Nước thải bệnh viện là một trong những nguồn chứa trung gian quan trọng phát tán các gen đề kháng kháng sinh (Antibiotic resistant genes - ARGs) từ bệnh viện ra môi trường bên ngoài. Mục tiêu của nghiên cứu là khảo sát sự tồn tại của ARGs trong nước thải ở bệnh viện đại học Y Dược, bệnh viện Trưng Vương và bệnh viện Columbia.
KHẢO SÁT SỰ TỒN TẠI CỦA GEN ĐỀ KHÁNG KHÁNG SINH TRONG NƢỚC THẢI Ở BỆNH VIỆN TẠI TP HỒ CHÍ MINH Hồng Ngọc Hiếu, Phan Thị Thanh Tuyền, Lƣơng Thị Kiều Hải Khoa Dược, Trường Đại học Công Nghệ TP Hồ Chí Minh (HUTECH) TĨM TẮT Nước thải bệnh viện nguồn chứa trung gian quan trọng phát tán gen đề kháng kháng sinh (Antibiotic resistant genes - ARGs) từ bệnh viện môi trường bên Mục tiêu nghiên cứu khảo sát tồn ARGs nước thải bệnh viện đại học Y Dược, bệnh viện Trưng Vương bệnh viện Columbia Mỗi bệnh viện tiến hành lấy 12 mẫu tương ứng với ngày Các ARGs (aadA1, aac(3)-IV, sul1, dfrA1, ere(A), qnrA, blaSHV, blaCMY, blaCTX-M-group1, blaTEM, blaVIM-2, blaOXA-48, blaNDM-1, blaKPC-2) kiểm tra theo hướng: cô lập trực tiếp DNA từ mẫu nước thải, sau tiến hành PCR DNA cô lập để kiểm tra tồn ARGs Kết cho thấy diện gen sul1 (100%), dfrA1 (66.6%), blaSHV (8.3%), blaCTX (50%), blaKPC (33.3%), blaVIM (8.3%) bệnh viện đại học Y Dược; sul1 (100%), dfrA1 (33.3%), blaCMY (8.3%) bệnh viện Trưng Vương; sul1 (75%), dfrA1 (33.3%) bệnh viện Columbia Gen đề kháng xuất kháng sinh thông dụng Beta-lactam, Trimethoprim, Sulfonamide, đáng lưu ý Carbapenem Từ khóa: ARGs, gen đề kháng kháng sinh, kháng sinh, nước thải bệnh viện, PCR ĐẶT VẤN ĐỀ Theo báo cáo tổ chức Y tế giới WHO (2014) giám sát đề kháng kháng sinh toàn cầu, đề kháng kháng sinh mối đe dọa lớn đến sức khỏe cộng đồng liên quan sâu rộng đến nhiều quốc gia vùng lãnh thổ giới Trong 60 năm qua, việc sử dụng loại thuốc kháng khuẩn trở nên phổ biến Tuy nhiên cách sử dụng không hợp lý dẫn tới chọn lọc lây lan chủng vi sinh đề kháng Do đó, nỗ lực sử dụng hợp lý kháng sinh điều trị lâm sàng, loại thuốc kháng khuẩn đã, trở nên hiệu chí khơng cịn hiệu quả, dẫn đến tình trạng gia tăng khẩn cấp an ninh sức khoẻ toàn cầu (WHO 2014) Gần 50 năm sau thời kì hồng kim kháng sinh, tưởng chừng kiểm sốt bệnh nhiễm khuẩn lại trở thành nguyên nhân gần 16% ca tử vong toàn giới (số liệu WHO 2015) Ước tính có 25000 bệnh nhân châu Âu 23000 bệnh nhân Hoa Kỳ tử vong năm nhiễm khuẩn vi khuẩn đề kháng kháng sinh (số liệu CDC, ECDC) [12] Một kỉ nguyên hậu kháng sinh – nơi mà bệnh nhiễm trùng thơng thường vết thương nhẹ gây chết người – khơng cịn tương lại xa vời, thay vào viễn cảnh thực tế cho kỉ 21 Việt Nam CDDEP (The Center for Disease Dynamics, Economics & Policy) xếp vào nhóm nước có tỉ lệ kháng kháng sinh cao giới [5] Tình hình đề kháng kháng sinh Việt Nam theo xu hướng chung tình hình giới, tác nhân có kết đề kháng cao với kháng sinh quan trọng vi khuẩn gram âm Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter baumannii, Enterobacteriaceae, vi khuẩn gram dương MRS Tỉ lệ đề kháng cao kháng sinh thông dụng kháng sinh quan trọng điều trị nhiễm khuẩn bệnh viện cephalosporins hệ thứ thứ 4, fluoroquinolones, erythromycin, aminoglycoside, carbapenem [1-4], [7] Trong vòng khoảng thập kỉ trở lại đây, nhà nghiên cứu giới bắt đầu mở rộng trọng tâm nghiên cứu đề kháng kháng sinh mơi trường bên ngồi thay tập trung vào yếu tố lâm sàng Đối tượng nghiên cứu nguồn đất, hồ nước, nước thải, chất thải bệnh viện, khu dân cư, chất thải vật nuôi… nguồn chứa quan trọng gen kháng thuốc nơi trình đề 521 kháng xảy Cách tiếp cận cho thấy vịng lặp tác nhân nhiễm xả thải từ nguồn bệnh làm gia tăng chung mức độ đề kháng lượng gen đề kháng tự nhiên, từ lại xâm nhập lại thể người thông qua hệ vi khuẩn hội sinh vi khuẩn gây bệnh, gia tăng mức độ lây lan hiệu lực đề kháng tác nhân, làm suy giảm hiệu kháng sinh [6] Tuy nhiên, nghiên cứu đề kháng kháng sinh Việt Nam chủ yếu tiếp cận theo góc nhìn lâm sàng, đánh giá tình hình đề kháng hệ vi khuẩn bệnh viện bệnh nhân, chưa có nhiều nghiên cứu đánh giá mức độ môi trường cộng đồng, chưa có nghiên cứu đề cập đến liên hệ vi khuẩn đề kháng lâm sàng vi khuẩn đề kháng ngồi mơi trường – mà hệ thống nước thải bệnh viện bể chứa trung gian quan trọng Xuất phát từ lý đó, đề tài “Khảo sát tồn gen kháng kháng sinh nước thải số bệnh viện TP Hồ Chí Minh” thực để khảo sát mức độ tồn gen kháng thuốc hệ thống nước thải số bệnh viện TP HCM, từ bổ sung thêm liệu cho tình hình đề kháng kháng sinh gợi ý mối liên hệ vi khuẩn đề kháng lâm sàng ngồi mơi trường, góp phần hợp lý hóa việc sử dụng kháng sinh, làm chậm lại phát triển vi khuẩn kháng thuốc, bảo vệ hiệu lực kháng sinh dự trữ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tƣợng nghiên cứu Tổng số mẫu gồm 12 mẫu nước thải bệnh viện Đại học Y Dược, 12 mẫu nước thải Bệnh viện Columbia 12 mẫu nước thải Bệnh viện Trưng Vương Tại bệnh viện tiến hành lấy mẫu ngày, ngày lấy mẫu gồm: mẫu đầu vào (chưa xử lý) mẫu đầu (đã xử lý) Các mẫu nước thải o chứa chai nhựa có dung tích 500ml bảo quản điều kiện lạnh C 2.2 Tách chiết DNA DNA nước thải bệnh viện tách chiết theo phương pháp Phenol/Chloroform tham khảo từ nghiên cứu Chomczynski Sacchi (1987) [13] Mẫu nước thải lọc lấy cắn, đem ly giải tế bào o 60 C CTAB buffer, loại bỏ protein Phenol:Choloroform:Isoamylalcohol tỷ lệ 25:24:1 tủa DNA Ethanol 99% 2.3 PCR nhân theo gen mục tiêu Các gen đề kháng kháng sinh mục tiêu nhân phương pháp PCR dựa vào cặp mồi tham khảo từ nghiên cứu trình bày bảng Các gen aadA1, aac(3)-IV, sul1, dfrA1, ere(A), qnrA, blaSHV, blaCMY tham khảo từ nghiên cứu Momtaz (2012) [8] Các gen blaVIM-2, blaOXA-48, blaNDM-1, blaKPC-2 tham khảo từ nghiên cứu Poirel (2011) [10] Gen blaCTX-Mgroup tham khảo từ nghiên cứu Pitout (2004) [9] gen blaTEM tham khảo từ nghiên cứu Sharma (2010) [11] Phản ứng PCR thiết kế với chu trình luân nhiệt dựa