KHẢO SÁT SỰ TỒN DƯ CỦA MỘT SỐ KHÁNG SINH TRONG THỊT HEO

TÓM TẮT Đề tài nghiên cứu “Khảo sát sự tồn dư của một số kháng sinh trong thịt heo” được tiến hành tại các lò mổ ở thành phố Hồ Chí Minh, các tỉnh Tiền Giang, Long An, Bình Dương, Đồng N

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHOA CHĂN NUÔI THÚ Y

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

KHẢO SÁT SỰ TỒN DƯ CỦA MỘT SỐ KHÁNG SINH TRONG

THỊT HEO

HỌ VÀ TÊN SINH VIÊN : PHẠM CHÂU GIANG NGÀNH : THÚ Y

LỚP : DH04TY NIÊN KHÓA : 2004 – 2009

Năm 2009

KHẢO SÁT SỰ TỒN DƯ CỦA MỘT SỐ KHÁNG SINH TRONG THỊT HEO

XÁC NHẬN CỦA GIÁO VIÊN HƯỚNG DẪN

Họ và tên sinh viên thực tập: Phạm Châu Giang

Tên luận văn:

“ KHẢO SÁT SỰ TỒN DƯ CỦA MỘT SỐ KHÁNG SINH TRONG THỊT HEO”

Đã hoàn thành luận văn theo đúng yêu cầu của giáo viên hướng dẫn và các ý kiến nhận xét đóng góp của Hội đồng giám khảo ngày 24/07/2009

Giáo viên hướng dẫn

TS Võ Thị Trà An

LỜI CẢM TẠ

Chân thành cảm tạ:

- Ban Giám hiệu trường Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh

- Ban Chủ nhiệm khoa Chăn nuôi - Thú y

- Bộ môn Dược lí - Sản khoa

- Quý thầy cô khoa Chăn nuôi - Thú y

Đã dạy bảo và tạo những điều kiện học tập tốt nhất cho chúng tôi trong nhưng năm học tại trường

Chân thành ghi ơn:

- TS Võ Thị Trà An đã tận tình chỉ bảo cho tôi để tôi có thể hoàn thành tốt luận văn

- Bác sĩ thú y Trần Thị Mai Anh Đào đã giúp đỡ tôi trong thời gian thực tập

Chân thành cảm ơn:

- Ban lãnh đạo Trung tâm Kiểm tra Vệ sinh Thú y Trung ương II

- Các anh chị của Trung tâm Kiểm tra Vệ sinh Thú y Trung ương II

Đã nhiệt tình giúp đỡ, truyền đạt kinh nghiệm cho tôi trong thời gian thực tập tại Trung tâm

Xin cảm ơn bạn bè trong và ngoài lớp đã chia sẻ những khó khăn, giúp đỡ tôi trong quãng đời sinh viên

Phạm Châu Giang

TÓM TẮT

Đề tài nghiên cứu “Khảo sát sự tồn dư của một số kháng sinh trong thịt heo” được tiến hành tại các lò mổ ở thành phố Hồ Chí Minh, các tỉnh Tiền Giang, Long An, Bình Dương, Đồng Nai và Trung tâm Kiểm tra Vệ sinh Thú y Trung Ương II, thời gian từ tháng 3 đến tháng 7/2009

Kết quả thu được:

- Tỉ lệ các mẫu có tồn dư các kháng sinh là 100 %, 12,5 % và 77,77 % cho chloramphenicol, sulfamethazine và tetracycline Trong đó mẫu vượt mức quy định cho phép là 100 %, 12,5 % và 0 % cho chloramphenicol, sulfamethazine

và tetracycline

- Trong các địa phương khảo sát, Đồng Nai là địa phương có tình hình nghiêm trọng nhất Tại Đồng Nai có 77,77 % số mẫu có hiện tượng tồn dư và 44,44 %

số mẫu tồn dư vượt mức giới hạn

- Số mẫu vi phạm về tồn dư chloramphenicol là 18/18 mẫu khảo sát, trong đó có

16 mẫu có hàm lượng dưới 0,1 ppb, chỉ có 2 mẫu trên 0,1 ppb nhưng vẫn dưới 0,2 ppb Số mẫu tồn dư sulfamethazine là 2/16 mẫu, trong số đó có một mẫu vượt MRL (giới hạn tồn dư tối đa) đến 4 lần (409,12 ppb so với 100 ppb) Trong các mẫu tồn dư tetracycline (14/18 mẫu khảo sát), có 9 mẫu có hàm lượng dưới 10 ppb, 5 mẫu từ 50 - 100 ppb

- Đặc biệt là có 2 mẫu tồn dư cả 3 loại kháng sinh và đã vượt MRL đối với chloramphenicol và sulfamethazine

2.2.2 Một số thông số dược động học của kháng sinh 5

2.3.3 Sử dụng kháng sinh an toàn và hiệu quả 10

2.3.4.1 Các nguyên nhân dẫn đến tai biến 10

2.3.4.2 Các biểu hiện độc 11

2.4.1 Chloramphenicol 11

2.5.1 Khái niệm chất tồn dư 18

2.5.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến tồn dư kháng sinh 18

2.5.4 Các phương pháp khắc phục tồn dư kháng sinh 21

2.6 Các phương pháp xác định tồn dư kháng sinh trong thực phẩm 21

2.6.1 Phương pháp vi sinh vật (FPT- Four Plate Test) 21

SƠ LƯỢC MỘT SỐ CÔNG TRÌNH NGHIÊN CỨU LIÊN QUAN 28

Chương 3 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM 29

3.1.2 Địa điểm 29

3.2 Vật liệu, hóa chất, trang thiết bị, dụng cụ thí nghiệm 29

3.2.1 Vật liệu 29 3.2.2 Hóa chất 29

3.2.3 Thiết bị 38 3.2.4 Trang phục phòng hộ cho người làm thí nghiệm 38

3.4.1 Cách lấy mẫu và bảo quản mẫu 38

3.4.2 Bố trí mẫu xét nghiệm 38

TÀI LIỆU THAM KHẢO 51

PHỤ LỤC 53

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT

EDTA : Ethylene Diamine Tetraacetic Acid

EIA : Enzyme Immuno Assay - Phương pháp miễn dịch enzyme

ELISA : Enzyme linked immunosorbent assay - Phương pháp miễn dịch có gắn enzyme

FPT : Four Plate Test - Phương pháp vi sinh vật

GC - MS : Gas Chromatography - Mass Spectrometry - Sắc kí khí - khối phổ

HIV : Human Immunodeficiency Virus - Virus gây suy giảm miễn dịch trên người

HPLC : High Pressure Liquid Chromatography - Phương pháp sắc kí lỏng cao áp

ppb : part per billion - một phần tỉ

RIA : Radio ImmunoAssay - Phương pháp miễn dịch phóng xạ

SPE : Solid Phase Extraction - Li trích pha rắn

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Hình 2.1 Cấu trúc hóa học của chloramphenicol 12

Hình 2.4 Đĩa plastic trong xét nghiệm ELISA để chẩn đoán HIV 24

DANH SÁCH CÁC BẢNG

Bảng 2.1 Tổng đàn heo tại 5 tỉnh thành (con) từ năm 2001 đến năm 2005 3

Bảng 2.2 Tổng đàn heo tại 5 tỉnh thành (con) trong năm 2007 4

Bảng 2.3 Mười quốc gia có tổng đàn heo lớn nhất thế giới 5

Bảng 2.4 Các thông số dược động học của 3 kháng sinh khảo sát 8

Bảng 3.1 Phản ứng chéo của kháng huyết thanh chloramphenicol với các kháng sinh

Bảng 4.1 Tỉ lệ mẫu thịt heo có tồn dư kháng sinh 43

Bảng 4.2 Bảng quy định MRL trong thịt heo của 3 kháng sinh 43

Bảng 4.3 Tỉ lệ phần trăm các mẫu tồn dư vi phạm và không vi phạm theo nguồn

gốc 45

Bảng 4.4 Tần suất phân bố mức độ tồn dư chloramphenicol trong thịt heo 47

Bảng 4.5 Tần suất phân bố mức độ tồn dư tetracycline trong thịt heo 47

Tuy nhiên, tình hình sử dụng kháng sinh trong chăn nuôi hiện nay rất khó kiểm soát Người chăn nuôi thường không sử dụng kháng sinh một cách hợp lí Đồng thời, các nhà sản xuất vẫn thường trộn kháng sinh trong thức ăn để giúp thú nuôi tăng trọng nhanh Điều này rất dễ dẫn đến tình trạng tồn dư kháng sinh trong sản phẩm động vật,

mà cụ thể ở đây là thịt heo

Tình trạnh tồn dư kháng sinh trong sản phẩm gây ra những ảnh hưởng có hại đến chất lượng của sản phẩm và cho sức khỏe người tiêu dùng như tình trạng ngộ độc hoặc dị ứng ngay cả đối với hàm lượng thấp, cản trở các quá trình chế biến các sản phẩm thứ cấp như yaourt, pho mát

