trích ly Nhiệt độ làm biến tính tế bào thực vật, tạo điều kiện thuận lợi cho q trình trích ly (Joés, 2003) Khi tăng nhiệt độ trích ly, gia nhiệt cung cấp lượng cho phần tử hệ trích ly chuyển động hỗn loạn với vận tốc cao, làm tăng độ hòa tan, giảm độ nhớt làm tăng hệ số khuếch tán chất cần trích ly vào dung mơi, tăng động lực thúc đẩy q trình trích ly dẫn đến tăng hiệu q trình (Spigno De Faveri, 2007) Bên cạnh đó, việc gia nhiệt làm yếu liên kết đường stevioside với chất khác nguyên liệu, làm đường stevioside giải phóng mơi trường dung mơi dễ dàng Nhiệt độ cao đưa để khảo sát nhiệt độ sôi nước 100 oC (ở áp suất khí quyển) Nhiệt độ khơng cao để gây hao hụt hàm lượng stevioside, chúng xảy phân hủy đáng kể bắt đầu nhiệt độ 140oC (A Esmat Abou-Arab cộng sự, 2010) Tóm lại, chúng tơi chọn nhiệt độ trích ly 85oC với hàm lượng stevioside tổng trích ly thu 8.15% 3.2.3 Khảo sát thời gian trích ly: Khảo sát mốc thời gian trích ly khác thí nghiệm, từ chọn thời gian trích ly cho hàm lượng stevioside thu nhận cao Kết tính tốn thu trình bày bảng 3.5: Bảng 3.5: Kết khảo sát thời gian trích ly Hàm lượng Hàm lượng Thời gian (phút) stevioside tổng 10 20 40 60 80 100 (%) 6.97 ± 0.1a 7.19 ± 0.04b 7.29 ± 0.04bc 7.41 ± 0.07c 7.74 ± 0.08de 7.84 ± 0.1ef 7.97 ± 0.06fg Thời gian (phút) stevioside tổng 120 140 160 180 200 220 240 (%) 8.36 ± 0.05h 8.23 ± 0.08h 8.05 ± 0.1g 7.77 ± 0.08de 7.62 ± 0.13d 7.22 ± 0.12b 6.9 ± 0.16a Mẫu có chữ in thường khác khác P-value = 0.05 - kết phân tích LSD Hàm lượng stevioside (%) Khảo sát thời gian trích ly 8.36 8.23 8.05 7.84 7.97 7.77 7.62 7.74 7.41 7.29 7.22 6.90 7.19 6.97 0 10 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 Thời gian (phút) Hình 3.3: Ảnh hưởng thời gian đến hiệu trích ly stevioside Kết phân tích phương sai ANOVA với giá trị P-value < 0.05, nghĩa thời gian có ảnh hưởng đến q trình trích ly stevioside tổng (Phụ lục 4.1) Kết phân tích LSD cho chúng tơi thấy có khác có ý nghĩa khoảng tin cậy 95% (Phụ lục 4.2), hàm lượng stevioside mẫu trích ly có thời gian trích ly khác Khi tiến hành khảo sát mốc thời gian khác nhau, nhận thấy tăng dần thời gian trích ly lên hàm lượng stevioside thu nhận tăng theo từ mẫu trắng (0 10 phút) với hàm lượng 6.97% 7.19% đến 120 phút (8.36%) tiếp tục tăng thời gian lên hàm lượng stevioside có xu hướng giảm dần từ 140 phút (8.23%) đến 240 phút (6.9%) Thời gian trích ly yếu tố quan trọng khơng q trình trích ly hợp chất nói chung hàm lượng stevioside nói riêng Nếu sử dụng hợp lý yếu tố thời gian khơng mang lại lợi ích hiệu suất trích ly mà mang lại hiệu kinh tế Theo Brunner (1994) Taylor (1996) thời gian trích ly lượng chất thu có mối liên hệ thể đồ thị đường cong có ba vùng riêng biệt với đặc điểm khác Vùng đầu tương ứng với giai đoạn đầu trình trích ly, động lực trích ly lớn nhất, qua trình trích ly xảy nhanh chóng phụ thuộc vào độ hịa tan chất chiết vào dung môi, lượng chất chiết