Nghiên cứu thành phần hóa học và xây dựng quy trình chế biến sản phẩm có tác dụng tăng cường sức khỏe từ cua lột (scylla) TT

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ - NGUYỄN THỊ PHƢƠNG LAN NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ XÂY DỰNG QUY TRÌNH CHẾ BIẾN SẢN PHẨM CĨ TÁC DỤNG TĂNG CƢỜNG SỨC KHỎE TỪ CUA LỘT (SCYLLA) Chuyên ngành: Kỹ thuật Hóa học Mã số: 9.52.03.01 TĨM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ HĨA HỌC HÀ NỘI – 2021 Cơng trình đƣợc hồn thành tại: Học viện Khoa học Công nghệ Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam Người hướng dẫn khoa học 1: PGS TS Nguyễn Quyết Chiến Người hướng dẫn khoa học 2: TS Lê Tất Thành Phản biện 1: … Phản biện 2: … Phản biện 3: … Luận án bảo vệ trước Hội đồng đánh giá luận án tiến sĩ cấp Học viện, họp Học viện Khoa học Công nghệ - Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam vào hồi … ’, ngày … tháng … năm 2021 Có thể tìm hiểu luận án tại: - Thư viện Học viện Khoa học Công nghệ - Thư viện Quốc gia Việt Nam MỞ ĐẦU Tính cấp thiết luận án Ở nước ta, cua bùn (Scylla spp.) đối tượng thủy sản nước mặn-lợ truyền thống, có giá trị kinh tế-xã hội quan trọng cộng đồng ngư dân ven biển nguồn thực phẩm ưa thích số đơng người Việt Cùng với nghề ni cua truyền thống nghề nuôi cua lột (nuôi thu hoạch cua vừa lột xác) ngày phát triển, giúp làm tăng giá trị kinh tế cua đa dạng nghề nuôi thủy sản Cua lột giàu dưỡng chất nhiên sản phẩm cua lột sử dụng thực phẩm “ăn liền”, nghĩa dừng việc sơ chế, đóng gói, bảo quản cấp đơng tiêu thụ nội địa xuất để làm nguyên liệu cho nhà hàng chế biến hàng loạt ăn Các nghiên cứu thành phần hóa học, hoạt tính sinh học cua lột công nghệ chế biến làm tăng giá trị, bào chế sản phẩm có chất lượng cao cịn hạn chế Trong năm gần đây, xu hướng áp dụng công nghệ enzym lĩnh vực chế biến thực phẩm ngày phát triển mạnh mẽ, đặc biệt lĩnh vực chế biến thực phẩm chức từ hợp chất giàu dinh dưỡng, có hoạt tính sinh học cao giúp tăng cường sức khỏe Các đối tượng sinh vật biển nói chung động vật giáp xác nước mặn-lợ nói riêng đối tượng có hàm lượng protein cao sử dụng nguồn nguyên liệu lý tưởng để thu nhận hợp chất chức có hoạt tính sinh học đa dạng công nghệ enzym nhằm phục vụ phát triển sản xuất loại thực phẩm chức Với lý trên, để khẳng định giá trị cua lột nghiên cứu công nghệ chế biến nhằm tạo sản phẩm có giá trị dinh dưỡng có tác dụng tăng cường sức khỏe góp phần thúc đẩy nghề nuôi cua lột phát triển ổn định bền vững, lựa chọn đề tài luận án “Nghiên cứu thành phần hóa học xây dựng quy trình chế biến sản phẩm có tác dụng tăng cường sức khỏe từ cua lột (Scylla)” 2 Mục tiêu nghiên cứu luận án Nghiên cứu thành phần hóa học thăm dị hoạt tính sinh học cua