Do đó, việc kiểm soát kháng sinh trong sản phẩm động vật là một vấn đề rất cần thiết Từ những vấn đề trên, dưới sự hướng dẫn của TS Võ Thị Trà An, BSTY Trần Thị Mai Anh Đào, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài “Khảo sát sự tồn dư một số loại kháng sinh trong thịt heo” Đề tài là một phần của chương trình “Kiểm tra giám sát ô nhiễm vi sinh vật và hóa chất tồn dư trong thịt gia súc gia cầm” do Trung tâm kiểm tra

vệ sinh thú y trung ương II làm chủ quản

2 Mục đích và yêu cầu

2.1 Mục đích:

- Khảo sát sự tồn dư của 3 loại kháng sinh sulfamethazine, tetracycline và chloramphenicol trong thịt heo

- Phát hiện và khuyến cáo nguy cơ tồn dư kháng sinh trong thịt heo và đề ra các biện pháp khắc phục

2.2 Yêu cầu:

- Định tính và định lượng sự tồn dư kháng sinh trong thịt heo tại các lò giết mổ

Chương II

TỔNG QUAN

2.1 TÌNH HÌNH CHĂN NUÔI HEO Ở VIỆT NAM

Trong những năm vừa qua, chăn nuôi heo tại Việt Nam đang ngày càng phát triển, cung cấp một lượng lương thực đáng kể cho người dân Từ năm 2000 đến 2005 đàn heo Việt Nam đã tăng trưởng với tốc độ bình quân 5%/năm Từ 21,8 triệu con năm

2000, đến 2005 đàn heo của Việt Nam đã tăng lên 27,1 triệu con Việt Nam đứng vững

ở vị trí thứ 4 trên thế giới về tổng đàn heo, chỉ sau Trung Quốc, Mỹ và Brazil

Theo cục Chăn nuôi Việt Nam, đàn heo tại 5 tỉnh thành Tiền Giang, Long An, Bình Dương, Đồng Nai và Tp Hồ Chí Minh đã được ghi nhận trong bảng 2.1

Bảng 2.1 Tổng đàn heo tại 5 tỉnh thành (con) từ năm 2001 đến 2005 (Cục Chăn nuôi,

2009)

Năm Địa phương

2007 đã là hơn hai triệu rưỡi, chiếm 9,8% tổng đàn heo trong nước Trong 5 tỉnh thì Đồng Nai giữ vai trò lớn nhất với 1,1 triệu con

Theo hội nghị tổng kết chăn nuôi toàn quốc giai đoạn 2001 – 2005 diễn ra vào ngày 5 và 6 tháng 6 năm 2006, tốc độ tăng trưởng của ngành chăn nuôi heo luôn đạt mức cao, chất lượng giống, kỹ thuật chăn nuôi heo đã được cải thiện Phương thức chăn nuôi trang trại phát triển nhanh về số lượng và quy mô Công nghiệp chế biến thức ăn chăn nuôi phát triển nhanh Tuy nhiên, ngành chăn nuôi, trong đó có chăn nuôi heo về cơ bản vẫn là quy mô nhỏ, phân tán và tận dụng; tính bền vững chưa cao; chăn nuôi trang trại vẫn mang tính tự phát, thiếu quy hoạch và việc quản lý, kiểm soát chất lượng giống vật nuôi, thức ăn chăn nuôi còn nhiều yếu kém, bất cập Giai đoạn

2006 - 2015,chăn nuôi heo công nghiệp được tập trung duy trì và phát triển bền vững

Bàng 2.2 Tổng đàn heo tại 5 tỉnh thành trong năm 2007 (Cục Chăn nuôi, 2009)

Heo Trong nhà Địa phương Tổng số

(con)

Nái (con)

Thịt (con)

Số heo thịt xuất chuồng (con)

Sản lượng thịt hơi xuất chuồng (tấn)

Bảng 2.3 Mười quốc gia có tổng đàn heo lớn nhất thế giới

(http://www.pig-international.com)

2.2 KHÁI QUÁT VỀ KHÁNG SINH

2.2.1 Khái niệm về kháng sinh

Thuốc kháng sinh là tất cả những chất hoá học, không kể nguồn gốc (chiết xuất

từ môi trường nuôi cấy vi sinh vật, bán tổng hợp hay tổng hợp) có khả năng kìm hãm

sự phát triển của vi khuẩn (bacteriostatic) hoặc tiêu diệt vi khuẩn (bactericidal) bằng cách tác động chuyên biệt trên một giai đoạn chuyển hoá cần thiết của chúng (Võ Thị Trà An, 2007)

2.2.2 Một số thông số dược động học của kháng sinh (Richard, 1995): 2.2.2.1 Thể tích phân bố (Vd)

Thể tích phân bố (volume of distribution, Vd) là thông số định lượng sự phân

bố của thuốc khắp cơ thể sau khi uống hoặc tiêm Vd được định nghĩa là thể tích cần

để chứa một lượng thuốc cho sự phân bố đồng đều trong cơ thể ở một nồng độ đo được tại huyết tương Thông số này được biểu thị bằng ml/kg hay L/kg thể trọng Công thức để tính Vd đối với thuốc tiêm tĩnh mạch:

Hiểu biết về thể tích phân bố có liên quan đến việc tính toán liều dùng để đạt được nồng độ thuốc cần thiết trong huyết tương (Cp)

Liều = Cp x Vd

(mg/kg) (mg/L) (L/kg)

Một loại thuốc có Vd lớn đặc biệt có sự phân tán mô tốt trong cả cơ thể (tetracyclines), trong khi thuốc có Vd nhỏ có khả năng thẩm thấu vào mô cơ thể yếu hơn, có thể bị giới hạn ở vùng ngoại bào vì một hay vài đặc tính lý hóa của nó (không hòa tan lipid)

Trong trường hợp này, thuốc có thể tìm đến tế bào hay cơ quan cụ thể hay bị buộc vào những phân tử lớn của mô, tạo ra kết quả Vd lớn nhưng lại có sự phân tán yếu nói chung trong phần lớn mô của cơ thể Một vài loại thuốc có thể có thời gianngưng thuốc lâu vì Vd lớn

2.2.2.3 Thời gian bán thải (t 1/2 ):

Bán thải của một loại thuốc hay chất hóa học trong cơ thể là cách thức đo lường

về mặt sinh học quan trọng nhất được sử dụng để xác định thời gian ngưng thuốc hay chất hóa học trong động vật lấy thịt