tăng tuyến tính với thời gian trích ly Sang giai đoạn tiếp theo, giai đoạn trung gian, động lực q trình trích ly bắt đầu giảm Giai đoạn cuối, q trình trích ly bị hạn chế khuếch tán chất tan vào dung môi chậm lại chênh lệch gradient nồng độ bị rút ngắn, lúc dung dịch gần đạt trạng thái cân nồng độ Bên cạnh đó, trích ly hợp chất cần phải ý đến mối quan hệ thời gian nhiệt độ Theo Crammer Ikan (1987), đường stevioside ổn định nhiệt độ 80oC vòng giờ, ta tăng thời gian trích ly lâu dẫn đến phân hủy nhẹ stevioside nhiệt độ (Paul M Kuznesof, 2007) Vì vậy, ta phải lựa chọn thời gian trích ly cho hợp lý, khơng q ngắn để dẫn đến hiệu suất trích ly giảm không dài để xảy trạng thái cân nồng độ chất tế bào nguyên liệu dung mơi trích ly bên ngồi, đồng thời tránh xảy tượng phân hủy đường stevioside Qua đó, chúng tơi chọn thời gian trích ly thích hợp 120 phút với hàm lượng stevioside tổng thu 8.36% 3.2.4 Tối ưu hóa q trình trích ly nước: Sau tiến hành xong thí nghiệm khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến hiệu trích ly đường cỏ nước, chúng tơi tiến hành quy hoạch thực nghiệm q trình trích ly nước Các yếu tố từ thí nghiệm khảo sát trích ly nước giá trị tâm cho thí nghiệm xác định giá trị tối ưu Thí nghiệm xác định giá trị tối ưu hai yếu tố khảo sát tỉ lệ cỏ : nước thời gian trích ly Thí nghiệm thiết kế phần mềm Modde 5.0 Sử dụng phương pháp bề mặt đáp ứng RSM với mơ hình bậc hai, hai yếu có tâm xoay để thiết kế thí nghiệm Yếu tố khảo sát: - Tỉ lệ cỏ : nước (w/v): X1 - Thời gian trích ly (phút): X2 Hàm mục tiêu: hàm lượng stevioside tổng (%): Y1 (Y1 = f(X1, X2) Cực đại) Bảng 3.6: Miền biến thiên tâm quy hoạch yếu tố khảo sát Yếu tố khảo sát Biến số Xi Tỉ lệ cỏ : nước (w/v): X1 Thời gian trích ly (phút): X2 Khoảng biến thiên Mức Tâm khảo sát Mức 100 150 200 100 120 140 Phương trình hồi quy có dạng: Y1 = b0 + b1X1 + b2X2 + b12X1X2 + b11X12 + b22X22 Tiến hành N thí nghiệm (N = 11) để xác định hệ số b phương trình Kết thí nghiệm khảo sát q trình trích ly nước trình bày bảng 3.7: Hàm lượng stevioside (%) Khảo sát thời gian siêu âm 10 9.22 9.53 8.91 8.84 8.68 6.56 Thời gian (phút) Hình 3.10: Ảnh hưởng thời gian siêu âm đến hiệu trích ly stevioside Kết phân tích phương sai ANOVA với giá trị P-value < 0.05 cho thấy có khác biệt có ý nghĩa thống kê mẫu với thời gian siêu âm khác (Phụ lục 8.1) Thời gian siêu âm tăng từ phút đến phút ứng với hàm lượng stevioside tăng từ 9.22% đến 9.53%, kết lớn đáng kể so với mẫu trắng (khơng có siêu âm) 6.56%, tiếp tục khảo sát mốc thời gian siêu âm tăng dần từ – phút hàm lượng stevioside thu lại giảm từ 8.91% xuống 8.68%, giảm hàm lượng stevioside thời gian phút khơng đáng kể (8.91% 8.84%) Phân tích LSD kiểm tra khác biệt thời gian siêu âm (Phụ lục 8.2), chúng tơi thấy có khác mẫu Thời gian yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến hiệu suất thu hồi chất chiết Q trình siêu âm có khả làm tăng