lột; Nghiên cứu tối ưu quy trình thủy phân enzym quy trình sấy phun, sở xây dựng quy trình chế biến sản phẩm có tác dụng tăng cường sức khỏe từ cua lột Các nội dung nghiên cứu luận án - Nghiên cứu xác định thành phần hóa học, hoạt tính sinh học cua lột - Nghiên cứu, tối ưu hóa quy trình cơng nghệ thủy phân cua lột enzym, sấy phun để tạo sản phẩm bột cua lột thủy phân có tác dụng tăng cường sức khỏe - Đánh giá hoạt tính sản phẩm thủy phân cua lột chế phẩm bảo vệ sức khỏe từ bột cua lột thủy phân CHƢƠNG TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan cua Scylla spp Phần giới thiệu chung cua chi cua bùn (Scylla spp.) (đặc điểm hình thái, đặc tính sinh học, phân bố) Giới thiệu cua lột, nghề ni cua lột, tình hình sử dụng chế biến cua lột 1.2 Các nghiên cứu hóa học cua Phần tổng quan nghiên cứu giới thành phần hóa học hoạt tính sinh học lồi cua biển cua bùn Scylla 1.3 Giới thiệu công nghệ thuỷ phân enzym chế biến thực phẩm Phần giới thiệu công nghệ thủy phân, công nghệ enzyme ứng dụng enzyme chế biến thủy sản 1.4 Giới thiệu quy hoạch thực nghiệm tối ƣu hóa quy trình cơng nghệ hóa học Phần giới thiệu quy hoạch thực nghiệm, phương pháp bề mặt đáp ứng (RSM), phần mềm Design Expert 12.0 CHƢƠNG ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tƣợng nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu loài cua Scylla paramamosain giai đoạn lột xác thu mẫu xác định tên khoa học TS Nguyễn Thị Bích Ngọc – Viện Nghiên cứu Ni trồng thủy sản III Cua nguyên liệu có trọng lượng 100-120 g/con, chiều rộng mai từ 80 - 90 mm, bố trí ni riêng rẽ hộp nhựa (15 cm x 20 cm) hệ thống nuôi tuần hồn sử dụng thức ăn cơng nghiệp Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản III 2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu 2.2.1 Các phương pháp xác định thành phần hóa học *Độ ẩm: TCVN 3700-90 *Hàm lượng tro: TCVN 5105:2009 *Hàm lượng protein tổng số: phương pháp Kjeldahl (TCVN 3705:1990) * Hàm lượng axit amin xác định phương pháp HPLC, phương pháp thủy phân tiến hành theo KangLyung Woo (2003), phương pháp tạo dẫn xuất phân tích sắc ký thực theo Agilent Jajić (2013),Zeng (2013) * Lipid tổng : phương pháp E.G Bligh W.J Dyer * Thành phần hàm lượng lớp chất lipit phân tích xác định mỏng tráng s n Sorbfil theo Imbs A B (2015) * Xác định thành phần, hàm lượng axit béo sắc kí khí (GC, GC-MS theo phương pháp Carreau & Dubacq (1978) theo tiêu chuẩn ISO/FDIS 5590:1998 * Dạng phân tử lớp chất lipid phân cực xác định theo phương pháp Imbs (2015) Sikorskaya (2018) *Vitamin A, D, E: LC-MS/MS tham khảo AOAC 992.26, AOAC 2012.10 AOAC 2001.13 *Vitamin K: LC-MS/MS tham khảo TCVN 8974:2011 * Vitamin B2, B3: AOAC 2015.14 *Ca, Mg, Na, K, P, Fe, Zn: AOAC 2011.14 TCVN 10641:2014 *Cu, Mn: AOAC 2015.01 AOAC 2015.06 *Hàm lượng cholesterol: TCVN 12385:2018 phương pháp Marıa A Paulazo (2020) *Hàm lượng ecdysone: phương pháp Soumoff (1985) Lafont R (1994) 2.2.2 Phương pháp đánh giá hoạt tính sinh học 2.2.2.1 Hoạt tính chống lỗng xương in-vitro từ bột đạm thuỷ phân sản phẩm ngừa loãng xương từ cua lột: theo phương pháp Alcantara E.H (2011) Lai C.H (2014) 2.2.2.2 Hoạt tính kháng viêm phân đoạn lipid từ cua lột: đánh giá thông qua khả ức chế sinh NO theo phương pháp Liao H (2014), Tsai PJ (2007) Cheenpracha S (2010) 2.2.2.3 Hoạt tính chống oxy hóa phương pháp đo malondialdehyde (MDA assay): theo phương pháp Jelili A Badmus (2011) Engoor (2013) 2.2.2.4 Hoạt tính gây độc tế bào ung thư: thực dòng tế bào ung thư thực theo phương pháp Monks A (2011) Tim Mosmann (1983) 2.2.3 Phương pháp thủy phân công nghệ enzym Được thực theo phương pháp thủy phân cua bùn enzym protease tác giả Harun (2017) Độ thủy phân (DH) xác định theo phương pháp Nielsen (2001) Hàm lượng peptid dịch thủy phân bột cua lột thủy phân xác định theo phương pháp OPA tính tốn dựa vào phương trình đường chuẩn L-glutathion 2.2.5 Phương pháp quy hoạch thực nghiệm tối ưu hóa quy trình cơng nghệ Được áp dụng theo mơ hình kế hoạch trực giao bậc hai Box-Wilson Sử dụng phần mềm Design Expert 12.0 để xây dựng mơ hình tối ưu hóa thơng số cơng nghệ q trình CHƢƠNG THỰC NGHIỆM 3.1 Sơ chế xử lý mẫu cua lột 3.2 Sơ đồ nghiên cứu mẫu cua lột 3.3 Phân tích thành phần hóa học Phần mô tả thực nghiệm cách xác định thành phần hóa học cua lột: hàm lượng ẩm, tro, hàm lượng protein, lipid tổng, vitamin, khoáng chất, hàm lượng cholesterol ecdysone 3.4 Phân tích thành phần hàm lƣợng axit amin 3.5 Xác định thành phần hàm lƣợng axit béo 3.6 Xác định thành phần hàm lƣợng lớp chất lipid lipid tổng 3.7 Phân tích dạng phân tử lipid phân cực Phần trình bày cách xác định nhóm chất lipid phân cực theo thời gian lưu (bảng 3.2) liệu phổ khối phân giải cao (HRMS) 58 dạng phân tử phân lớp phospholipid bao gồm dạng PE, 23 dạng PC, 15 dạng PS, 10 dạng PI, dạng LPC dạng LPE Bảng 3.2 Khoảng thời gian lưu nhóm chất Phân lớp Nhóm chất Thời gian lƣu (phút) Phospholipid PE PC PS PI 4,9-6,0 5,6-10,3 13,3-15,2 15,1-18,1 LPC LPE 15,8-18,2 18,4-19,0 3.8 Thử nghiệm hoạt tính sinh học Phần mơ tả thực nghiệm xác định hoạt tính sinh học (gây độc tế bào ung thư, chống ơxy hóa phương pháp đo MDA, kháng viêm) phân đoạn lipid từ cua lột hoạt tính chống lỗng xương bột đạm thuỷ phân sản phẩm ngừa loãng xương từ cua lột 3.9 Nghiên cứu tối ƣu hóa q trình thủy phân cua lột enzym 3.9.1 Thiết bị nguyên liệu 3.9.2 Quy trình chung cho phản ứng thủy phân Mẫu cua lột nguyên liệu xay nhỏ Mỗi thí nghiệm cân lấy 50 g cho vào bình phản ứng, thêm