Thời gian bán thải là thông số chỉ thời gian cần thiết (tính bằng giờ) để cơ thể loại thải một nửa lượng thuốc khỏi cơ thể, kí hiệu bằng t1/2 t1/2 được xác định một cách đơn giản bằng việc tìm ra thời gian mà nồng độ thuốc trong huyết tương giảm 50% trong đồ thị nồng độ thuốc trong huyết thanh qua thời gian t1/2 quan trọng trong việc xác định nhịp cấp thuốc để đảm bảo nồng độ trị liệu trong thời gian cần thiết

t1/2 = ln 2 × hoặc t1/2 = 0.693 ×

Vài yếu tố sinh lý có thể xảy ra làm thay đổi Vd hoặc Cl và do đó, có thể ảnh hưởng đến t1/2 trong cơ thể Ví dụ, nếu chức năng thận bị suy yếu, độ thanh thải của thuốc có thể giảm và t1/2 kéo dài khoảng vài giờ hoặc vài ngày, đồng thời cũng kéo dài thời gian ngưng thuốc Nếu cân bằng dịch của động vật thay đổi, Vd có thể thay đổi theo Những nhân tố như tuổi, tình trạng dinh dưỡng, tỷ lệ chất béo trong cơ thể, loài,

sự có mặt của các loại thuốc khác, quy mô của ràng buộc protein đều có vai trò quan trọng trọng quyết định Vd và Cl và theo đó t1/2 của bất kỳ thuốc nào trong cơ thể

kể tồn dư theo góc nhìn của chất độc), và sức chịu đựng tạm thời (tồn tại trong một thời gian giới hạn và được xem xét lại sau này)

2.2.2.5 Thời gian ngưng thuốc:

Về mặt lý thuyết, nếu biết được khả năng chịu đựng của mô và liều dùng, kĩ thuật dược động có thể được dùng để tính toán thời gian ngưng thuốc của từng cá thể Đối với thuốc uống, điều này yêu cầu hiểu biết về phần được hấp thụ vào cơ thể (như sinh khả dụng) của liều cấp Lượng này là nồng độ ban đầu của thuốc trong cơ thể (C0) được chia bởi Vd Nếu giả sử rằng sự tiêu hao của thuốc trong cơ thể chỉ phụ thuộc vào thời gian nhưng thuốc cuối cùng thì

Thời gian ngưng thuốc = 1.44 ln (C0/sức chịu đựng)(t1/2)

Giả thiết rằng phần lớn kháng sinh trong một nồng độ thuốc chữa bệnh là 10µg/ml và sức chịu đựng của mô là 0.01 ppm (0.01 µg/ml) Cũng cần giả sử rằng thuốc phân tán đều khắp trong cơ thể Khi đó, thời gian ngưng thuốc bằng 1.44 × ln(10/0.01) × t1/2, hay 9.94 t1/2 Thời gian nhưng thuốc của thuốc này sẽ là 10 bán thải

Nếu thuốc có bán thải ngắn (penicillin), thời gian nhưng thuốc ngắn Tuy nhiên, nếu thuốc có bán thải của mô dài (aminoglycoside), thời gian ngưng thuốc có thể kéo dài đến một năm trong mô đích Tương tự, thuốc có sức chịu đựng của mô thấp có thời gian ngưng thuốc lâu hơn vì ln(C0/sức chịu đựng) lớn hơn Nếu thuốc được chuyển hóa, chất chuyển hóa có thể quyết định thời gian ngưng thuốc (tồn dư đánh dấu) khi bán thải của nó thì giới hạn tốc độ

“Quy tắc 10” có thể được rút ra bằng cách giả sử rằng 10 bán thải là cần thiết để bài tiết 99.9% của một liều chỉ định

Nếu gấp đôi liều, thời gian ngưng thuốc sẽ tăng lên chỉ một bán thải Tuy vậy, nếu một quy trình bệnh thay đổi bán thải bằng cách tăng lượng phân tán hay giảm sức chịu đựng (bệnh thận) khiến cho bán thải gấp đôi, thì thời gian ngưng thuốc cũng sẽ gấp đôi

Bảng 2.4 Các thông số dược động học của 3 kháng sinh khảo sát (Richard, 1995):

Thuốc Liều

(mg/kg)

Đường cấp

Thời gian bán thải

(giờ)

Thể tích phân

bố (L/kg)

Việc sử dụng kháng sinh trước tiên phải dựa vào kết quả chẩn đoán bệnh, tức là kết quả xác định vi khuẩn gây bệnh và tính nhạy cảm của một hay nhiều vi khuẩn gây

bệnh đối với một kháng sinh Để việc điều trị hợp lí và hiệu quả, bác sĩ thú y cần (1) chẩn đoán loại nhiễm trùng; (2) gửi mẫu xét nghiệm nếu có thể; (3) ước đoán về vi khuẩn gây bệnh dựa trên các dấu hiệu lâm sàng hoặc kết quả nhuộm bệnh phẩm; (4) xác định sự cần thiết của liệu pháp kháng sinh; (5) bắt đầu một liệu pháp điều trị thích hợp

Kháng sinh sát khuẩn chỉ nên chỉ định (1) trong những nhiễm khuẩn đe dọa đến tính mạng; (2) khi hệ thống phòng vệ của cơ thể bị hư hỏng, suy giảm miễn dịch; (3) trong các nhiễm trùng tại các mô thiết yếu của cơ thể như là não, tim, và xương nơi mà

hệ thống phòng vệ của cơ thể hoạt động không hoàn hảo

2.3.2 Nguyên tắc của liệu pháp kháng sinh:

Một khi đã quyết định phải có liệu pháp kháng sinh cho việc điều trị, kháng sinh cần được nhanh chóng sử dụng để tránh sự phát tán mầm bệnh Kháng sinh cần đạt được nồng độ trị liệu tại vị trí nhiễm trùng và không làm tổn hại đến mô của con vật

Như vậy nồng độ kháng sinh phải đủ mạnh để ức chế hoặc tiêu diệt vi khuẩn Kháng sinh sẽ được dùng với liều khởi đầu bằng liều có hiệu lực (tương đối cao) và tiếp theo là liều duy trì (bằng hoặc thấp hơn liều khởi đầu)

Kháng sinh thường được khuyến cáo sử dụng trong một khoảng liều dùng nhất định (mức trên và mức dưới) Cần lưu ý rằng liều dùng không nên vượt quá mức trên hoặc thấp hơn mức dưới vì sẽ dẫn tới việc ngộ độc hoặc không hiệu quả Thời gian và nhịp cấp thuốc sẽ ảnh hưởng đáng kể đến hiệu quả của liệu pháp kháng sinh cũng như các nguy cơ về độc tính cho con vật, tồn dư kháng sinh trong mô và sản phẩm của chúng cũng như vấn đề đề kháng kháng sinh của vi khuẩn Liệu pháp kháng sinh cần

đủ lâu Dù không có con số chung về thời gian bao lâu chúng ta phải đảm bảo duy trì nồng độ kháng sinh có hiệu lực cho các trường hợp nhiễm trùng, chúng ta có thể thấy

rõ liệu pháp kháng sinh có hiệu quả hay không trong vòng 2 ngày Nếu không có đáp ứng nào của cơ thể thú trong thời gian này thì chẩn đoán và phác đồ trị liệu cần phải được xem xét lại Phải tiếp tục cung cấp kháng sinh cho những nhiễm trùng cấp tính

trong ít nhất 2 ngày kể từ khi hết các triệu chứng lâm sàng Với các nhiễm trùng cấp tính và nghiêm trọng, thời gian này có thể kéo dài từ 7-10 ngày Với nhiễm khuẩn mãn tính hoặc nhiễm trùng nội tế bào, thời gian đảm bảo nồng độ trị liệu của kháng sinh trong mô có thể lên hàng tháng

2.3.3 Sử dụng kháng sinh an toàn và hiệu quả:

Chỉ sử dụng kháng sinh khi có nhiễm khuẩn hoặc phòng nhiễm khuẩn Chọn đúng kháng sinh với dạng bào chế thích hợp Dùng đủ liều và đủ thời gian quy định Biết cách phối hợp kháng sinh Tuân thủ nghiêm ngặt các chống chỉ định của kháng sinh, thời gian ngừng thuốc trước khi giết mổ Điều chỉnh liều dùng đối với thú bị bệnh gan, thận, thú mang thai, gia súc non Theo dõi những phản ứng phụ trong quá trình sử dụng thuốc và chuẩn bị các biện pháp xử trí các tai biến (Trần Thị Mai Anh Đào, 2008)