chu trình đề nghị kit Mytaq Mix 2X Bioline Reagents Ltd với nhiệt độ bắt mồi tham khảo từ tài liệu Sản phẩm PCR sau kiểm tra gel agarose 1.5% nhuộm DNA GelRed Bảng Danh sách trình tự ARGs Kích thƣớc sp (bp) Kháng sinh Gen đề kháng Streptomycin aadA1 (F) TATCCAGCTAAGCGCGAACT (R) ATTTGCCGACTACCTTGGTC 447 Gentamycin aac(3)-IV (F) CTTCAGGATGGCAAGTTGGT (R) TCATCTCGTTCTCCGCTCAT 286 Sulfonamide sul1 (F) TTCGGCATTCTGAATCTCAC (R) ATGATCTAACCCTCGGTCTC 822 Trimethoprim dfrA1 (F) GGAGTGCCAAAGGTGAACAGC (R) GAGGCGAAGTCTTGGGTAAAAAC 367 522 Trình tự gen Nhiệt độ bắt cặp (°C) 58 55 47 45 Kháng sinh Gen đề kháng Erythromycin ere(A) Quinolones qnrA Beta-lactams Kích thƣớc sp (bp) Trình tự gen (F) GCCGGTGCTCATGAACTTGAG (R) CGACTCTATTCGATCAGAGGC 419 (F) GGGTATGGATATTATTGATAAAG (R) CTAATCCGGCAGCACTATTTA 670 blaSHV (F) TCGCCTGTGTATTATCTCCC (R) CGCAGATAAATCACCACAATG 768 blaCMY (F) TGGCCAGAACTGACAGGCAAA (R) TTTCTCCTGAACGTGGCTGGC 462 (F) GACGATGTCACTGGCTGAGC (R) AGCCGCCGACGCTAATACA 499 blaTEM (F) AAAATTCTTGAAGACG (R) TTACCAATGCTTAATCA 1080 blaVIM-2 (F) GATGGTGTTTGGTCGCATA (R) CGAATGCGCAGCACCAG 390 blaOXA-48 (F) GCGTGGTTAAGGATGAACAC (R) CATCAAGTTCAACCCAACCG 438 blaNDM-1 (F) GGTTTGGCGATCTGGTTTTC (R) CGGAATGGCTCATCACGATC 621 blaKPC-2 (F) CGTCTAGTTCTGCTGTCTTG (R) CTTGTCATCCTTGTTAGGCG 798 blaCTX-Mgroup Carbapenem Nhiệt độ bắt cặp (°C) 52 50 47 52 55 50 52 52 52 52 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1 Bệnh Viện Đại học Y Dƣợc Sản phẩm PCR 12 mẫu nước thải bệnh viện Đại học Y Dược kiểm tra phương pháp điện di gel agarose 1,5% cho băng sản phẩm rõ (dương) chứng tỏ đoạn gen nhân đặc hiệu Trong 14 gen tiến hành, có gen có xuất kết dương tính (sul1; dfrA1; blaSHV; blaCTX; blaKPC; blaVIM) gen có kết tồn mẫu âm tính (aadA1; aac(3); ere(A); qnrA; blaCMY, blaTEM; blaOXA; blaNDM) Trong mẫu dương tính chiếm tỉ lệ với gen là: sul1 100%, dfrA1 66.6%, blaSHV 8.3%, blaCTX 50%, blaKPC 33.3 %, blaVIM 8.3% Các mẫu dương tính đầu chiếm tỉ lệ 23,6% tổng tất mẫu dương tính (17/72 mẫu) Kết điện di mẫu dương tính đại diện hình 1, hình 2, hình 3, hình 4, hình 5, hình Nghiên cứu 12 mẫu gen cho kết dương tính tổng hợp Bảng Bảng 2: Nghiên cứu 12 mẫu nước thải gen cho kết dương tính Bệnh viện Đại học Y Dược TP HCM Mẫu A1 V A1 R A2 V A2 R A3 V A3 R A4 V A4 R A5 V A5 R A6 V A6 R Sulfonamide sul1 + + + + + + + + + + + + Trimethoprim dfrA1 + + - + - + + + - - + + blaSHV - - - - - - - - - - + - blaCTX-M - + - + - + + + - - + - blaVIM-2 - - - - - - + - - - - - blaKPC-2 + - - + - - - - - - + + Beta-lactams Carbapenem Chú thích: A: bệnh viện Đại học Y Dược | 1, 2, 3, 4, 5, 6: mẫu ngày 1, 2, 3, 4, 5, | V: đầu vào ; R: đầu 523 Hình 1: Kết điện di dương tính gen sul1 Hình 2: Kết điện di dương tính gen dfrA1 Hình 3: Kết điện di dương tính gen blaKPC Hình 4: Kết điện di dương tính gen blaVIM Hình 5: Kết điện di dương tính gen blaCTX Hình 6: Kết điện di dương tính gen blaSHV 524 3.2 