tốc độ phá vỡ thành tế bào mô thực vật tốc độ truyền khối, nên thời gian xử lý cỏ rút ngắn lại Thời gian xử lý siêu âm kéo dài làm tăng hàm lượng hợp chất cao phân tử giải phóng từ gây tắc kênh dẫn dịch chiết khối nguyên liệu Đó nguyên nhân làm hiệu suất thu hồi chất chiết giảm nhẹ tăng thời gian xử lý để trích ly đường cỏ Kết khảo sát tương tự với nghiên cứu tác giả Jian Tang cộng (2010), trích ly đường stevia từ cỏ sử dụng siêu âm với khoảng thời gian dài từ 10 đến 60 phút với bước nhảy 10 phút hiệu suất trích ly tăng dao động từ 9.6g/100g đến 17.1g/100g, hiệu suất tăng cao thời gian đạt 40 phút sau tăng nhẹ 50 60 phút khơng có ý nghĩa khác biệt nên tác giả lựa chọn thời gian trích ly tối ưu 40 phút Với nghiên cứu khảo sát khác thời gian siêu âm, cụ thể theo tác giả Sandra C cộng (2003), tăng thời gian trích ly Ca, K, Mg từ loại thuộc họ citrus siêu âm từ 10 đến 30 phút hiệu trích ly bị giảm hay tác giả Yang W cộng (2009), quan sát thấy hiệu suất trích ly đường xylose từ ngô bị giảm kéo dài thời gian siêu âm Vì vậy, với hàm mục tiêu đặt hàm lượng stevioside tổng đạt cao nhất, chúng tơi lựa chọn thời gian tối ưu để trích ly đường cỏ sử dụng siêu âm phút với hàm lượng stevioside tổng thu nhận 9.53% 3.4.2 Khảo sát nhiệt độ siêu âm: Với khảo sát siêu âm ngồi yếu tố thời gian nhiệt độ coi yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến hiệu q trình trích ly stevioside Kết tính tốn thu trình bày bảng 3.19: Bảng 3.19: Kết khảo sát nhiệt độ siêu âm Nhiệt độ (oC) 30 40 50 60 70 80 Hàm lượng stevioside tổng (%) 6.56 ± 0.07a 9.28 ± 0.09c 9.51 ± 0.05d 9.72 ± 0.06e 9.87 ± 0.04f 9.46 ± 0.08d 8.87 ± 0.13b Mẫu có chữ in thường khác khác P-value = 0.05 - kết phân tích LSD Hàm lượng stevioside (%) Khảo sát nhiệt độ siêu âm 10 9.28 9.51 9.70 9.90 30 40 50 60 9.53 9.02 6.56 70 80 Nhiệt độ (oC) Hình 3.11: Ảnh hưởng nhiệt độ siêu âm đến hiệu trích ly stevioside Kết phân tích phương sai ANOVA với giá trị P-value < 0.05 cho thấy có khác biệt có ý nghĩa thống kê mẫu với nhiệt độ siêu âm khác (Phụ lục 9.1) Khi tăng nhiệt độ siêu âm tăng từ 30oC lên 60oC hàm lượng stevioside tăng từ 9.28% đến 9.9%, kết lớn đáng kể so với mẫu trắng (khơng có siêu âm) 6.56%, tiếp tục tăng nhiệt độ siêu âm lên 70 80oC hàm lượng stevioside thu lại giảm xuống (9.53% 9.02%) Phân tích LSD kiểm tra khác biệt mốc nhiệt độ siêu âm (Phụ lục 9.2), chúng tơi nhận thấy có khác mẫu Cơ chế siêu âm tạo nên tượng xâm thực làm rách màng tế bào, dẫn đến phá vỡ tế bào thực vật làm cho chất bên tế bào bên ngồi dễ dàng, tăng hiệu q trình trích ly Khi tăng nhiệt độ xử lý siêu âm hiệu suất thu hồi chất chiết tăng Kết khảo sát tương tự với nghiên cứu tác giả Jian Tang cộng (2010), trích ly đường stevia từ cỏ sử dụng siêu âm với nhiệt độ từ 40 oC đến 80oC hiệu suất tăng mạnh từ 12.6g/100g đến 16.4g/100g nhiệt độ 40oC đến 60oC hiệu suất giảm nhiệt độ 60oC, tác giả lựa chọn nhiệt độ tối ưu cho