Loại bỏ các tổ chức mô hư hỏng, loại bỏ ổ mủ, đặt ống dẫn lưu cho các áp xe, loại bỏ những vật thể ngoại lai, điểu chỉnh cân bằng acid base và nước, chăm sóc và tạo đủ điều kiện dinh dưỡng cũng như nghỉ ngơi Cân nhắc về giá trị của con thú cũng như chi phí điều trị Đối với thú dùng sản xuất thực phẩm cho người, cần phải đảm bảo các qui định tồn dư kháng sinh trong các sản phẩm (trứng, sữa, thịt) Ngoài ra các nguy cơ về việc tạo áp lực chọn lọc kháng sinh đối với các vi khuẩn đề kháng cũng cần được quan tâm

Corticosteroid tác động đến hệ thống miễn dịch của cơ thể như giảm phản ứng viêm, hư hỏng quá trình thực bào, chậm lành vết thương, giảm sốc và che lấp triệu chứng Do đó chỉ nên sử dụng corticoseroid ngắn hạn (3-5 ngày) trong một số trường hợp như nhiễm trùng huyết nguy hiểm đến tính mạng kèm choáng, viêm màng não (chống phù não và kiểm soát viêm)

Đường cấp thuốc tại chỗ được dùng khi thú viêm nội mạc tử cung, vú, da, tai ngoài, vết thương nhiễm trùng Cấp thuốc tại chỗ thường đạt được nồng độ thuốc tại

mô nhiễm trùng cao và kéo dài hơn đường cấp hệ thống Tuy nhiên trong những nhiễm trùng cấp tính ta cần cấp thuốc hệ thống và cấp thuốc tại chỗ chỉ là biện pháp hỗ trợ

2.3.4 Các tai biến khi sử dụng kháng sinh:

2.3.4.1 Các nguyên nhân dẫn đến tai biến:

- Do dùng thuốc sai liều lượng, sai liệu trình, dùng kháng sinh liều cao, quá dài hay đường đưa thuốc không phù hợp

- Do tình trạng sức khỏe của động vật khi bị bệnh, chú ý những con già, hay con non, những con có tiền sử bệnh về gan thận mãn tính…

- Do phối hợp thuốc trong quá trình điều trị: phối hợp thuốc ức chế hoạt động cơ xương với thuốc làm giảm trương lực cơ sẽ gây rối loạn hô hấp hay liệt cơ hô hấp, phối hợp kháng sinh có chung đích tác dụng sẽ làm tăng nồng độ thuốc tự

do trong máu

2.3.4.2 Các biểu hiện độc:

- Uống kháng sinh nhóm B: B1, B2, B6, B12 liều cao, lâu ngày sẽ dẫn đến rối loạn tiêu hóa của loài nhai lại và dạ dày đơn do vi khuẩn có lợi bị diệt, mất khả năng tổng hợp vitamine K, B Nhiều con bị bội nhiễm nấm ở đường tiêu hóa do dùng tetracycline lâu ngày

- Khi dùng quá liều, vi khuẩn gây bệnh bị tiêu diệt ồ ạt, như vậy cùng một lúc cơ thể vừa tìm cách giải độc các kháng sinh vừa phải trung hòa các độc tố do vi khuẩn gây bệnh tạo nên, nếu không cân nhắc, những con già hay con non dễ bị chết hay quá mệt

- Gây nhiễm trùng máu cấp do dùng thuốc lâu dài sẽ sinh vi khuẩn kháng thuốc Khi có điều kiện thuận lợi, những vi khuẩn này phát triển nhanh, xâm nhập vào máu gây huyết nhiễm khuẩn hay các tai biến khác về máu như: thiếu máu do dùng penicilline liều cao; thiếu hồng cầu do dùng sulfamide kéo dài, gây dung huyết do dùng nitrfurane, sulfamide; giảm tiểu cầu, bạch cầu do dùng các thuốc thuộc nhóm β-lactam tiêm tĩnh mạch liều cao

- Các thuốc gây suy tủy: chloramphenicol, sulfamide

- Các thuốc gây mất bạch cầu có hạt: nitrofurane, imidazole

- Các thuốc độc với thận như: các aminoglycoside, colistin Các sản phẩm acetyl hóa của sulfamide gây sỏi thận

- Gây dị ứng-shock quá mẫn Kháng sinh gây dị ứng hay gặp là nhóm β-lactam, đặc biệt là penicillin, nhóm aminoglycoside hay gặp là streptomycine Tùy mức

độ có thể gây dị ứng cục bộ hay toàn thân

2.4 TỔNG QUÁT VỀ 3 LOẠI KHÁNG SINH

2.4.1 Chloramphenicol

Chloramphenicol là D-(-)threo-1-p-nitolphenyl-2-dichloroacetamido

1,3-propanediol, có pKa 5,5, và được phân lập lần đầu tiên từ vi khuẩn trong đất là

Streptomyces venezuelae năm 1947 Ngày nay chloramphenicol được sản xuất tổng

hợp Chloramphenicol được xem như là một kháng sinh phổ rộng, tác động lên vi khuẩn Gr+ và Gr-, hiếu khí và kị khí và nhiều vi khuẩn nội bào Chloramphenicol có 3

nhóm chức xác định đến hoạt tính sinh học: nhóm p-nitrophenol, nhóm acetyl, và nhóm alcohol ở carbon bậc 3 của chuỗi carbon Thay nhóm p-NO2 bằng methylsulfonyl (HC3-SO2) tạo ra thiamphenicol và thay đổi thực sự trong hoạt tính sinh học, trong khi sự thay đổi bằng cách thêm nhân fluorine sẽ tổng hợp được florfenicol Nếu mất nhóm dichloroacetyl sẽ làm mất hoàn toàn hoạt tính sinh học Sự thoái biến chloramphenicol có thể do pH, nhiệt độ, ánh sáng

dichloro-Hình 2.1 Cấu trúc hóa học của chloramphenicol (http://www.wikipedia.com)

Chloramphenicol có tác động kìm khuẩn bằng cách làm rối loạn hoạt tính peptidyltransferase tại tiểu đơn vị 50S của ribosome Chloramphenicol ảnh hưởng đến

sự tổng hợp proteine ở động vật có vú, đặc biệt là sự tổng hợp proteine ở ti thể Ribosome ở ti thể của loài có vú giống với ti thể của vi khuẩn (cả hai đều có 70S), trong đó ti thể ở tủy xương thì đặc biệt mẫn cảm

Chloramphenicol được động vật hấp thu tốt theo cả đường miệng và tiêm, trừ một số loài đặc biệt Thời gian bán hủy trong huyết tương thay đổi từ 0,9 giờ ở ngựa đến 5,1 giờ ở mèo Có sự khác biệt trong sự hấp thu chloramphenicol dạng viên với dạng huyễn dịch chloramphenicol palmitate Cấu trúc lỏng cho sinh khả dụng toàn thân thấp hơn, cho thấy sự thủy phân của dạng palmitate là cần thiết Ở thú nhai lại, hệ

vi sinh vật trong dạ cỏ có khuynh hướng chuyển hóa chloramphenicol nhanh hơn trước khi hấp thu thuốc, do đó chloramphenicol ít được sử dụng đường uống để điều trị bệnh toàn thân cho thú nhai lại

Trên phần lớn động vật, 30-46% chloramphenicol bám vào proteine huyết tương Chloramphenicol được phân bố rộng rãi đến nhiều vùng của cơ thể do trạng thái không bị ion hóa và tính ái dầu cao của nó, cho thấy nó có thể xuyên qua lớp màng lipid kép rất dễ dàng Chloramphenicol có thể được tìm thấy ở đa số mô của cơ thể bao gồm mắt, hệ thần kinh trung ương (CNS), tim, phổi, prostate, nước bọt, gan, lách Chloramphenicol cũng có thể vượt qua hàng rào nhau thai ở động vật mang thai

3 dạng thông thường của chloramphenicol được sử dụng để trị liệu toàn thân phụ thuộc vào con đường cấp Chloramphenicol base là dạng không liên kết và chỉ được sử dụng ở dạng uống Chloramphenicol base có mùi rất nặng, do vậy để tăng tính ngon miệng, chloramphenicol palmitate được sản xuất như là dạng uống khác Tuy nhiên, nó không được hấp thu trực tiếp ở ruột non Chloramphenicol palmitate được thủy phân trong ruột non bởi men esterase của tuyến tụy, tạo ra dạng base tự do của chloramphenicol Tương tự, chloramphenicol succinate là một dạng được sử dụng đường uống cần phản ứng thủy phân ở huyết tương để tạo dạng hoạt động