Bệnh Viện Trƣng Vƣơng Sản phẩm PCR 12 mẫu nước thải bệnh viện Trưng Vương kiểm tra phương pháp điện di gel agarose 1,5% cho băng sản phẩm rõ (dương) chứng tỏ đoạn gen nhân đặc hiệu Trong 14 gen tiến hành, có gen có xuất kết dương tính (sul1; dfrA1; blaCMY) 11 gen có kết tồn mẫu âm tính (aadA1; aac(3); ere(A); qnrA; blaTEM; blaCTX; blaOXA; blaNDM; blaSHV; blaKPC; blaVIM) Trong mẫu dương tính chiếm tỉ lệ với gen là: sul1 100%, dfrA1 33.3%, blaCMY 8.3% Các mẫu dương tính đầu chiếm tỉ lệ 22.2% tổng tất mẫu dương tính (8/36 mẫu) Kết điện di kết dương tính đại diện hình7, hình 8, hình Nghiên cứu 12 mẫu gen cho kết dương tính tổng hợp Bảng Bảng Nghiên cứu 12 mẫu nước thải gen cho kết dương tính bệnh viện Trưng Vương Mẫu B1 V B1 R B2 V B2 R B3 V B3 R B4 V B4 R B5 V B5 R B6 V B6 R Sulfonamide sul1 + + + + + + + + + + + + Trimethoprim dfrA1 - - - - + + - - - - + + Beta-lactams blaCMY - - - - - - - - - - + - Chú thích: B: bệnh viện Trưng Vương | 1, 2, 3, 4, 5, 6: mẫu ngày 1, 2, 3, 4, 5, | V: đầu vào ; R: đầu Hình Kết điện di dương tính gen sul1 Hình Kết điện di dương tính gen dfrA1 Hình Kết điện di dương tính gen blaCMY 525 3.4 Bệnh Viện Quốc tế Columbia Sản phẩm PCR 12 mẫu nước thải bệnh viện Quốc tế Columbia kiểm tra phương pháp điện di gel agarose 1,5% cho băng sản phẩm rõ (dương) chứng tỏ đoạn gen nhân đặc hiệu Trong 14 gen tiến hành, có gen có xuất kết dương tính (sul1; dfrA1) 12 gen có kết tồn mẫu âm tính (aadA1; aac(3); ere(A); qnrA; blaTEM; blaCTX; blaOXA; blaNDM; blaSHV; blaKPC; blaVIM; blaCMY ) Trong mẫu dương tính chiếm tỉ lệ với gen là: sul1 75%, dfrA1 33.3% Các mẫu dương tính đầu chiếm tỉ lệ 12.5% tổng tất mẫu dương tính (3/24 mẫu) Kết điện di kết dương tính đại diện hình 10, hình 11 Nghiên cứu 12 mẫu gen cho kết dương tính tổng hợp Bảng Bảng Nghiên Nghiên cứu 12 mẫu nước thải gen cho kết dương tính bệnh viện Quốc tế Columbia Mẫu C1 V C1 R C2 V C2 R C3 V C3 R C4 V C4 R C5 V C5 R C6 V C6 R Sulfonamide sul1 + + + - + + + - + - + + Trimethoprim dfrA1 + - + - + - - - - - + - Chú thích: C: bệnh viện Columbia | 1, 2, 3, 4, 5, 6: mẫu ngày 1, 2, 3, 4, 5, | V: đầu vào ; R: đầu Hình 10: Kết điện di dương tính gen sul1 Hình 11: Kết điện di dương tính gen dfrA KẾT LUẬN Kết ban đầu cho thấy tỷ lệ diện ARGs cao với nhóm kháng sinh thông dụng Beta-lactam, Trimethoprim, đặc biệt Sulfonamide với gen đề kháng sul1 diện 100% mẫu hai bệnh viện Đại học Y dược Trưng Vương Gen đề kháng Carbapenem (blaVIM-2 blaKPC-2) xuất mẫu bệnh viện Đại học Y dược kết đáng lưu ý nhóm kháng sinh quan trọng, sử dụng để điều trị nhiễm trùng vi khuẩn gram âm đa kháng bệnh viện Kết bước đầu cho thấy quy trình khảo sát diện ARGs mẫu nước thải bệnh viện nhóm nghiên cứu phù hợp, tiếp tục mở rộng nghiên cứu cho ARGs khác bệnh viện khác Nhóm nghiên cứu chân thành cảm ơn hướng dẫn thầy Ds Nguyễn Minh Quân TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Cao Minh Nga (2013), "Sự