trình trích ly 60oC Nghiên cứu tác giả Hua-Feng Zhang cộng (2009), trích ly Epimedin C từ Epimedin tươi với hỗ trợ siêu âm Theo tác giả, tăng nhiệt độ xử lý siêu âm từ 15oC lên 45oC hiệu suất trích ly Epimedin C tăng theo Hiệu suất đạt cực đại 45oC Nếu tăng nhiệt độ lên cao hiệu suất tăng khơng có khác biệt (P-value < 0.05) Điều giải thích sau: tăng nhiệt độ tốc độ truyền khối tăng, độ hòa tan Epimedin C dung môi tăng độ nhớt dung môi giảm Khi nhiệt độ tăng cao số lượng bong bóng tạo từ q trình siêu âm bị giảm nên hiệu suất trích ly khơng tăng nhiều Hơn nữa, việc tăng nhiệt độ làm tăng chi phí lượng cho q trình xử lý, đồng thời gây thất thoát cấu tử dễ bị biến đổi nhiệt dịch chiết Theo tác giả Lawrence Ordin (1960), nhiệt độ tăng chuyển động phân tử tăng, nên dung môi thẩm thấu nhanh vào bên tế bào màng làm tăng áp suất nội bào, đến thời điểm định làm cho thành tế bào vỡ ra, từ làm chất bên thành tế bào ngồi dung mơi dẫn đến hiệu suất trích ly tăng Do đó, chúng tơi chọn nhiệt độ siêu âm để trích ly đường cỏ 60oC với hàm lượng stevioside tổng thu nhận 9.9% 3.4.3 Tối ưu hóa q trình trích ly siêu âm nước: Sau tiến hành xong thí nghiệm khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến hiệu trích ly đường cỏ siêu âm nước, tiến hành quy hoạch thực nghiệm q trình trích ly siêu âm nước Các yếu tố từ thí nghiệm khảo sát trích ly siêu âm nước giá trị tâm cho thí nghiệm xác định giá trị tối ưu Thí nghiệm xác định giá trị tối ưu hai yếu tố khảo sát thời gian siêu âm nhiệt độ siêu âm Thí nghiệm thiết kế phần mềm Modde 5.0 Sử dụng phương pháp bề mặt đáp ứng RSM với mơ hình bậc hai, hai yếu có tâm xoay để thiết kế thí nghiệm Yếu tố khảo sát: - Thời gian siêu âm (phút): X5 - Nhiệt độ siêu âm (oC): X6 Hàm mục tiêu: hàm lượng stevioside tổng (%): Y3 (Y3 = f(X5, X6) Cực đại) Bảng 3.20: Miền biến thiên tâm quy hoạch yếu tố khảo sát Yếu tố khảo sát Biến số Xi Thời gian siêu âm (phút): X5 Nhiệt độ siêu âm (oC): X6 Khoảng biến thiên Mức Tâm khảo sát Mức 50 60 70 Phương trình hồi quy có dạng: Y3 = b0 + b1X5 + b2X6 + b12X5X6 + b11X52 + b22X62 Tiến hành N thí nghiệm (N = 11) để xác định hệ số b phương trình Kết thí nghiệm khảo sát q trình trích ly siêu âm nước trình bày bảng 3.21: Bảng 3.21: Ma trận quy hoạch cấu trúc có tâm bậc 2, hai yếu tố kết thực nghiệm STT 10 11 Exp Name N1 N2 N3 N4 N5 N6 N7 N8 N9 N10 N11 Run Order 11 10 X5 3 0.586 3.414 2 2 X6 50 50 70 70 60 60 45.86 74.14 60 60 60 Y3 9.41 9.59 9.94 9.78 9.31 9.67 10.06 9.9 10.92 10.84 11.02 Giải toán quy hoạch thực nghiệm cho hàm mục tiêu phần phần mềm Modde 5.0, kết nhận bảng 3.22 bảng 3.23: Bảng 3.22: Ảnh hưởng biến đến hàm mục tiêu Y3 Y3 Hằng số X5 X6 X5 * X X6 * X X5 * X N = 11 DF = Hệ số ảnh hưởng 10.9267 0.06614 0.0617292 -0.73222 -0.487146 -0.0850001 Q2 = 0.709 R2 = 0.956 Sai số chuẩn 0.104583 0.0640489 0.0640489 0.0762432 0.0762432 0.0905719 P 1.52318e-009 0.349106 0.379419 0.000207458 