lượng nước theo yêu cầu thí nghiệm Dung dịch nguyên liệu nước khuấy tốc độ 200 vòng/phút tiến hành ức chế enzym nội sinh 80oC 10 phút Sau thêm enzym cần thiết, phản ứng thủy phân tiến hành nhiệt độ, pH, với thời gian khác để xác định điều kiện tối ưu Quá trình thủy phân kết thúc cách tăng nhiệt độ lên 80oC 15 phút nhằm bất hoạt enzym Dịch thủy phân sau li tâm, lấy phần dịch để xác định độ thủy phân (DH) Mỗi thí nghiệm thực lần để lấy giá trị trung bình 3.9.3 Xác định độ thủy phân (phương pháp OPA) 3.9.4 Khảo sát yếu tố ảnh hưởng 3.9.5 Nghiên cứu tối ưu hóa q trình thủy phân Các yếu tố công nghệ nghiên cứu gồm: pH, nhiệt độ (oC), tỷ lệ enzym bromelain/cơ chất (%), tỷ lệ enzym chitinase/ chất (%), thời gian thủy phân (giờ) Hàm mục tiêu Y: Độ thủy phân (%) Lựa chọn mơ hình khảo sát theo Box-Wilson với k = 5, lựa chọn cánh tay đòn α = 1,546 số thí nghiệm tâm Tổng số thí nghiệm ma trận 27 3.10 Nghiên cứu tối ƣu hóa q trình sấy phun 3.10.1 Thiết bị nguyên liệu 3.10.2 Quy trình chung Dịch cua lột thủy phân sau lọc qua rây (rây mm) cho vào thùng 10 lít, khuấy nhẹ với tốc độ 80 vòng/phút bơm thẳng vào máy sấy phun có thơng số tốc độ đĩa phun, nhiệt độ khí sấy đầu vào tốc độ bơm dịch xác định Bột cua lột thủy phân thu buồng sấy sau 45 phút để phân tích Kết sấy phun đánh giá qua hai tiêu hàm lượng protein độ ẩm 3.10.3 Khảo sát yếu tố ảnh hưởng 3.10.4 Nghiên cứu tối ưu hóa q trình sấy phun Các yếu tố cơng nghệ khảo sát gồm: tốc độ đĩa phun (vòng/phút), nhiệt độ khí sấy đầu vào (oC), tốc độ bơm dịch (mL/phút) Hàm mục tiêu hướng đến Y1: Hàm lượng protein sản phẩm thu (g/100g), Y2: Độ ẩm sản phẩm (%).Lựa chọn mơ hình khảo sát theo Box-Wilson với k = 3, cánh tay đòn α = 1,215 số thí nghiệm tâm Tổng số thí nghiệm ma trận 15 thí nghiệm 3.11 Sản xuất bột cua lột thủy phân qui mô pilot 3.12 Sơ đồ định hƣớng nghiên cứu quy trình cơng nghệ tạo sản phẩm có tác dụng tăng cƣờng sức khỏe quy mơ phịng thí nghiệm Ngun liệu cua lột sơ chế, xay nhỏ thủy phân theo phương pháp ứng dụng công nghệ enzym Các điều kiện pH, nhiệt độ, tỷ lệ enzyme/cơ chất, thời gian thủy phân khảo sát, đánh giá tối ưu quy trình thủy phân nhằm đạt độ thủy phân cao Dịch thủy phân thu sau qua rây lọc 0,3 mm sấy phun để thu bột cua lột thủy phân Quy trình sấy phun tối ưu yếu tố tốc độ đĩa phun, nhiệt độ khí sấy đầu vào, tốc độ bơm dịch Bột cua lột thủy phân đánh giá tiêu chất lượng Để bào chế sản phẩm thực phẩm bảo vệ sức khỏe, số nguyên liệu bổ sung tá dược bổ sung bột cua lột, khuấy trộn đồng đóng gói thành phẩm CHƢƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Thành phần hóa học cua lột Scylla paramamosain 4.1.1 Các thành phần hóa học 4.1.1.1 Hàm lượng ẩm tro cua lột : trình bày bảng 4.1 Bảng 4.1 Hàm