Hình 1.6: Công thức hoá học của Acetylcholine
Hình 1.7: Mô hình trạng thái trung gian tương tác giữa chất dẫn truyền thần kinh acetylcholine với enzyme AChE làm lỏng lẻo liên kết C-O dẫn
1.2.2. Vai trò của AChE trong hoạt động thần kinh.
1.2.3. Cơ chế ức chế AChE.
Hình 1.9: Phospho của chất độc dư điện tích dương có xu hướng nhanh chóng tiến tới oxy của gốc Ser dư điện tích âm [144].
Hình 1.10: Mô hình trạng thái trung gian tương tác giữa chất độc
Hình 1.11: Hình thành liên kết vững chắc giữa phospho và oxy của nhóm P-O làm mất hoạt tính AChE
Hình 1.12: Thủy phân liên kết P-O cắt phần che lấp ester làm tái lập trung tâm hoạt động của AChE, có hoạt tính trở lại
Hình 1.13: Thủy phân liên kết R2O-P tạo thành RLOH và R2OH không cắt phần che lấp ester trong trung tâm hoạt động của AChE, enzyme không có hoạt tính trở lại
Hình 1.14: 2-PAM tiến gần đến AChE bị ức chế bởi chất độc hóa học thần kinh phospho hữu cơ hóa trị 5
Hình 1.15: 2-PAM tương tác với AChE đang bị ức chế bởi chất độc hóa học thần kinh phospho hữu cơ hóa trị 5
Hình 1.16: AChE được giải phóng khỏi chất ức chế là chất độc hóa học thần kinh phospho hữu cơ hóa trị 5
1.2.4. Nghiên cứu khả năng sử dụng AChE để phát hiện thuốc trừ sâu.
1.2.5. Ứng dụng của AChE.
1.3. Chất ức chế AChE.
1.3.1. Chất ức chế AChE từ thiên nhiên.
1.3.2. Các chất ức chế tổng hợp hóa học.
1.3.2.1. Các chất độc hóa học dùng trong chiến tranh.
Nhóm 2: Phospho hữu cơ
CHƢƠNG 2
2.2. Phƣơng pháp.
2.2.2. Tách chiết enzyme.
b) Loại bỏ tạp chất (sơ bộ làm sạch enzyme)
c) Tách enzyme bằng dung môi hữu cơ
2.2.3. Tinh sạch enzyme.
2.2.4. Kiểm tra độ sạch của AChE bằng điện di biến tính trên gel Polyacrylamide (SDS - PAGE).
a) Hóa chất
b) Tiến hành
2.2.5. Các phƣơng pháp xác định hoạt độ enzyme AChE.
* Cách tính hoạt độ AChE:
* Dụng cụ, hoá chất, nguyên liệu:
b) Xác định hoạt tính AChE theo phƣơng pháp đo quang phổ huỳnh quang.
2.2.7. Phƣơng pháp kế hoạch hoá thực nghiệm và xử lý số liệu.
CHƢƠNG 3
3.2. Kết quả khảo sát đặc điểm sinh học của ốc bƣơu vàng.
3.2.1. Kích thƣớc vỏ và tỉ lệ giới tính.
3.2.2.2. Ảnh hƣởng của độ sâu lớp nƣớc đến khả năng đẻ trứng và tỉ lệ chết của ốc bƣơu vàng.
3.2.3. Hàm lƣợng AChE của ốc bƣơu vàng qua các thời kỳ trong năm.
Bảng 3.4: Hoạt độ AChE trong mẫu ốc bươu vàng đợt 1 (tháng 2)
Bảng 3.5: Hoạt độ AChE trong mẫu ốc bươu vàng đợt 2 (tháng 5)
Bảng 3.6: Hoạt độ AChE trong mẫu ốc bươu vàng đợt 3 (tháng 8)
Bảng 3.7: Hoạt độ AChE trong mẫu ốc bươu vàng đợt 4 (tháng 11)
