NGHIÊN cứu THÀNH PHẦN hóa học và HOẠT TÍNH SINH học của các hợp CHẤT TRITERPEN TRONG lá cây SUM điểm đỏ (adinandra rubropunctata)

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN  PHẠM THỊ LAN PHƯỢNG NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA CÁC HỢP CHẤT TRITERPEN TRONG LÁ CÂY SUM ĐIỂM ĐỎ (Adinandra rubropunctata) LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC THỰC NGHIỆM Hà Nội - 2019 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN  PHẠM THỊ LAN PHƯỢNG NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA CÁC HỢP CHẤT TRITERPEN TRONG LÁ CÂY SUM ĐIỂM ĐỎ (Adinandra rubropunctata) Chuyên ngành : SINH HỌC THỰC NGHIỆM Mã số : 8420101.14 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC THỰC NGHIỆM NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS Nguyễn Quang Huy TS Lê Nguyễn Thành HÀ NỘI - 2019 LỜI CẢM ƠN Trong suốt trình thực đề tài cho luận văn, tơi nhận giúp đỡ tận tình nhiều tập thể cá nhân Với lòng kính trọng biết ơn sâu sắc, tơi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới PGS.TS Nguyễn Quang Huy – Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học tự nhiên, Đại học Quốc Gia Hà Nội TS Lê Nguyễn Thành – Viện Hóa sinh biển, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam giao đề tài quan tâm tạo điều kiện thuận lợi để tơi hồn thành luận văn Tơi xin chân thành cảm ơn TS Lê Nguyễn Thành, NCS Vũ Thị Kim Oanh với cán Trung tâm nghiên cứu phát triển thuốc, Viện Hóa sinh biển – Viện hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam nhiệt tình giúp đỡ, hết lịng bảo tơi suốt thời gian thực luận văn Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến toàn thể thầy cô giáo trường Đại học Khoa học tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội nhiệt tình giảng dạy, giúp đỡ, mang lại cho kiến thức kinh nghiệm quý báu suốt thời gian học tập trường Cuối cùng, xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè người thân ủng hộ, động viên sống suốt q trình hồn thành luận văn Do hạn chế thời gian kiến thức nên luận văn khơng tránh thiếu sót nên mong nhận đóng góp thầy để tơi bổ sung, hồn thiện kiến thức phục vụ cho công việc sau Tôi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 04 tháng 11 năm 2019 Học viên PHẠM THỊ LAN PHƯỢNG LỜI CAM ĐOAN Tôi Phạm Thị Lan Phượng, học viên cao học khóa 26 Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội, khoa Sinh học, chuyên ngành Sinh học thực nghiệm, xin cam đoan: Đây luận văn thân trực tiếp thực hướng dẫn khoa học PGS.TS Nguyễn Quang Huy TS Lê Nguyễn Thành Công trình khơng trùng lập với nghiên cứu khác công bố Việt Nam Các số liệu thông tin nghiên cứu hồn tồn xác, trung thực khách quan Tơi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm trước pháp luật cam kết Hà Nội, ngày 04 tháng 11 năm 2019 Người viết cam đoan PHẠM THỊ LAN PHƯỢNG MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ ĐẶT VẤN ĐỀ 10 Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 