0.00139088 0.391083 Kết bảng 3.22 cho thấy X5, X6 X5 * X6 không biểu ảnh hưởng hàm mục tiêu Y3 (P > 0.05) Do đó, phương trình hồi quy hàm mục tiêu Y3 viết lại với yếu tố ảnh hưởng sau: Y3 = 10.9267 - 0.7322X52 - 0.4871X62 Dựa vào mơ hình này, kết luận tác động thời gian siêu âm nhiệt độ siêu âm ảnh hưởng khơng có ý nghĩa với hàm Y3 (hàm lượng stevioside tổng) Kiểm tra khả giải thích số liệu dự đốn mơ hình dựa vào hệ số R Q2 tính tốn từ mơ hình theo tác giả L.Eriksson cộng (2008): “Một mơ hình hồi quy tốt có khả dự đốn xác từ số liệu thực nghiệm Q2 > 0.5, R2 > 0.8 < ” Các giá trị đưa bảng 3.22 cho thấy Q2 R2 thỏa mãn điều kiện trên, kết hợp với giá trị P < 0.05 bảng phân tích phương sai (bảng 3.23) chúng tơi kết luận phương trình hồi quy hàm Y3 tương thích với số liệu thực nghiệm thu thập Bảng 3.23: Phân tích phương sai mơ hình hồi quy theo hàm mục tiêu Y3 Y3 Bậc tự Tổng bình Trung bình (DF) phương bình phương F P Độ lệch chuẩn Tổng Hằng số Tổng hiệu chỉnh Hồi quy Phần dư 11 (SS) 1112.56 1108.82 (MS) 101.142 1108.82 10 3.74158 0.374158 5 3.57751 0.164066 0.715502 0.0328131 0.611684 21.8054 0.002 0.845874 0.181144 Biểu diễn phương trình hồi quy hàm Y3 theo đồ thị hình học hình 3.14: Hình 3.12: Đồ thị biểu diễn phương trình hồi quy hàm Y3: (e) Kết dự đốn hàm lượng stevioside tổng từ mơ hình theo điều kiện chọn; (f) Ảnh hưởng thời gian siêu âm nhiệt độ siêu âm đến hàm lượng stevioside trích ly X5: thời gian siêu âm (phút), X6: nhiệt độ siêu âm (oC), Y3: hàm lượng stevioside tổng (%) Vùng tối ưu X5 [1.81, 2.27]; X6 [57.7, 63.4] Kết cho thấy hai yếu tố thời gian siêu âm (phút) nhiệt độ siêu âm (oC) không ảnh hưởng đến hàm lượng stevioside tổng (%) Vậy kết luận hàm lượng stevioside tổng trích ly siêu âm nước đạt cao với kết ba lần lặp thời gian siêu âm (phút) nhiệt độ siêu âm 60 (oC) làm thực nghiệm 10.93 ± 0.09 (%) 3.5 Kết khảo sát trích ly siêu âm enzyme: 3.5.1 Khảo sát nồng độ enzyme bổ sung: Với mục tiêu nghiên cứu trích ly hàm lượng stevioside tổng cao khảo sát hai yếu tố trình trích ly siêu âm nước trên, bổ sung enzyme vào để tiếp tục khảo sát hiệu trích ly, khảo sát nồng độ enzyme bổ sung Kết tính tốn thu trình bày bảng 3.24: Bảng 3.24: Kết khảo sát nồng độ enzyme bổ sung Nồng độ (%) 0.7 1.4 2.1 2.8 3.5 Hàm lượng stevioside tổng (%) 7.9 ± 0.07a 9.11 ± 0.18c 10.06 ± 0.13e 9.63 ± 0.15d 9.44 ± 0.11d 8.87 ± 0.06b Mẫu có chữ in thường khác khác P-value = 0.05 - kết phân tích LSD Khảo sát nồng độ enzyme bổ sung Hàm lượng stevioside (%) 12 10 9.11 10.06 9.63 9.44 2.1 2.8 7.90 8.87 0 0.7 1.4 3.5 Nồng độ (%) Hình 3.13: Ảnh hưởng nồng độ enzyme bổ sung đến hiệu trích ly stevioside Kết phân tích phương sai ANOVA với giá trị P-value < 0.05 cho thấy có khác biệt có ý nghĩa thống kê mẫu với nồng độ enzyme bổ sung khác (Phụ lục 10.1) Nồng độ enzyme tăng dần từ mẫu trắng (khơng có enzyme) đến nồng độ 1.4% ứng với hàm lượng stevioside tăng từ 7.9% đến 