Chloramphenicol được chuyển hóa bởi gan sau khi hấp thu vào hệ tuần hoàn

Sự glucuronide hóa phase II là con đường chính cho sự chuyển hóa sinh học tại gan của chloramphenicol, với chất chuyển hóa chính là chloramphenicol glucuronide Đa

số chloramphenicol được bài thải qua nước tiểu ở dạng chất chuyển hóa bất hoạt Trẻ

sơ sinh và bệnh nhân có bệnh ở gan có thể bị ngộ độc khi cấp thuốc liên tục Bê con có chuyển hóa yếu đối với sự glucuronide hóa chloramphenicol, tuy nhiên nó nhanh chóng thay đổi ở bò trưởng thành, sau đó giảm ở bò già

Chloramphenicol thỉnh thoảng gây ra sự mất cân bằng trong hệ vi sinh vật đường ruột, từ đó có thể kéo dài thời gian thiếu vitamin B, K và có thể xảy ra sự bội nhiễm nấm (như trên bê)

Độc tính chủ yếu khi nói đến chloramphenicol sử dụng trên người là độc tính trên hệ máu Có hai dạng độc tính Dạng thứ nhất phổ biến là sự phá hủy các tiền hồng cầu trong tủy xương liên quan đến liều lượng thuốc Sự nhiễm độc này có thể phục hồi

và thường xảy ra khi nồng độ trong chloramphenicol trong máu cao hơn 25 µg/ml Sự

ức chế tủy xương là do tổn thương ti thể và ức chể tổng hợp proteine của ti thể trong tủy xương

Dạng thứ hai hiếm hơn, phụ thuộc vào nồng độ và thời gian điều trị, bao gồm

sự bất triển tủy xương, đặc trưng chủ yếu là pancytopenia nặng và lâu dài, thường dẫn đến tử vong do nhiễm trùng hoặc xuất huyết Sự thiếu máu bất triển xảy ra ở khoảng 1:10000 đến 1:45000 người, có thể do di truyền Nhóm p-NO2 bị khử nitro, dẫn đến tạo thành nitrosochloramphenicol và những chất trung gian gây độc có thể gấy hư hỏng tế bào mầm ở người Sự loại bỏ nhóm p-NO2 sẽ làm mất độc tính thiếu máu bất triển liên quan đến chloramphenicol

Thiếu máu vô tạo trên người do chloramphenicol rất quan trọng nhất là liên quan đến tồn dư ở động vật làm thực phẩm Nếu chloramphenicol được sử dụng để trị nhiễm trùng cho động vật làm thực phẩm, nồng độ chloramphenicol trong sữa, thịt và

mô ăn được có thể dẫn đến thiếu máu vô tạo (không phụ thuộc vào nồng độ) Cho nên những người sử dụng các sản phẩm này có một nguy cơ về sức khỏe Với lí do này,

việc sử dụng chloramphenicol trên động vật sản xuất thực phẩm đã bị cấm ở Mỹ và một số nước khác Florfenicol đã được thay thế nhờ độc tính thấp hơn

Trong tương tác thuốc, chloramphenicol có thể gây ức chế enzyme trên cytochrome P450 khi kết hợp với thuốc khác Kháng sinh này tăng gấp đôi thời gian

mê khi dùng pentobarbital hoặc ketamine trên chó và mèo

Có 4 cơ chế đề kháng chloramphenicol Cơ chế quan trọng nhất là qua trung gian plasmide do sự hiện diện của enzyme acetyltransferase xúc tác cho phản ứng biến đổi nhóm hydroxyl Các cơ chế khác bao gồm giảm tính thấm vách tế bào vi khuẩn, giảm khả năng vận chuyển ở tiểu đơn vị 50S của ribosome, và bất hoạt nitroreductase

Chloramphenicol được sử dụng trong nhiều năm để điều trị các nhiễm trùng do

vi khuẩn, bao gồm salmonellais, nhiều chủng vi khuẩn nội và ngoại bào, Rickettsia, Mycoplasma và Chlamydia; nhiễm trùng mắt và hệ thần kinh trung ương; nhiễm trùng

do các vi sinh vật kị khí Chloramphenicol xuyên qua cấu trúc vách tế bào ở vi sinh vật mẫn cảm cũng như màng tế bào động vật có vú, cho thấy công dụng của thuốc trong việc điều trị những nhiễm trùng nội bào Chloramphenicol được dùng để chống lại

nhiễm trùng do Staphylococcus aureus, Staphylococcus hyogenes, Shigella spp.,

Brucella spp., Pasteurella tularensis, E.coli, Proteus spp., Salmonella spp., Bacillus anthracis, Corynebacterium pyogenes, Erysipelothrix rhusiopathiae, Klebsiella pneumoniae cũng như nhiều loài kị khí Chloramphenicol có công dụng trong điều trị

nhiễm trùng hệ thần kinh trung ương (viêm não, màng não) vì nó có thể xuyên qua hàng rào màng não viêm hay không viêm và đạt tới nồng độ trị liệu trong dịch não tủy

và não Chloramphenicol đạt nồng độ cao trong mắt nếu cấp toàn thân hoặc sau khi cấp cục bộ tại giác mạc và hữu dụng trong điều trị viêm kết mạc, viêm mắt, viêm trong mắt, và bệnh do vi khuẩn trên giác mạc Chloramphenicol cũng có thể được sử dụng trong nhiễm trùng đường hô hấp do vi khuẩn Thêm vào đó, chloramphenicol cũng có thể được sử dụng thành công trong điều trị viêm tuyến tiền liệt trên chó Tuy nhiên, việc sử dụng chloramphenicol ở động vật sản xuất thức ăn là không hợp lệ

* Ở Việt Nam, kháng sinh này đã bị cấm sử dụng theo quyết định số BNN, ngày 20/6/2002

54/2002/QD-2.4.2 Tetracycline

Hình 2.2 Cấu trúc hóa học của Tetracycline (http://www.wikipedia.com)

Thuốc được đưa vào lâm sàng từ 1952 và được sử dụng cho đến nay, cho thú nhỏ và cả thú sản xuất thực phẩm

Khi tetracycline được cấp đường tĩnh mạch 1,5h thuốc được tích lũy cao trong kết tràng, hồi tràng, túi mật, nước tiểu, không tràng, gan, thận Tetracycline phân bố nhanh vào trong máu, tạo trạng thái cân bằng ổn định với dịch ngoại bào trong 10 phút Tetracycline được hấp thu và phân bố tốt vào nhiều mô

Tetracycline được sử dụng trên thú nhỏ để điều trị nhiều bệnh như Rickettsia

rickettsii Tetracycline, chloramphenicol, enrofloxacin có tác động như nhau trong

việc điều trị bệnh này ở chó thí nghiệm bị nhiễm vi sinh vật gây bệnh Tetracycline

cũng có hiệu quả trong điều trị E.canis Tetracycline cấp đường uống liều 13,6 mg/kg

cho kết quả giảm triệu chứng lâm sàng, liều 1,36 mg/kg đạt nồng độ phòng bệnh Ngày nay người ta sử dụng nhiều doxycycline để trị Ehrlichiosis ở chó do có khả năng

hấp thu tốt hơn và nồng độ thuốc trong tế bào cao hơn Tetracycline có hiệu quả đối

với nhiễm trùng nội bào khác như Brucella canis, cũng như trị nhiễm trùng đường tiểu trên chó do Pseudomonas aeruginosa Phức hợp tetracycline-niacinamide dùng để