12 1.1 Tổng quan họ Pentaphylacaceae .12 1.2 Tổng quan chi Adinandra .13 1.2.1 Về vị trí phân loại chi Adinandra Error! Bookmark not defined 1.2.2 Về đặc điểm thực vật phân bố chi Adinandra 13 1.2.3 Về thành phần hóa học chi Adinandra 14 1.2.4 Về hoạt tính sinh học chi Adinandra 19 1.3 Tổng quan Sum điểm đỏ 22 1.3.1 Về vị trí phân loại Sum điểm đỏ 22 1.3.2 Về đặc điểm chung Sum điểm đỏ 23 Chương ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .25 2.1 Đối tượng nghiên cứu 25 2.2 Phương tiện nghiên cứu .25 2.3 Phương pháp nghiên cứu .26 2.3.1 Phương pháp chiết xuất phân lập 26 2.3.2 Phương pháp đánh giá tác dụng gây độc tế bào 27 2.3.3 Phương pháp thử hoạt tính α-glucosidase .29 Chương THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ .31 3.1 Chiết xuất, phân lập nhận dạng cấu trúc hợp chất phân lập 31 3.1.1 Chiết xuất 31 3.1.2 Phân lập hợp chất từ dịch chiết ethyl acetat Error! Bookmark not defined 3.1.3 Dữ liệu phổ hợp chất thu 33 3.2 Xác định cấu trúc hợp chất phân lập .34 3.3 Đánh giá tác dụng gây độc tế bào ung thư hợp chất phân lập 49 3.4 Đánh giá tác dụng ức chế enzyme α-glucosidase hợp chất phân lập Error! Bookmark not defined 3.5 Một số bàn luận chung thành phần hóa học hoạt tính sinh học Error! Bookmark not defined 3.5.1 Về thành phần hóa học Error! Bookmark not defined 3.5.2 Về tác dụng sinh học Error! Bookmark not defined KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .52 TÀI LIỆU THAM KHẢO 54 PHỤ LỤC 59 DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT CÁC TỪ VIẾT TẮT H-NMR 13 C-NMR TIẾNG ANH Proton Nuclear Magnetic Resonance 13 Carbon Nuclear Magnetic Resonance δH, δC TIẾNG VIỆT Phổ cộng hưởng từ proton Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13C Độ dịch chuyển hóa học proton cacbon Độ dịch chuyển hóa học tính phần triệu δ (ppm) (ppm = part per million) A549 Human brochogenic carcinoma Ung thư phổi CAA Cellular antioxidant activity Hoạt tính chống oxy hóa tế bào CC Column Chromatography Sắc ký cột thường CTHH Cấu trúc hóa học CTPT Công thức phân tử DEPT Phổ DEPT DMSO Dimethyl sulfoxide Dimethyl sulfoxit DPPH Diphenyl picril hydrazilhydrate Diphenyl picril hydrazilhydrat EC50 50% effective concentration Nồng độ gây tác động sinh học cho 50% đối tượng thử nghiệm ED50 50% effective dose Liều có hiệu 50% ESI-MS Electron Spray Ionization - Mass Spectrometry Phổ khối ion hóa phun mù điện tử EtOAc Ethyl acetate Ethyl acetat GCMS Hep-G2 HPLC HSQC IC50 Gas Chromatography Mass Spectometry Human hepatocellular carcinoma High Performance Liquid Chromatography Heteronuclear Single Quantum Coherence 50% inhibitory concentration Sắc ký khí ghép khối phổ Dịng tế bào ung thư gan Sắc ký lỏng hiệu cao Phổ tương tác dị hạt nhân qua liên kết Nồng độ ức chế 50% Hằng số tương tác tính Hz J (Hz) LU Human lung carcinoma Dòng tế bào ung thư phổi MCF-7 Human breast carcinoma Dòng tế bào ung thư vú MeOH Methanol Methanol 3-[4,5-dimetylthiazol-2-yl]-2,5diphenyltetrazol