10.06% có chiều hướng giảm từ 9.63% xuống 8.87% tiếp tục tăng nồng độ enzyme bổ sung Phân tích LSD kiểm tra khác biệt nồng độ enzyme bổ sung (Phụ lục 10.2), thấy có khác nồng độ bổ sung Enzyme đóng vai trị chất xúc tác, giúp đẩy nhanh phản ứng hóa học, phân cắt liên kết giúp tăng hiệu suất thu hồi đường Khối lượng nguyên liệu sử dụng có ảnh hưởng lớn đến nồng độ enzyme bổ sung nhằm hỗ trợ trình trích ly điều tác động trực tiếp đến chất cho hoạt động enzyme Theo thầy Võ Văn Đạt (GV Sinh học), tốc độ đa số phản ứng enzyme kiểm soát bị thay đổi theo nồng độ chất, nồng độ chất tương đối thấp Khi nồng độ chất tăng nhiều tốc độ phản ứng trở nên phụ thuộc vào nồng độ chất mà lại tùy thuộc vào số lượng enzyme có mặt Vì nồng độ chất thấp, nhiều phân tử enzyme có trung tâm hoạt động tự cung cấp hạn chế chất xác định tốc độ phản ứng Ngược lại nồng độ chất cao, hầu hết trung tâm hoạt động bị chiếm lĩnh lúc số lượng phân tử enzyme lại yếu tố định phản ứng Trong hoạt động trao đổi chất tế bào, mối tương quan có tầm quan trọng phương thức kiểm soát tốc độ phản ứng khác Đối với số phản ứng nồng độ chất bình thường nhân tố quan trọng, số khác nồng độ enzyme lại có tính định Từ thấy nồng độ chất số lượng enzyme có vai trò định đến vận tốc phản ứng Từ kết khảo sát trích ly nước với tỷ lệ cỏ : nước cố định nên nồng độ enzyme bổ sung vào điều cần quan tâm khảo sát Kết khảo sát hoàn toàn tương đồng với kết khảo sát nồng độ enzyme thí nghiệm 3.3.2 với hàm lượng stevioside tổng trích ly thu cao nồng độ enzyme 1.4% So sánh với kết khảo sát nồng độ enzyme (khơng có siêu âm) hàm lượng stevioside thu khảo sát tăng lên cao Vì vậy, chúng tơi chọn nồng độ enzyme bổ sung kết hợp siêu âm 1.4% với hàm lượng stevioside tổng thu nhận 10.06% 3.5.2 Khảo sát thời gian ủ enzyme: Với thí nghiệm sau khảo sát nồng độ enzyme bổ sung trên, tiếp tục đánh giá ảnh hưởng thời gian ủ enzyme đến hiệu q trình trích ly stevioside Kết tính tốn thu trình bày bảng 3.25: Bảng 3.25: Kết khảo sát thời gian ủ enzyme Hàm lượng Thời gian (phút) stevioside tổng (%) 8.27 ± 0.07a 9.46 ± 0.11b 9.64 ± 0.07c 9.83 ± 0.1d 30 45 60 Hàm lượng Thời gian (phút) stevioside tổng 75 90 105 120 (%) 11.52 ± 0.08f 11.25 ± 0.1e 9.75 ± 0.12cd 9.62 ± 0.11bc Mẫu có chữ in thường khác khác P-value = 0.05 - kết phân tích LSD Khảo sát thời gian ủ enzyme 11.52 Hàm lượng stevioside (%) 12 10 9.46 9.64 9.83 30 45 60 11.25 9.75 9.62 105 120 8.27 0 75 90 Thời gian (phút) Hình 3.14: Ảnh hưởng thời gian ủ enzyme đến hiệu trích ly stevioside Kết phân tích phương sai ANOVA để nhận xét khác biệt mẫu với giá trị P-value < 0.05, nghĩa thời gian ủ enzyme có ảnh hưởng đến q trình trích ly stevioside tổng (Phụ lục 11.1) Khi tăng thời gian ủ từ 30 phút lên 60 phút hàm lượng stevioside trích ly tăng từ 9.46% lên 9.83% tăng mạnh thời gian ủ 75 phút với hàm lượng stevioside 11.52%, kết lớn nhiều so với mẫu trắng 8.27% tiếp tục tăng