lượng tro ẩm cua lột Cua lột Tên thành phần Hàm lượng ẩm Hàm lượng tro Đơn vị tính Nguyên Gan tụy Thịt Mai vỏ mềm %/mẫu tươi 85,74 ± 2,06 82,50 ± 1,98 85,70 ± 2,06 81,9 ± 1,97 %/mẫu tươi 0,42 ± 0,03 0,39 ± 0,03 0,30 ± 0,02 0,56 ± 0,04 %/mẫu khô 2,98 ± 0,22 2,24 ± 0,17 2,12 ± 0,16 3,09 ± 0,23 4.1.1.2 Hàm lượng protein: hàm lượng protein cua nguyên con, gan tụy thịt đạt 4,56%, 7,98% 10,6% (tính KL tươi) 4.1.1.3 Hàm lượng lipid: hàm lượng lipid cua nguyên con, thịt tương đương đạt tương ứng 1,62%, 1,53%, trong gan tụy giàu lipid nhất, đạt 4,39% (tính khối lượng tươi) 4.1.1.4 Hàm lượng vitamin: xác định loại vitamin: A, E, K, B2, PP, vitamin E cao vitamin với giá trị từ 804,4-2708 µg/100g 4.1.1.5 Hàm lượng khoáng chất: xác định khống chất có khống đa lượng gồm Ca, P, Mg, Na, K khoáng vi lượng gồm Fe, Zn, Cu, Mn Hàm lượng Ca P mẫu cua lột đạt từ 0,55-2,29 g/100g và1,06-1,41 g/100g khối lượng khơ Zn có hàm lượng cao mẫu thịt cua lột nguyên (203,53 267,83mg/kg) 4.1.2 Thành phần hàm lượng axit amin Đã xác định 17 axit amin từ cua lột Scylla paramamosain Tương tự với hàm lượng protein, hàm lượng axit amin tổng số (TAA) thịt cua lột cao gấp lần cua lột nguyên với giá trị tương ứng 10,6 4,53 g/100g khối lượng tươi hàm lượng TAA gan tụy 8,22 g/100g khối lượng tươi Tỷ lệ EAA/TAA gần không thay đổi mẫu cua nguyên con, gan tụy thịt (từ 0,38-0,39) (bảng 4.4) 11 Khác Omega3 (n3) Omega (n6) PUFA/SFA 8,50±0,32 3,44±0,11 3,25±0,10 7,01±0,24 2,03±0,09 6,19±0,29 28,65±1,22 14,65±0,67 14,57±0,57 23,45±0,76 3,81±0,12 18,06±0,87 18,33±0,83 27,10±1,23 3,77±0,13 0,86 1,12 0,18 0,81 1,15 0,79 3,15 7,52 0,87 1,64 n-3/n-6 4.1.5 Xác định dạng phân tử lớp chất phospholipid Công thức cấu tạo nhóm chất phospholipid cua lột có dạng: Phosphatidyletanolamin (PE) Phosphatidylcholine (PC) O O R2 R1 O O R2 O O O P HO R1 NH2 O OH O O O O O P HO OH OH O HO O OH OH Phosphatidylserine (PS) Phosphatidylinositol (PI) Lysophosphatidylethanolamine (LPE) Lysophosphatidylcholine (LPC) Bằng phương pháp HPLC-HRMS xác định 58 dạng phân tử phân lớp phospholipid bao gồm dạng PE, 23 dạng PC, 15 dạng PS, 10 dạng PI, dạng LPC dạng LPE PE 38:5 38:6 40:6 34:1 PC 34:1 38:6 Kí hiệu % PE 18:0p/20:5 16:0/22:6 18:0p/22:6 16:0/18:1 Kí hiệu 16:0/18:1 16:0/22:6 39,12 30,03 28,39 2,46 % PC 10,59 9,78 PS 38:5 38:4 36:1 40:6 38:6 36:4 38:5 Kí hiệu 18:0/20:5 18:1/20:4 18:0/20:4 18:0/18:1 18:0/22:6 16:0/22:6 16:0/20:4 18:0/20:5 % PS 31,23 28,08 8,08 7,64 6,34 4,11 3,73 12 38:5 18:0a/20:5 7,03 36:5 38:4 18:0a/20:4 6,85 39:4 38:6 18:0a/22:6 18:1a/20:5 16:0a/22:6 16:0/16:1 14:0/18:1 37//5 36//2 36//4 36//1 36//5 30//0 38//5 36//3 36//1 40//6 40//7 36//2 40//7 35//8 Kí hiệu /20:5 /22:6 /20:4 6,04 38:6 32:1 37:5 36:2 36:4 36:1 