brom MTT MS Mass Spectroscopy Phổ khối lượng OD Optical Density Mật độ quang học ORAC PSC Oxygen Radical Absorbance Capacity peroxyl radical scavenging capacity khả hấp thụ gốc oxy hóa Khả bắt gốc peroxyl TLC Thin layer chromatography Sắc ký lớp mỏng UV Ultraviolet Spectroscopy Phổ tử ngoại DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Tác dụng chống ung thư dòng tế bào Hep-G2 MCF-7 22 Bảng 3.1 Số liệu phổ 1H-NMR 13C-NMR hợp chất tài liệu tham khảo 29 Bảng 3.2 Số liệu phổ 1H-NMR 13C-NMR hợp chất tài liệu tham khảo 42 Bảng 3.3 Số liệu phổ 1H-NMR 13C-NMR hợp chất tài liệu tham khảo 47 Bảng 3.4 Kết thử hoạt tính gây độc tế bào ba dòng tế bào ung thư người ba hợp chất phân lập Error! Bookmark not defined Bảng 3.5 Kết thử hoạt tính ức chế enzyme α-glucosidase ba hợp chất phân lập Error! Bookmark not defined 13 C-NMR (125 MHz, DMSO-d6) δ (ppm): 177.2 (C-28), 150.3 (C-20), 109.6 (C-29), 76.8 (C-3), 55.4 (C-17), 54.9 (C-5), 49.9 (C-9), 48.6 (C-18), 46.6 (C19), 42.0 (C14), 40.3 (C-8), 38.5 (C-4), 38.0 (C-1), 37.6 (C-13), 36.7 (C-10), 36.3 (C-22), 33.9 (C-7), 31.7 (C-16), 30.1 (C-21), 29.2 (C-15), 28.1 (C-23), 27.1 (C-2), 25.1 (C-12), 20.5 (C-11), 18.9 (C-30), 18.0 (C-6), 15.9 (C-26), 15.8 (C-24), 15.7 (C-25), 14.4 (C-27) 3.2 Xác định cấu trúc hợp chất phân lập 3.2.1 Xác định cấu trúc hợp chất LARE1 (Uvaol) Cơng thức hóa học hợp chất LARE1 (Uvaol): [3β,28-dihydroxyurs-12ene] Hình 3.1 Cấu trúc hợp chất LARE1 Hợp chất LARE1 thu chất rắn màu trắng Phổ ESI-MS cho pick ion giả phân tử proton hóa m/z [M+H]+ 443; gợi ý cho công thức phân tử (CTPT) C30H50O2 (M = 442) Hình 3.2 Phổ ESI-MS hợp chất LARE1 Hình 3.3 Phổ 1H NMR hợp chất LARE1 Phổ 1H-NMR (500 MHz, CDCl3) tín hiệu đặc trưng hợp chất triterpen khung ursan với tín hiệu nhóm methyl gồm singlet δH 1.10, 1.00, 0.97, 0.95, 0.79 doublet δH 0.93 (3H, d, J = 6.0 Hz, H-29), 0.82 (3H, d, J = 6.5 Hz, H-30) Ngồi phổ 1H-NMR cịn có tín hiệu olefinic proton vị trí δH 5.13 (1H, t, J = 7.5 Hz, H-12), nhóm oxymethylen 3.52 (1H, d, J = 11.0 Hz, H-28a), 3.19 (1H, d, J = 11.0 Hz, H-28b) nhóm oxymethin δH 3.22 (1H, m, H-3) Hình 3.4 Phổ 1H NMR giãn rộng hợp chất LARE1 Phổ 13C-NMR DEPT cho tín hiệu 30 carbon có nhóm CH3 δC 28.1 (C-23), 23.3 (C-27), 21.3 (C-30), 17.3 (C-29), 16.8 (C-24), 15.7 (C-26), 15.6 (C-25), 10 nhóm metylen có nhóm CH 2OH δC 69.9 (C28), nhóm metin có nhóm CHOH δC 79.0 (C-3) Hình 3.5 Phổ 13C-NMR hợp chất LARE1 Hình 3.6 Phổ DEPT hợp chất LARE1 Bảng 3.1 Số liệu phổ 1H-NMR 13C-NMR hợp chất LARE1 tài liệu tham khảo [31] Vị trí (*) 3,22 (1H, m) H H (**) 3,17(1H, dd, J=5,5 &10Hz) 13 C 13 C (*) 38,8 27,2 (**) 38,78 26,63 79,0 78,44 Vị trí 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 (*) (**) 5,13 (1H, t, J=7,5) 5,1 (1H, t, J=3) 1,00 (s) 0,97 (s) 0,79 (s) 0,95 (s) 1,1 (s) 3,52 (1H, d, J=11,0) 1,00 (s) 0,93 (s) 0,80 (s) 0,92 (s) 1,09 (s) 3,52 (2H, J=11,3) 28 29 30 H H 3,19 (1H, d, J=11,0) 3,05 (2H, J=11,3) 0,86 (3H,d,J= 6,5) 0,92 (d) 0,80 (3H,d,J= 6,5) 0,81 (d) *Hợp chất phân lập, ** tài liệu tham khảo [31] 13 C 13 C (*) 38,7 55,2 18,3 32,8 40,0 47,7 36,9 23,3 125,0 138,8 42,0 26,0 23,4 38,0 54,0 39,4 39,3 30,6 35,1 28,1 16,8 15,6 15,7 23,3 (**) 38,60 55,15 18,20 32,72 39,86 47,56 36,75 23,22 124,96 138,67 42,32 26,24 23,70 37,79 54,07 39,62 39,33 30,80 35,15 27,89 16,44 15,51 16,44 23,70 69,9 69,20 17,3 21,3 17,23 21,20 Dựa kết phân tích liệu phổ NMR, MS chất LARE1 nêu trên, so sánh số liệu phổ với tài liệu tham khảo [31] thấy có phù hợp, khẳng định cấu trúc hóa học chất LARE1 [3β,28-dihydroxyurs-12ene] đặt tên uvaol 3.2.2 Xác định cấu trúc hợp chất LARE2 (Ursolic acid) Cơng thức hóa học hợp chất LARE2 (Ursolic acid): [3β, hydroxyurs-12-en-28-oic acid] Hình 3.7 Cấu trúc hợp chất LARE2 Hợp chất LARE thu chất rắn màu trắng, mp: 284-285 oC Phổ ESI-MS cho pic ion giả phân tử m/z [M+H]+, 455; gợi ý cho CTPT C30H48O3 (M = 456) Phổ 1H-NMR cho tín hiệu đặc trưng hợp chất triterpene khung ursan, tương tự hợp chất LARE1 với tín hiệu nhóm methyl δH 1.01 (3H, s, H-27), 0.90 (3H, s, H-23), 0.86 (3H, d, J = 6.5 Hz, H-29), 0.85 (3H, s, H-24), 0.74 (3H, s, H-26), 0.70 (3H, s, H-25), 0.80 (3H, d, J = 6.5 Hz, H30) Bên cạnh cịn có tín hiệu nhóm CHOH vị trí δH 3.12 (1H, m, H-3) tín hiệu proton liên kết đơi vị trí δ H 5.16 (1H, t, J = 7.5 Hz, H-12) Khơng thấy có nhóm oxymethylene hợp chất LARE2 Hình 3.8 Phổ ESI-MS hợp chất LARE2 Hình 3.9 Phổ 1H NMR hợp chất LARE2 Hình 3.10 Phổ 1H NMR giãn rộng hợp chất LARE2 Phổ 13C-NMR DEPT cho tín hiệu 30 carbon tương tự hợp chất LARE1, sai khác nhóm oxymethylen thay nhóm carboxylic acid δC 180.5 (C-28) Hình 3.11 Phổ 13C-NMR hợp chất LARE2 Hình 3.12 Phổ DEPT hợp chất LARE2 Bảng 3.2 Số liệu phổ 1H-NMR 13C-NMR hợp chất LARE2 tài liệu tham khảo [32] Vị trí 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 (*) (**) 3,12 (1H, m) 2.95 (m) 5,16 (1H, t) 5,49 (s) H H 13 C (*) 38,5 27,9 78,8 39,0 55,1 18,2 32,9 39,3 47,5 36,8 23,1 125,4 138,0 41,9 26,7 24,1 47,7 52,7 38,8 13 C (**) 39,2 28,2 78,2 39,6 55,9 18,8 33,7 40,1 48,1 37,5 23,7 125,7 139,3 42,6 28,8 25,0 48,1 53,6 39,5 Vị 1 trí 20 21 22 23 24 25 26 27 (*) (**) 0,90 (3H, s) 0,85 (3H, s) 0,70 (3H, s) 0,74 (3H, s) 1,01 (3H, s) 1,24 (s) 1,02 (s) 0,92 (s) 1,06 (s) 1,24 (s) H H 28 29 30 0,86 (3H,d,J= 6,5) 1,02 (d) 0,80 (3H,d,J= 6,5) 0,97 (s) *Hợp chất phân lập, ** tài liệu tham khảo [32] 13 C 13 C (*) 38,6 30,6 36,7 27,9 15,2 15,47 16,8 23,4 (**) 39,4 31,1 37,4 28,8 16,5 15,7 17,5 24,0 180,5 179,7 16,9 21,0 17,5 21,4 Dựa kết phân tích liệu phổ NMR, MS chất LARE2 nêu trên, so sánh số liệu phổ hợp chất với tài liệu tham khảo [32] thấy có phù hợp, khẳng định cấu trúc hóa học chất [3β, hydroxy-urs-12en-28-oic acid] đặt tên ursolic acid 3.2.3 Xác định cấu trúc hợp chất LARE4 (Betulinic acid) Công thức hóa học hợp chất LARE4 (Betulinic acid): [3βhydroxy-20(29)-lupen-28-oic acid] Hình 3.13 Cấu trúc hợp chất LARE4 Hợp chất LARE4 phân lập dạng tinh thể màu