3.2.4. Lựa chọn nguồn tách chiết và tinh sạch AChE.
3.3. Tách chiết, nghiên cứu tính chất của AChE từ ốc bƣơu vàng.
3.3.1. Tinh sạch AChE bằng sắc ký trao đổi ion.
3.3.2. Kiểm tra độ sạch và xác định khối lƣợng phân tử của AChE bằng phƣơng pháp điện di trên Gel SDS-PAGE.
3.3.3. Quy trình tách chiết và tinh sạch AChE.
Hình 3.6: Quy trình tách và tinh sạch AChE từ ốc bươu vàng
Hình 3.7: Sắc ký trên máy HPLC của chế phẩm AChE
Bảng 3.9: Khối lượng phân tử của các protein chuẩn và chế phẩm AChE
3.3.4.2. Xác định hoạt độ thủy phân acetylcholine của chế phẩm AChE từ ốc bƣơu vàng.
3.4. Ảnh hƣởng của các yếu tố môi trƣờng đến hoạt độ AChE từ ốc bƣơu vàng.
3.4.1. Ảnh hƣởng của pH đến hoạt độ AChE.
3.4.2. Độ bền pH.
3.4.3. Ảnh hƣởng của nhiệt độ đến hoạt độ AChE.
3.4.4. Độ bền nhiệt.
3.4.5. Sự biến đổi hoạt độ AChE theo thời gian.
3.5. Ảnh hƣởng của một số chế phẩm trừ sâu đến hoạt độ AChE từ ốc bƣơu vàng.
3.5.2. Ảnh hƣởng của flavonoid tổng số chiết từ một số cây thuốc đến hoạt độ AChE.
3.5.3. Ảnh hƣởng của một số loại thuốc trừ sâu đến hoạt độ AChE từ ốc bƣơu vàng.
3.5.3.1. Ảnh hƣởng của thuốc trừ sâu Ofatox (Dipterex, Dylox) đến hoạt độ AChE.
3.5.3.2. Ảnh hƣởng của thuốc trừ sâu Secsaigon đến hoạt độ AChE.
3.5.3.3. Ảnh hƣởng của thuốc diệt ốc bƣơu vàng Dioto 250EC đến hoạt độ AChE.
3.5.3.4. Ảnh hƣởng của thuốc trừ sâu Topsin đến hoạt độ AChE.
3.6. Nghiên cứu động học ức chế của AChE.
3.6.1. Các thông số động học đặc trƣng VM, KM của AChE.
Hình 3.20: Quá trình tạo thành sản phẩm thiocholine của phản ứng thủy phân phụ thuộc vào nồng độ cơ chất (acetylthiocholine)
Bảng 3.11: Quá trình tạo thành sản phẩm thiocholine của phản ứng thủy phân cơ chất (acetylthiocholine) ở các nồng độ khác nhau
3.6.2. Nghiên cứu ảnh hƣởng ức chế của flavonoid từ các cây thuốc khác nhau.
3.6.3. Nghiên cứu ảnh hƣởng ức chế của flavonoid chiết từ cây Bạch đồng nữ.
Bảng 3.12: Ảnh hưởng ức chế của flavonoid chiết từ cây Bạch đồng nữ tới hoạt tính của chế phẩm AChE
Bảng 3.13: Ảnh hưởng của nồng độ flavonoid tới tốc độ V (mM/giây) của phản ứng thuỷ phân acetylcholine xúc tác bởi AChE
Bảng 3.15: Sự phụ thuộc của KMi/Ks vào [I]
3.7. Xây dựng phƣơng pháp phát hiện HCBVTV trên cơ sở sử dụng AChE.
Ảnh 3.1: Khả năng phát hiện thuốc trừ sâu của AChE ốc bươu vàng khi nồng độ thuốc tăng dần
Ảnh 3.2: Khả năng phát hiện thuốc trừ sâu trong các mẫu nước sông, hồ của AChE ốc bươu vàng
Ảnh 3.3: Khả năng phát màu của AChE ốc bươu vàng khi mẫu thí nghiệm có P2O5
Ảnh 3.4: Kiểm tra, phát hiện rau nhiễm thuốc BVTV bằng giấy đã tẩm AChE ốc bươu vàng
Ảnh 3.5: Kiểm tra, phát hiện chất độc bằng giấy đã tẩm AChE ốc bươu vàng
3.7.2. Nghiên cứu cố định AChE trên màng polymer đồng trùng hợp.
KẾT LUẬN
ĐỀ NGHỊ
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tiếng Anh
Tiếng Nga
Từ internet