thời gian ủ lên 90 phút đến 120 phút hàm lượng stevioside giảm từ 11.25% xuống 9.62%, trình giảm mạnh từ 90 phút đến 105 phút (11.25% xuống 9.75%) Phân tích LSD kiểm tra khác biệt mẫu khảo sát thời gian ủ enzyme (Phụ lục 11.2), thấy có khác mẫu Phản ứng thủy phân xúc tác enzyme cần có khoảng thời gian tối thiểu loại enzyme Việc kéo dài thời gian cho hoạt động thủy phân cần thiết để tạo lượng sản phẩm nhiều Tuy nhiên, thời gian thủy phân kéo dài không tạo lượng sản phẩm nhiều mà lại nhiều thời gian, gây tốn lượng cho trình Qua khảo sát thực tế ta thấy thời gian ủ thủy phân để trích ly stevioside tổng đạt cao thời gian 75 phút Kết hoàn toàn tương đồng với kết khảo sát thời gian ủ enzyme thí nghiệm 3.3.4 So sánh với kết khảo sát thời gian ủ enzyme (khơng có siêu âm) hiệu trích ly đường cỏ thí nghiệm tăng cao Vì vậy, chúng tơi chọn thời gian ủ enzyme kết hợp siêu âm 75 phút với hàm lượng stevioside tổng thu nhận 11.52% 3.5.3 Tối ưu hóa q trình trích ly siêu âm enzyme: Sau tiến hành xong thí nghiệm khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến hiệu trích ly đường cỏ siêu âm enzyme, tiếp tục tiến hành quy hoạch thực nghiệm q trình trích ly siêu âm enzyme Các yếu tố từ thí nghiệm khảo sát trích ly siêu âm enzyme giá trị tâm cho thí nghiệm xác định giá trị tối ưu Thí nghiệm xác định giá trị tối ưu hai yếu tố khảo sát nồng độ enzyme bổ sung thời gian ủ enzyme Thí nghiệm thiết kế phần mềm Modde 5.0 Sử dụng phương pháp bề mặt đáp ứng RSM với mô hình bậc hai, hai yếu có tâm xoay để thiết kế thí nghiệm Yếu tố khảo sát: - Nồng độ enzyme bổ sung (%, w/w): X7 - Thời gian ủ enzyme (phút): X8 Hàm mục tiêu: hàm lượng stevioside tổng (%): Y4 (Y4 = f(X7, X8) Cực đại) Bảng 3.26: Miền biến thiên tâm quy hoạch yếu tố khảo sát Yếu tố khảo sát Nồng độ enzyme bổ sung Biến số Xi (%, w/w): X7 Thời gian ủ enzyme (phút): X8 Khoảng biến thiên Mức Tâm khảo sát Mức 0.7 1.4 2.1 60 75 90 Phương trình hồi quy có dạng: Y4 = b0 + b1X7 + b2X8 + b12X7X8 + b11X72 + b22X82 Tiến hành N thí nghiệm (N = 11) để xác định hệ số b phương trình Kết thí nghiệm khảo sát q trình trích ly siêu âm enzyme trình bày bảng 3.27: Bảng 3.27: Ma trận quy hoạch cấu trúc có tâm bậc 2, hai yếu tố kết thực nghiệm STT 10 11 Exp Name N1 N2 N3 N4 N5 N6 N7 N8 N9 N10 N11 Run Order 11 10 X7 0.7 2.1 0.7 2.1 0.4102 2.3898 1.4 1.4 1.4 1.4 1.4 X8 60 60 90 90 75 75 53.79 96.21 75 75 75 Y4 11.63 11.31 11.14 11.76 11.65 11.45 11.43 11.16 12.82 12.45 12.59 Giải toán quy hoạch thực nghiệm cho hàm mục tiêu phần phần mềm Modde 5.0, kết nhận bảng 3.28 bảng 3.29: Bảng 3.28: Ảnh hưởng biến đến hàm mục tiêu Y4 Y4 Hằng số X7 X8 X7 * X X8 * X X7 * X8 N = 11 DF = Hệ số ảnh hưởng 12.62 0.00215093 -0.0527302 -0.52569 -0.653228 0.235 Q2 = 0.832 R2 = 0.963 Sai số chuẩn 0.0930011 0.0569556 0.0569556 0.0677994 0.0677994 0.0805413 P 4.12283e-010 0.971337 0.39703 0.000570615 0.00020429 0.0330999 Kết bảng 3.28 cho thấy