trắng, điểm nóng chảy 290-292 0C Phổ ESI-MS xuất pic ion giả phân tử m/z [M+H]+ 457, gợi ý cho CTPT C30H48O3 (M = 456) Hình 3.14 Phổ ESI-MS hợp chất LARE4 Trên phổ 1H-NMR cho tín hiệu đặc trưng hợp chất triterpene khung lupane với tín hiệu hai olefinic proton thuộc nhóm CH2=C vị trí δH 4.67 (1H, d, J = 2.0, Ha-29), 4.55 (1H, br s, Hb-29), với tín hiệu nhóm methyl vị trí δH 1.63 (3H, s, H-30), 0.92 (3H, s, H-27), 0.86 (3H, s, H-23), 0.86 (3H, s, H-25), 0.75 (3H, s, H-26), 0.64 (3H, s, H-24) Bên cạnh cón có tín hiệu nhóm CHOH vị trí δH 2.98-2.91 (1H, m, H-3), tín hiệu nhóm hydroxyl δH 4.30 (1H, br s, OH-3) Hình 3.15 Phổ 1H NMR hợp chất LARE4 Phổ 13C-NMR HSQC cho tín hiệu 30 cacbon có nhóm CH3 δC 28.1 (C-23), 18.9 (C-30), 15.9 (C-26), 15.8 (C-24), 15.7 (C-25), 14.4 (C-27); 12 nhóm CH2 có nhóm CH 2=C δC 109.6 (C-29); nhóm CH có nhóm CHOH δC 76.8 (C-3) cacbon bậc bốn, trơng có nhóm C=O vị trí 177.2 (C-28) C=CH2 δC 150.3 (C-20) Hình 3.16 Phổ 13C-NMR hợp chất LARE4 Hình 3.17 Phổ HSQC hợp chất LARE4 Dựa kết phân tích liệu phổ NMR, MS chất LARE4 nêu trên, so sánh số liệu phổ hợp chất LARE4 với tài liệu tham khảo [18] thấy có phù hợp, khẳng định cấu trúc hóa học chất LARE4 [3βhydroxy-20(29)-lupen-28-oic acid] đặt tên betulinic acid Bảng 3.3 Số liệu phổ 1H-NMR 13C-NMR hợp chất LARE4 tài liệu tham khảo [18] Vị trí 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 (*) (**) 2.98-2.91 (m) 2.95 (m) 0.86 (s) 0.64 (s) 0.86 (s) 0.75 (s) 0.92 (s) 0.86 (s) 0.64 (s) 0.85 (s) 0.75 (s) 0.92 (s) H H 28 29 4.67 (1H,d,J= 2.0) 4.68 (1H,d, = 2.0) 13 C 13 C (*) 38.0 27.1 76.8 38.5 54.9 18.0 33.9 40.3 49.9 36.7 20.5 25.1 37.6 42.0 29.2 31.7 55.4 48.6 46.6 150.3 30.1 36.3 28.1 15.8 15.7 15.9 14.4 (**) 38.7 27.6 77.2 38.9 55.3 18.4 34.4 40.7 50.4 37.2 20.9 25.5 38.0 42.5 29.7 32.2 55.9 48.9 47.1 150.8 30.5 36.8 28.6 16.3 16.2 16.4 14.8 177.2 177.7 109.6 110.1 Vị trí 30 H H 13 C (*) (**) (*) 4.55 (1H, br s) 4.55 (1H, br s) 1.63 (s) 1.64 (s) 18.9 *Hợp chất phân lập, ** tài liệu tham khảo [18] 13 C (**) 19.4 Như vậy, từ dịch chiết ethyl acetate Adinandra rubropunctata, hợp chất triterpen hợp chất LARE1 (uvaol), hợp chất LARE2 (ursolic acid), hợp chất LARE4 (betulinic acid), phân lập xác định cấu trúc dựa phổ cộng hưởng từ hạt nhân (1H-NMR, 13C-NMR), phổ khối lượng (ESI-MS), so sánh với chất chuẩn tham khảo liệu phổ công bố ...ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN  PHẠM THỊ LAN PHƯỢNG NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA CÁC HỢP CHẤT TRITERPEN TRONG LÁ CÂY SUM ĐIỂM ĐỎ (Adinandra. .. hóa học hoạt tính sinh học hợp chất triterpen sum điểm đỏ (Adinandra rubropunctata)? ?? thực hiện, với mục tiêu: Phân lập hợp chất từ ethyl acetate Sum điểm đỏ xác định cấu trúc hóa học chất phân... vú (MCF7) Trong nghiên cứu tiếp tục nghiên cứu thành phần hóa học phận loài Adinandra rubropunctata Chương ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng nghiên cứu Mẫu sum điểm đỏ (A rubpropunctata)