36:5 30:0 38:5 36:3 36:1 40:6 40:7 36:2 40:7 35:8 LPE 20:5 22:6 20:4 2,89 37:5 16:0/20:5 18:0/21:4 19:0/20:4 17:0/20:5 5,28 34:1 16:0/18:1 1,52 3,27 38:2 18:0/20:2 1,20 5,94 5,95 5,68 5,02 4,52 4,48 4,00 3,82 3,64 2,76 2,13 1,74 1,17 0,31 % LPE 50,89 32,84 16,28 40:7 PI 38:5 38:4 39:4 38:6 36:5 38:4 36:4 36:4 38:7 39:4 18:1/22:6 Kí hiệu 18:0/20:5 18:0/20:4 19:0/20:4 18:1/20:5 16:0/20:5 18:0p/20:4 16:0/20:4 16:0p/20:4 18:2/20:5 18:0/21:4 1,03 % PI 27,94 26,24 18,40 11,89 9,86 1,47 1,22 1,03 0,99 0,98 LPC 20:5 22:6 20:4 Kí hiệu /20:5 /22:6 /20:4 % LPC 43,36 38,00 18,64 2,17 1,98 * Xác định dạng phân tử nhóm PE Trên phổ ion âm, ion [M-H]- có tín hiệu mạnh giá trị m/z 748,5128 (chiếm 39,12%) Công thức phân tử xác định C43H76NO7P (sai khác 0,01536, số liên kết đôi 8) alkenyl acylglycerophosphoethnanolamine Trên phổ MS2- thu đồng thời tín hiệu: m/z 301,2141 tương ứng với anion 20:5 [C20H29O2]-, m/z 283,2101 tương ứng với mảnh ion axit béo 20:5 phân tử H2O [C20H27O]- m/z 257,2249 tương ứng với mảnh ion axit béo 20:5 phân tử CO2 [C19H29]- Mảnh có tín hiệu m/z 464,3115 tương ứng với [C43H75NO7P]- mảnh phân tử trung hòa keten axit béo có m/z 284,2013 [C20H28O (axit béo 20:5 phân tử nước) Mảnh có tín hiệu m/z 329,2454 thu ion [M-H]mất phân tử C3H6NO4P phân tử C18H36O Mảnh m/z 403,2567 tín hiệu ion [M-H]- đồng thời etanolamin [C2H5N phân tử axit béo 20:5 [C20H30O2 Như vậy, liệu phổ khối chứng minh dạng phân tử PE xét alkenyl acyl PE 18:0p/20:5 Kiểm tra 13 GC, GC-MS thành phần axit béo phân đoạn lipid phân cực cua lột PE 18:0p/20:5n-3 Bằng cách tương tự, xác định dạng phân tử phospholipid cua lột Như vậy, cua lột đa dạng nhóm chất phospholipid (6 nhóm chất xác định) với nhiều dạng phân tử chứa axit béo không no đa nối đôi C20:4n-6 (AA), C20:5n-3 (EPA) C22:6n-3 (DHA) xác định qua phân tích phổ khối phân giải cao HRMS phân tích thành phần axit béo phân đoạn lipid phân cực GC-MS, có tiềm thể hoạt tính sinh học lý thú 4.1.6 Hàm lượng cholesterol ecdysone trình lột xác cua lột Cholesterol ecdysone hợp chất có thành phần lipid cua lột có vai trị quan trọng q trình lột xác cua Trong q trình ni cua lột, hàm lượng cholesterol tăng dần từ 2,54133,249 mg/mL, đạt cao mẫu sau lột 3h, nhiên hàm lượng ecdysone tăng dần từ nuôi đạt cực đại bắt đầu lột xác (mẫu Cho5) (từ 8,1*10-3-35,8*10-3 mg/mL), sau lột 3h hàm lượng ecdysone giảm mạnh cịn 19,9*10-3 mg/mL) 4.2 Kết đánh giá hoạt tính sinh học lớp chất lipid cua lột 4.2.1 Kết đánh giá hoạt tính kháng viêm Bảng 4.14 Khả ức chế sản sinh NO mẫu nghiên cứu Totallipid- Gan NL- Gan PoL-Gan L-NMMA Nồng độ % ức % ức % ức % tế % tế bào % tế bào % tế bào % ức chế (µg/ml) chế chế chế bào sống sống sống NO NO NO NO sống 100 58,56 104,21 35,25 97,45 