điều trị bệnh tự miễn dịch ở da trên chó Tetracycline và có thể hữu dụng trong điều trị

borreliosis, chlamydiosis (đặc biệt trên mèo và gia cầm), Mycoplasma spp., Leptospira

spp., và Listera spp

Phản ứng phụ của tetracycline: Tetracycline gây sốc phản vệ trên chó sau khi tiêm tĩnh mạch Tác động trên tim mạch của tetracycline: tetracycline có thể giảm lượng calcium trong tim gây trụy tim mạch Việc sử dụng tetracycline kết hợp với

thuốc gây mê methoxyflurane kéo theo những nguyên nhân gây độc cho phổi, gây hư

hỏng nặng thận và chết trên người và chó Bên cạnh đó, tetracycline còn bám lên mô răng do có ái lực với calci từ đó làm răng bị vàng, làm mỏng men răng Đối với xương, tetracycline bám lên xương của thai đang hình thành gây nên những biến đổi như dị tật

ở đuôi chó con Các hạn chế này đã được khắc phục bởi các sản phẩm bán tổng hợp tan trong mỡ như doxycycline, minocycline

bài thải chậm, và dạng tiêm tĩnh mạch Sulfamethazine được bào chế đơn lẻ hoặc kết hợp với thuốc kháng khuẩn khác như tylosin, chlortetracycline, và penicilline G procaine Dạng uống của sulfamethazine được bào chế ở dạng bài thải phẩm được dùng cho gia súc Dạng này có hiệu quả và đã được sử dụng lâm sàng Dạng này đạt nồng độ trị liệu trong máu (50 µg/ml) trong 6-12 giờ sau khi cấp bằng đường uống và giữ giúp Sulfamethazine đạt mức này trong 2-5 ngày sau khi cấp Dạng bào chế bài thải chậm của sulfamethazine trong điều trị có hiệu quả cao trong điều trị bệnh viêm phổi, bệnh bạch hầu trên gia súc Sự thanh thải và chuyển hóa sulfamethazine phụ thuộc vào nồng độ và tuổi

Sulfamethazine được sử dụng rộng rãi để chữa bệnh cho vật chủ nhiễm trùng,

bao gồm Salmonella typhisuis và Bordetella bronchiseptica Nhiều thí nghiệm đã sử

dụng sulfamethazine có hoặc không đánh dấu đồng vị phóng xạ để xác định phần sulfamethazine và chất chuyển hóa loại thải từ mô thịt heo Các nghiên cứu khác cho thấy các chất chuyển hóa chủ yếu tạo ra trong quá trình chuyển hóa ở heo là sulfamethazine phức chất gốc, N4-acetylsulfamethazine, phức N4-glucose của sulfamethazine, và desaminosulfamethazine Nghiên cứu trên heo cho ăn 110 ppm C14-sulfamethazine trong thức ăn trong 3-7 ngày, mô của chúng được kiểm tra hàm lượng chất chuyển hóa có độ tính phóng xạ cao nhất trong ruột (thức ăn không tiêu) Máu, thận, nước tiểu, và gan đều có nồng độ Sulfamethazine phóng xạ cao (phức chất gốc

và chất chuyển hóa) Mô mỡ chứa lượng phóng xạ ít nhất trong các mô thử

Sulfonamide là một trong những nguyên nhân gây ra vi phạm về tồn dư trong thực phẩm Theo báo cáo của Sở Thanh tra An toàn Thực phẩm Mỹ trong những năm qua, heo là loài động vật bị vi pham về tồn dư Sulfamethazine với số lượng lớn nhất Sulfamethazine và các chất chuyển hóa của nó luôn được liên kết với mức độ cao trong sản phẩm thịt heo do việc sử dụng phổ biến chất kích thích tăng trưởng trong thức ăn cho heo Sulfamethazine và các kháng sinh trong nhóm có thể gây ung thư ở người nếu sử dụng lâu dài

2.5 TỒN DƯ KHÁNG SINH:

2.5.1 Khái niệm chất tồn dư

Chất tồn dư hóa học (dù là phức hợp hay nguyên thủy hay chất chuyển hóa) là những chất có khả năng tích lũy, tồn đọng hay dự trữ, ở tế bào, mô, cơ quan, hoặc các sản phẩm có thể tiêu thụ (ví dụ: trứng, sữa) của vật nuôi (Võ Thị Trà An,2001)

2.5.2 Các yêu tố ảnh hưởng đến tồn dư kháng sinh:

* Tồn dư thuốc hay chất hóa học có thể là kết quả của việc sử dụng chất phụ gia thức ăn trong động vật lấy thịt (Chất phụ gia được định nghĩa là thuốc, chất hóa học, hoặc chất sinh học khác được thêm vào trực tiếp để cho ăn nhằm thay đổi mặt nào

đó của hành vi hay sản phẩm của động vật lấy thịt.) Tồn dư cũng có thể là kết quả của việc cho liều thuốc hay chất phụ gia một cách vô ý Cuối cùng, những thay đổi bất ngờ của các chất hóa học trong môi trường cũng có thể gây ra tồn dư trong mô (Richard, 1995)

* Yếu tố kinh tế:

- Người chăn nuôi lạm dụng kháng sinh:

+ Tỉ lệ sử dụng trong thức ăn cao: 100% có oxytetracycline, 67% có chloramphenicol, 30% có olaquindox , 77% có dexamethasol (Lã Văn Kính và ctv, 2001)

+ Sử dụng kháng sinh phòng, trị bệnh không hợp lí: 82,89% trại CN sử dụng không hợp lý, 40,13% ngưng thuốc không đúng, 20% trại theo hướng dẫn của thú y, 39,05% theo khuyến cáo của nhà SX, 0% trại sử dụng KS theo xét nghiệm (Đinh Thiện Thuận, 2001), (Nguyễn Như Pho, 2001)

- Người vận chuyển, buôn bán dùng các hóa chất, trong đó có kháng sinh để bảo quản sản phẩm động vật (Võ Thị Trà An, 2001)

* Yếu tố sinh học (dẫn liệu Võ Thị Trà An, 2001):

- Liều kháng sinh cung cấp cho thú: liều dùng càng cao thì thời gian bài thải ra

khỏi mô của kháng sinh càng chậm

- Loại mô: thông thường mức độ tồn đọng ở thận cao nhất, rồi đến gan, cơ, mỡ,

da

- Khoảng thời gian ngưng thuốc trước khi thú được hạ thịt càng ngắn thì mức

độ tồn đọng càng cao và ngược lại

- Sự phân bố của các kháng sinh đến các cơ quan còn tùy vào loại kháng sinh Vd: nhóm sulfamide phân bố khá rộng trong hầu hết các mô nhưng ít trong não

và bộ máy sinh dục……

- Đường cấp: tùy đường cấp thuốc mà kháng sinh vào máu và đến các cơ quan lọc nhanh hay chậm Từ đó chũng sẽ được bài thải ra ngoài sớm hay muộn Vd: streptomycin, kanamycin, neomycin rất khó hấp thu, do đó khi được cấp qua đường tiêu hóa gần như không thấy dư lượng kháng sinh trong thịt, nhưng nếu tiêm, dư lượng tồn tại trong tế bào tương đối lâu (streptomycin có thể tồn tại 1 tháng)

- Tuổi: thông thường các cơ năng trong cơ thể hoạt động tốt khi thú đạt tuổi trưởng thành Còn ở thú non hay già yếu, các cơ quan nói chung không được hoàn thiện nên dễ bị các yếu tố ngoại sinh gây ảnh hưởng xấu hơn

- Thể trạng cơ thể và của cơ quan lọc: nếu tình trạng tốt sẽ góp phần làm giảm độc tính của kháng sinh cũng như mức tồn dư trong cơ thể

- Loài: các loài khác nhau thì có phản ứng khác nhau với cùng một liều hóa dược

* Nguyên nhân phổ biến nhất gây ra vi phạm tồn dư là do thất bại trong việc quan sát thời gian ngưng thuốc chính xác

2.5.3 Tác hại của tồn dư kháng sinh (Lê Thị Ngọc Diệp, Bùi Thị Tho, 2007):

-Gây hại đến sức khỏe: Ảnh hưởng của chất tồn dư kháng sinh đến sức khỏe

của gia súc, con người có thể trực tiếp hay gián tiếp: chloramphenicol gây ung thư, suy tủy, rối loạn hệ vi sinh vật đường ruột……