đề kháng kháng sinh vi khuẩn klebsiella spp Và e Coli sinh ESBL phân lập bệnh viện 175", Y Học TP Hồ Chí Minh 17 (1), pp 280-285 [2] Nguyễn Phú Hương Lan (2012), "Khảo sát mức độ đề kháng kháng sinh Acinetobacter Pseudomonas phân lập bệnh viện bệnh Nhiệt đới năm 2010", THỜI SỰ Y HỌC 68 526 [3] Phạm Hùng Vân (2010) "Nghiên cứu đa trung tâm tình hình đề kháng imipenem meropenem trực khuẩn gram âm dễ mọc kết 16 bệnh viện Việt Nam" [4] Bộ Y Tế (2009), Báo cáo sử dụng kháng sinh kháng kháng sinh 15 bệnh viện Việt Nam năm 2008-2009, Dự án Hợp tác toàn cầu kháng kháng sinh GARP Việt Nam Đơn vị Nghiên cứu Lâm sàng ĐH Oxford [5] Antibiotic Resistance, https://resistancemap.cddep.org/AntibioticResistance.php, ngày truy cập 1106-2018 [6] Czekalski N et al (2014), "Wastewater as a point source of antibiotic-resistance genes in the sediment of a freshwater lake", Isme j (7), pp 1381-1390 [7] Kim S H et al (2012), "Changing trends in antimicrobial resistance and serotypes of Streptococcus pneumoniae isolates in Asian countries: an Asian Network for Surveillance of Resistant Pathogens (ANSORP) study", Antimicrob Agents Chemother 56 (3), pp 1418-1426 [8] Momtaz H et al (2012), Molecular detection of antimicrobial resistance genes in E Coli isolated from slaughtered commercial chickens in Iran, Vol 57 [9] Pitout J D D et al (2004), "Phenotypic and Molecular Detection of CTX-M-β-Lactamases Produced by Escherichia coli and Klebsiella spp", Journal of Clinical Microbiology 42 (12), pp 5715-5721 [10] Poirel L et al (2011), "Multiplex PCR for detection of acquired carbapenemase genes", Diagn Microbiol Infect Dis 70 (1), pp 119-123 [11] Sharma J et al (2010), "Detection of TEM & SHV genes in Escherichia coli & Klebsiella pneumoniae isolates in a tertiary care hospital from India", Indian J Med Res 132, pp 332-336 [12] Carlet J (2014), "Antibiotic resistance: Protecting antibiotics - the declaration of the world alliance against antibiotic resistance", Indian Journal of Critical Care Medicine : Peer-reviewed, Official Publication of Indian Society of Critical Care Medicine 18 (10), pp 643-645 [13] Chomczynski P et al (1987), "Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction", Anal Biochem 162 (1), pp 156-159 doi: 110.1006/abio.1987.9999 527 ... thống nước thải bệnh viện bể chứa trung gian quan trọng Xuất phát từ lý đó, đề tài ? ?Khảo sát tồn gen kháng kháng sinh nước thải số bệnh viện TP Hồ Chí Minh? ?? thực để khảo sát mức độ tồn gen kháng. .. Cao Minh Nga (20 13) , "Sự đề kháng kháng sinh vi khuẩn klebsiella spp Và e Coli sinh ESBL phân lập bệnh viện 175", Y Học TP Hồ Chí Minh 17 (1), pp 280-285 [2] Nguyễn Phú Hương Lan (2012), "Khảo sát. .. thống nước thải số bệnh viện TP HCM, từ bổ sung thêm liệu cho tình hình đề kháng kháng sinh gợi ý mối liên hệ vi khuẩn đề kháng lâm sàng ngồi mơi trường, góp phần hợp lý hóa việc sử dụng kháng sinh,