62,88 95,86 92,12 92,12 20 25,76 101,11 11,15 104,11 23,60 104,41 75,64 75,64 11,08 0,36 8,06 30,36 0,8 0,29 -1,44 2,88 14,57 IC50 Nồng độ (µg/ml) 71,52±4,41 >100 Totallipid-Thịt % ức chế NO % tế bào sống 68,60±3,65 NL-Thịt % ức chế NO % tế bào sống 7,66±0,57 PoL-Thịt % ức chế NO % tế bào sống 14 100 20 0,8 IC50 52,52 84,22 14,17 97,99 2,86 -1,63 93,82±5,23 27,05 3,07 1,58 -7,48 99,30 106,10 >100 38,71 100,37 1,01 101,54 -0,14 -1,87 >100 Bảng 4.14 cho thấy tổng lipit cua lột có tác dụng ức chế sản sinh NO với IC50 71,5 µg/mL Đáng ý, phần lipid phân cực thể hoạt tính ức chế NO mạnh với IC50 68,6 µg/mL Chất đối chứng dương L-NMMA có giá trị IC50 7,66 µg/mL Kết cụ thể mẫu đối chứng dương, tế bào có khả sống 75,64% với mẫu lipid khả tế bào sống cao 97,99% - 106,1% nồng độ tương đương 20 µg/ml Điều cho thấy khả sống tế bào không bị ảnh hưởng mẫu lipid Hoạt tính kháng viêm phân đoạn lipid lý giải hàm lượng axit béo omega3 (n-3) mẫu cua lột cao, đặc biệt phần lipid phân cực 4.2.2 Kết đánh giá hoạt tính chống oxy hóa Các mẫu nghiên cứu khơng thể khả ức chế peroxy hóa lipid nồng độ 500 µg/ml Chất đối chứng dương Trolox hoạt động ổn định thí nghiệm Điều chứng tỏ tính bền oxy hóa phân đoạn lipid cua lột 4.2.3 Nghiên cứu hoạt tính gây độc tế bào ung thư Các phân đoạn lipid ức chế dòng tế bào ung thư với giá trị IC50 dao động từ 85,45 đến 97,34 µg/ml Lipid tổng thể họat tính gây độc tế bào dòng tế bào ung thư phổi SK-LU-1 ung thư vú MCF7 với giá trị IC50 tương ứng 89,71 97,77 µg/ml Đáng ý, lipid phân cực cho thấy độc tính tế bào cao năm dòng tế bào nghiên cứu với giá trị IC50 dao động từ 85,4 đến 95,8 µg/ml Chất đối chứng dương Ellipticine hoạt động ổn định thí nghiệm 15 4.3 Xây dựng tối ƣu hóa quy trình thủy phân cua lột enzym 4.3.1 Nghiên cứu lựa chọn enzym cho trình thủy phân Sau khảo sát, chọn kết hợp enzym chitinase enzym bromelain trình thủy phân cua lột thu sản phẩm 4.3.2 Nghiên cứu ảnh hưởng đơn yếu tố đến hàm mục tiêu trình Kết khảo sát ảnh hưởng yếu tố công nghệ đến hàm mục tiêu Độ thủy phân (DH) trình thủy phân xác định sau: pH 6,0, nhiệt độ 50oC, tỷ lệ nước/nguyên liệu 3/1, tỷ lệ enzyme/cơ chất 1%, thời gian 4.3.3 Nghiên cứu tối ưu hóa q trình thủy phân phương pháp bề mặt đáp ứng Từ kết nghiên cứu ảnh hưởng yếu tố công nghệ đơn biến đến hàm mục tiêu, lựa chọn mơ hình nghiên cứu theo mơ hình bậc Box-Wilson Các mức gốc (hay mức bản) yếu tố hệ số α = 1,546 (với k= 5) thể bảng 4.18 Bảng 4.18 Giá trị mức yếu tố ảnh hưởng Yếu tố pH Nhiệt độ (oC) Tỷ lệ enzym bromelain/cơ chất (%) Tỷ lệ enzym chitinase/cơ chất (%) Thời gian thủy phân (giờ) Mã hóa x1 x2 x3 x4 x5 -α 5,227 42,27 0,6135 0,6135 4,454 -1 5,5 45 0,75 0,75 6,0 50 1,0 1,0 +1 +α 6,5 6,773 55 57,73 1,25 