X7, X8 không biểu ảnh hưởng hàm mục tiêu Y4 (P > 0.05) Tuy nhiên, tương tác nồng độ enzyme bổ sung thời gian ủ enzyme ảnh hưởng có ý nghĩa với hàm Y4 Do đó, phương trình hồi quy hàm mục tiêu Y4 viết lại với yếu tố ảnh hưởng sau: Y4 = 12.62 + 0.235X7X8 - 0.5257X72 - 0.6532X82 Dựa vào mơ hình này, kết luận kết hàm Y4 (hàm lượng stevioside tổng) chịu ảnh hưởng đồng thời nồng độ enzyme bổ sung thời gian ủ enzyme (P < 0.05) Kiểm tra khả giải thích số liệu dự đốn mơ hình dựa vào hệ số R Q2 tính tốn từ mơ hình theo tác giả L.Eriksson cộng (2008): “Một mơ hình hồi quy tốt có khả dự đốn xác từ số liệu thực nghiệm Q2 > 0.5, R2 > 0.8 < ” Các giá trị đưa bảng 3.28 cho thấy Q2 R2 thỏa mãn điều kiện trên, kết hợp với giá trị P < 0.05 bảng phân tích phương sai (bảng 3.29) chúng tơi kết luận phương trình hồi quy hàm Y4 tương thích với số liệu thực nghiệm thu thập Bảng 3.29: Phân tích phương sai mơ hình hồi quy theo hàm mục tiêu Y4 Bậc tự Y4 phương bình phương 11 (SS) 1525.45 1521.98 (MS) 138.677 1521.98 10 3.46948 0.346948 5 3.33974 0.129738 0.667949 0.0259476 (DF) Tổng Hằng số Tổng hiệu chỉnh Hồi quy Phần dư Tổng bình Trung bình F P Độ lệch chuẩn 0.589023 25.7422 0.001 0.817281 0.161083 Biểu diễn phương trình hồi quy hàm Y4 theo đồ thị hình học hình 3.15: Hình 3.15: Đồ thị biểu diễn phương trình hồi quy hàm Y4: (g) Kết dự đốn hàm lượng stevioside tổng từ mơ hình theo điều kiện chọn; (h) Ảnh hưởng nồng độ enzyme bổ sung thời gian ủ enzyme đến hàm lượng stevioside trích ly X7: nồng độ enzyme bổ sung (%, w/w), X8: thời gian ủ enzyme (phút), Y4: hàm lượng stevioside tổng (%) Vùng tối ưu X7 [1.05, 1.74]; X8 [67.8, 80.9] Kết cho thấy tương tác hai yếu tố nồng độ enzyme bổ sung (%, w/w) thời gian ủ enzyme (phút) ảnh hưởng nhiều đến hàm lượng stevioside tổng (%) Tiến hành tối ưu hóa phần mềm Modde 5.0, tìm điểm tối ưu giá trị: X7 = 1.39 (%, w/w), X8 = 74.42 (phút), với hàm lượng stevioside tổng dự đoán 12.62 (%) Kiểm tra điểm tối ưu thực nghiệm với ba lần lặp kết trung bình hàm lượng stevioside tổng 12.75 ± 0.05 (%) Kết cho thấy chênh lệch kết thực kết tối ưu nhờ Modde 5.0 chênh lệch không 5% (sai số hàm lượng stevioside tổng 1.03%) Vậy hàm lượng stevioside tổng trích ly siêu âm enzyme đạt cao nồng độ enzyme bổ sung 1.39 (%, w/w) với thời gian ủ enzyme 74.42 (phút) ... stevioside tổng trích ly nước đạt cao tỉ lệ cỏ : nước : 170.63 (w/v) với thời gian trích ly 119.71 (phút) 3.3 Kết khảo sát trích ly enzyme: 3.3.1 Khảo sát lựa chọn enzyme trích ly: Dựa vào kết kết tra... chọn nhiệt độ trích ly 85oC với hàm lượng stevioside tổng trích ly thu 8.15% 3.2.3 Khảo sát thời gian trích ly: Khảo sát mốc thời gian trích ly khác thí nghiệm, từ chọn thời gian trích ly cho hàm... hưởng tỉ lệ cỏ : nước để tối ưu hóa điều kiện trích ly stevioside tổng từ ngun liệu cỏ khảo sát Vì chúng tơi cần chọn tỉ lệ cỏ : nước trích ly cho lượng nước sử dụng đạt hiệu trích ly cao mà phù