- Các phản ứng dị ứng: Đặc biệt đối với những cá thể mẫn cảm, sự có mặt của

các chất tồn dư trong thực phẩm có nguồn gốc động vật có thể gây ra các phản ứng dị ứng trên người mẫn cảm Những người có sẵn cơ địa dị ứng với nhóm β-lactam khi uống sữa bò hay dùng các sản phẩm có tồn lưu những thuốc kháng

sinh thuộc nhóm này sẽ bị dị ứng nổi mề đay hay tiêu chảy

- Gây rối loạn khu hệ vi sinh vật đường ruột: Biến đổi thành phần hệ vi sinh

vật, giết chết vi khuẩn có lợi, gây tiêu chảy, thiếu vitamine E, K do vi khuẩn ruột tạo ra và tạo điều kiện thuận lợi cho vi khuẩn kháng thuốc phát triển, vô hiệu hóa probiotics (chế phẩm vi khuẩn hữu ích bổ sung trong thức ăn, thực phẩm), giảm khả năng tiêu hóa vi sinh trong ruột già

- Tác hại về mặt công nghệ: Các tồn dư kháng sinh đã cản trở việc lên men

trong quá trình chế biển thực phẩm: sữa chua, phomat, chế xúc xích…

2.5.4 Các phương pháp khắc phục tồn dư kháng sinh :

Bước đầu tiên trong phòng tránh tồn dư là khiến cho tổ chức và cá nhân nhận thức được vấn đề thông qua giáo dục Tiến hành các kiểm tra nhanh để đánh giá mức độ tồn dư trong sản phẩm động vật và loại bỏ những sản phẩm vi phạm Xây dụng một ngân hàng dữ liệu về phòng tránh tồn dư trong động vật lấy thịt đã đươc xây dựng và cung cấp những thông tin bổ ích về thuốc thú y, bảng hiện hành, sức chịu đụng của mô, thời gian ngưng thuốc, dược động và chất độc,… (Richard, 1995)

Các phương pháp khác: Chọn kháng sinh có thời gian thải thuốc nhanh: avilamycin, tiamulin Dùng thức ăn thay thế kháng sinh: acid hữu cơ, probiotic, enzyme, thảo dược Dùng thảo dược trị bệnh: vẫn đạt kết quả điều trị tốt và không có chất tồn dư (Lã Văn Kính, 2006)

2.6 Các phương pháp xác định tồn dư kháng sinh trong thực phẩm:

2.6.1 Phương pháp vi sinh vật (FPT- Four Plate Test) (Võ Minh Châu, 2008):

* Nguyên tắc: dựa vào đặc tính nhạy cảm của vi sinh vật đối với một số

kháng sinh nhất đinh, người ta cấy chủng vi sinh vật này trên đĩa thạch có đĩa giấy thấm nước chiết từ các mẫu xác định sự hiện diện của kháng sinh Nếu mẫu có kháng sinh thì xung quanh giấy thấm sẽ xuất hiện vòng vô khuẩn do sự khuếch tán của kháng sinh từ mẫu ra môi trường thạch ức chế sự phát triển của

vi khuẩn

* Ưu-khuyết điểm:

- Ưu điểm: trang thiết bị tương đối phổ biến, quen thuộc, dễ đầu

tư

- Khuyết điểm:

+ Cần phải có không gian rộng cho một phòng thí nghiệm hoàn chỉnh + Kĩ thuật viên cần có tay nghề cao, kinh nghiệm

+ Thời gian cho kết quả tương đối dài

+ Độ nhạy phương pháp thấp do chỉ phát hiện được kháng sinh khi hàm lượng cao trong mẫu phân tích

+ Quá trình nuôi giữ các chủng gốc vi sinh vật khá phức tạp và mất rất nhiều thời gian

+ Chuẩn bị cho thí nghiệm công phu, kéo dài

2.6.2 Phương pháp sắc kí lỏng cao áp (HPLC- High Pressure Liquid Chromatography) (Võ Minh Châu, 2008):

* Nguyên tắc: Người ta dựa vào một số yếu tố như khối lượng phân tử,

cấu trúc lập thể, ái lực của các chất cần phân tích với nhau, với pha tĩnh (cột phân tích), với pha động (dung môi),… khác nhau để xác định thời gian qua cột của một chất Đối với các chất khác nhau khi qua cột trong cùng điều kiện sắc kí sẽ cho thời gian lưu khác nhau, thời gian lưu là giá trị định tính của một chất

Người ta cũng dựa vào diện tích mũi (pick) trên sắc đồ của chất cần phân tích trong mẫu so với diện tích mũi của chất chuẩn đã biết nồng độ để định lượng một chất

* Ưu – khuyết điểm:

+ Trang thiết bị quá đắt tiền

+ Giá thành phân tích còn cao

2.6.3 Phương pháp miễn dịch enzyme (ELISA)(http://wikipedia.com)

ELISA được mô tả lần đầu tiên vào năm 1971 và từ đó đã trở thành một phương pháp được sử dụng ngày càng rộng rãi và quan trọng hơn trong nghiên cứu, chẩn đoán và xét nghiệm bởi vì nó có khả năng phát hiện nhạy bén với một lượng vật chất rất nhỏ ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) là từ viết tắt theo tiếng Anh của một thí nghiệm, tạm dịch “sự thử hấp thụ miễn dịch gắn enzyme”, có nghĩa là sự thử miễn dịch có enzyme trên một giá bằng chất rắn

Thí nghiệm này là một trong những thí nghiệm miễn dịch có gắn enzyme (EIA, Enzyme immunoassay), trong đó thí nghiệm được ghép với một phản ứng xúc tác bởi một enzyme mà nó sẽ giải phóng một thành phần biến màu được ghi nhận bởi quang phổ học, bởi sự đối lập với RIA (Radio ImmunoAssay) trong đó kháng thể được đánh dấu bởi một yếu tố phóng xạ và thí nghiệm đo số lượng bị phân hủy

ELISA là một kĩ thuật sinh hóa, được sử dụng chủ yếu trong miễn dịch học, nhưng không phải là duy nhất, để phát hiện sự có mặt của một kháng nguyên hoặc kháng thể trong một mẫu Kĩ thuật dung một hoặc hai kháng thể Một trong số đó chuyên biệt với kháng nguyên, trong khi đó cái còn lại chuyên biệt với phức hợp miễn dịch (kháng nguyên-kháng thể) và được gắn với enzyme Kháng thể thứ hai này cũng có thể gây ra sự phát của một chất nên tạo màu hoặc tạo huỳnh quang

ELISA vừa có thể được sử dụng để đánh giá sự có mặt của một kháng nguyên, vừa có thể đánh giá sự có mặt của kháng thể trong mẫu Đây là một công

cụ hữu ích để xác định nồng độ kháng thể trong huyết thanh (như HIV hay virus sông Nil), đồng thời cũng có thể xác định sự có mặt của kháng nguyên Nó cũng được áp dụng trong công nghiệp thực phẩm, để phát hiện các yếu tố gây dị ứng trong thức ăn, như sữa, đậu phộng, trứng Đây là một thử nghiệm đơn giản, dễ sử dụng và ít tốn kém Nó bị giới hạn do thiếu các kháng thể chuyên biệt

Nguyên tắc cơ bản của phương pháp ELISA là kháng nguyên đã hoà tan trong dung dịch đệm thích hợp có thể phủ lên bề mặt plastic (như polystyrene) Quá trình này có thể là trực tiếp hoặc thông qua một kháng thể Khi huyết thanh được thêm vào, các kháng thể có thể kết hợp với kháng nguyên ở pha đặc (solid phase)

Xét nghiệm ELISA được thực hiện trong đĩa plastic kích thước 8cm x 12cm, chứa 8x12 giếng Mỗi giếng có chiều cao khoảng 1cm và đường kính là 0,7cm

Tính nhạy của ELISA là do sự khuyếch đại bởi hoạt tính enzyme Mỗi một phân

tử enzyme bám vào kháng thể có thể tạo ra hàng ngàn phân tử màu do hoạt tính enzyme

™ Các loại ELISA:

1 ELISA gián tiếp

Các bước ELISA gián tiếp, được sử dụng thường xuyên để phát hiện nồng độ kháng nguyên trong huyết thanh, như sau:

- Đặt mẫu kháng nguyên đã biết vào một bề mặt, thông thường là giếng của một đĩa vi thể, để cố định kháng nguyên

- Phủ lên các giếng (hoặc tất cả các bề mặt) bằng các mẫu huyết thanh thử nghiệm (hoặc tất cả dung dịch thử nghiệm khác) Việc sử dụng huyết thanh không phải của người sẽ ngăn cản sự liên kết của các kháng thể không đặc hiệu trong máu bệnh nhân với kháng nguyên

- Súc rửa đĩa để loại bỏ các kháng thể không bám Sau khi rửa, chỉ còn lại phức hợp kháng nguyên-kháng thể gắn trên bề mặt giếng

- Thêm kháng nguyên thứ hai vào giếng Nó sẽ gắn với phức hợp kháng kháng thể Các kháng nguyên thứ hai này gắn với enzyme làm biến đổi của chất nền, cho phép phản ứng tiếp diễn

nguyên Lần rửa thứ hai để loại bỏ các kháng thể không bám

- Thêm chất nền, nếu được biến đổi sẽ biến thành một tín hiệu màu hoặc huỳnh quang

- Định lượng bằng mắt thường hoặc thông thường là bằng máy quang phổ hoặc bằng tất cả các máy quang học khác

Enzyme có hiệu lực như là một chất khuếch đại: ngay cả khi có ít kháng thể được gắn vào enzyme, enzyme vẫn xúc tác cho việc tạo ra nhiều tín hiệu, điều này làm cho thử nghiệm này trở nên rất nhạy, nhưng cũng làm tăng số dương tính giả ELISA có thể được thực hiện định lượng hoặc định tính:

- Kết quả định tính chỉ sự có mặt hoặc không có mặt của một kháng nguyên của mẫu Những giá trị ngưỡng được xác định bằng phân tích và có thể dựa trên

thống kê Hai hoặc ba … thường được sử dụng để phân biệt mẫu dương tính hay âm tính

- Trong việc sử dụng ELISA để định lượng, mật độ quang hoặc các đơn vị huỳnh quang của mẫu được suy ra trên đường chuẩn, thường là sự pha loãng theo một chuỗi của chất đích

™ Ứng dụng:

- Định lượng: để phân tích các protein khác nhau Một số ứng dụng trong dược lý

y học: hormone throide, mức độ thuốc (để đánh giá sự tuân thủ qui định, hay chấp nhận liều lượng),…

- Định tính: thử nghiệm HIV

2 ELISA sandwich

- Đĩa được phủ bởi một kháng thể bẫy

- Mẫu được thêm vào, và tất cả kháng nguyên hiện diện gắn với kháng thể bẫy

- Kháng thể phát hiện được thêm vào và gắn với kháng nguyên

- Kháng thể thứ hai gắn với enzyme được thêm vào và gắn với kháng thể phát hiện

- Chất nền được thêm vào và bị biến đổi bởi enzyme thành một dạng có thể phát hiện được (phát màu hoặc huỳnh quang)

ELISA sandwich là một phương thức ít phổ thông trong lâm sang, được dùng để phát hiện mẫu kháng nguyên trong huyết thanh hoặc trong tất cả các mẫu khác Ngược lại, kĩ thuật này được sử dụng rất phổ biến trong nghiên cứu

Phương pháp được triển khai một cách khái quát như sau:

- Một bề mặt được chuẩn bị và một lượng kháng thể biết trước gọi là kháng thể bẫy được gắn vào

- Mẫu chứa kháng nguyên được thêm vào đĩa

- Đĩa được súc rửa để loại bỏ kháng nguyên không bám

- Các kháng thể gắn với enzyme được thêm vào

- Đĩa được rửa lần hai

- Chất nền được thêm vào, nó có thể được biến đổi thành tín hiệu huỳnh quang bởi enzyme

- Kết quả được phân tích bằng mắt hoặc bằng máy quang phổ chuyên biệt

Tuy nhiên, có một bước bổ sung, thêm kháng thể phát hiện, để tránh tao ra các kháng thể gắn với từng kháng nguyên Việc sử dụng enzyme gắn vào để nhận biết phần Fc của các kháng thể khác cho phép sử dụng trong nhiều trường hợp và giảm giá thành quy trình

- Các phức hợp miễn dịch được đổ vào giếng đã phủ kháng nguyên

- Đĩa được rửa để loại bỏ các kháng thể không gắn (hàm lượng kháng nguyên trong mẫu càng cao, số kháng thể gắn vào kháng nguyên trong giếng càng ít, đó

Ưu điểm:

¾ Trang thiết bị tương đối phổ biến hiện nay đối với các phòng thí nghiệm

¾ Giá thành phân tích mẫu rẻ, dễ chấp nhận

¾ Thao tác tương đối đơn giản, không cần thiết kĩ thuật viên kinh nghiệm

¾ Giới hạn phát hiện thấp đủ đáp ứng nhu cầu kiểm tra đối với kháng sinh trong mẫu thực phẩm

¾ Đáp ứng nhu cầu định lượng

Khuyết điểm: đôi khi vẫn còn xuất hiện trường hợp dương tính giả và kháng nguyên trong mẫu dễ bị phân hủy

SƠ LƯỢC MỘT SỐ CÔNG TRÌNH NGHIÊN CỨU LIÊN QUAN

- Lã Văn Kính (1998) đã dùng phương pháp sắc kí cao áp phát hiện 9/14 mẫu thịt

gà có tồn dư oxytetracycline; 1/4 mẫu thịt gà có tồn dư chloramphenicol; 5/7 mẫu thịt

gà có tồn dư ampicillin; 3/3 mẫu thịt gà có tồn dư tylosin; 2/2 mẫu thịt gà có tồn dư tiamulin và 6/11 mẫu thịt gà có tồn dư norfloxacin

- Võ Thị Trà An (2001) đã dùng phương pháp vi sinh vật và HPLC để phát hiện kháng sinh tồn dư trong thịt gà tại Tp HCM Kết quả có 3/5 mẫu có tồn dư tylosin, 1/2 mẫu có tồn dư tetracyline, 10/12 mẫu có tồn dư sulfamethazine, 5/8 mẫu có tồn dư sulfaquinoxaline, 12/28 mẫu có tồn dư enrofloxacin, 6/10 mẫu có tồn dư norfloxacin.Trong đó có 7 mẫu vượt giới hạn quy định về tồn dư sulfamethazine, 2 mẫu vượt giới hạn quy định về tồn dư sulfadiazine, 12 mẫu vượt giới hạn quy định về tồn dư enrofloxacin, 4 mẫu vượt giới hạn quy định về tồn dư norfloxacin

- Phạm Thị Hồng Hạnh (2005) đã dùng phương pháp vi sinh vật để phát hiện tồn

dư kháng sinh trong các loại thịt (thịt heo, bò, gà) từ các cơ sở giết mổ và chợ tại TP.HCM Kết quả có 16/234 mẫu có tồn dư kháng sinh, bao gồm các nhóm marcrolid, quinolone và tetracyline

- Đoàn Đình Toàn (2007) đã dùng phương pháp vi sinh vật để phát hiện kháng sinh tồn dư trong thịt heo và gan heo tươi có nguồn gốc tại Tp HCM và các tỉnh lân cận Kết quả có 7/56 mẫu thịt heo và 13/56 mẫu gan heo có tồn dư kháng sinh, chiếm

tỉ lệ 12,5% mẫu thịt heo và 23,21% mẫu gan heo Các nhóm kháng sinh tồn dư là macrolid, tetracycline, β-lactam, aminoside

- Võ Minh Châu (2008) đã dùng phương pháp ELISA và HPLC để đánh giá tồn

dư kháng sinh trong mật ong Kết quả cho thấy có 235/235 mẫu có tồn dư chloramphenicol (có 9 mẫu vượt quá giới hạn cho phép), 47/133 mẫu có tồn dư streptomycin và đều vượt quá giới hạn cho phép, 19/24 mẫu có tồn dư tetracycline và đều vượt quá giới hạn cho phép