1,3865 1,25 1,3865 7,546 Sử dụng phần mềm design expert 12.0 để xây dựng ma trận kế hoạch thực nghiệm với 27 thí nghiệm đánh giá hội tụ mơ hình thơng qua phân tích phương sai (ANOVA) Kết phân tích cho thấy mơ hình hồn tồn tương hợp với thực nghiệm Sau loại bỏ biến khơng có ý nghĩa (p> 0,05), hàm mục tiêu Y mơ hình xác định biểu diễn phương trình hồi quy bậc sau: 16 Y = 44,75 + 2,67x1 + 5,84x2 + 4,19x3 + 4,23x4 - 0,94x1x2 - 0,96x1x5 1,22x2x3 - 0,94x2x4 + 1,47x3x4 - 4,22x1² - 4,09x2² - 3,19x3² 2,41x4² - 1,26x5² Quy trình thủy phân tối ưu cho trình thủy phân cua lột đạt hàm mục tiêu Y (độ thủy phân) đạt giá trị lớn với mức độ quan trọng hàm mục tiêu Y mức giá trị biến nằm khoảng -1,546 ≤ x1, x2, x3, x4, x5 ≤ 1,546 Giải pháp tối ưu lựa chọn bảng 4.21 Tại điều kiện thơng số cơng nghệ, giá trị dự đốn hàm mục tiêu Y = 41,87% Bảng 4.21 Kết tối ưu hóa biến cơng nghệ Biến mã hóa x1 x2 x3 x4 x5 Các yếu tố Biến thực pH Nhiệt độ (oC) Tỷ lệ bromelain/cơ chất (%) Tỷ lệ chitinase/cơ chất (%) Thời gian (giờ) Giá trị tối ƣu yếu tố Biến mã hóa Biến thực 0,832 5,6 0,503 53 0,640 1,2 -0,823 0,8 0,067 phút Kết thực nghiệm điều kiện tối ưu đạt độ thủy phân 39,12%, gần với giá trị dự đoán hàm mục tiêu (41,87%) Như vậy, mơ hình tính tốn tối ưu phù hợp với thực nghiệm 4.4 Xây dựng tối ƣu hóa quy trình sấy phun sản phẩm thủy phân cua lột 4.4.1 Khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến chất lượng sản phẩm trình sấy phun Kết khảo sát ảnh hưởng yếu tố công nghệ đến hai hàm mục tiêu Y1 hàm lượng protein sản phẩm thu Y2 độ ẩm sản phẩm xác định giá trị mức sau: tốc độ đĩa phun 9000v/ph, nhiệt độ khí sấy đầu vào 140oC, tốc độ bơm dịch 45 mL/phút 4.4.2 Nghiên cứu tối ưu hóa q trình sấy phun phương pháp bề mặt đáp ứng Từ kết nghiên cứu ảnh hưởng yếu tố công nghệ đơn biến đến hàm mục tiêu Y1 Y2, lựa chọn mơ hình nghiên cứu theo mơ hình bậc Box-Wilson Các mức gốc (hay mức 17 bản) yếu tố hệ số α = 1,215 (với k= 3) thể bảng 4.26 Bảng 4.26 Các mức thí nghiệm biến cơng nghệ Biến thực Biến mã Khoảng biến thiên (Δ) A Z1: Tốc độ đĩa phun (vịng/phút) Z2: Nhiệt độ khí sấy vào (0C) Z3: Tốc độ bơm dịch (mL/phút) Mức nghiên cứu -α -1 +α 2000 6570 7000 9000 11000 11430 B 20 115,7 120 140 160 164,3 C 39 40 45 50 51 Sử dụng phần mềm Design Expert 12.0 để xây dựng ma trận kế hoạch thực nghiệm với 15 thí nghiệm đánh giá hội tụ mơ hình thơng qua phân tích phương sai (ANOVA) Kết phân tích cho thấy mơ hình hồn tồn tương hợp với thực nghiệm Sau loại bỏ biến khơng có ý nghĩa (p> 0,05), hàm mục tiêu Y1 Y2 mô hình xác định biểu diễn phương trình hồi quy bậc sau: Y1 = 66,26 + 4,63A+ 2,72B + 1,89C + 1,25 A*B – 7,21A² - 4,31B² 2,74C² (1) Y2 = 4,98 - 0,94A - 0,45B - 0,46C + 0,31AC - 0,32BC + 0,98A2 + 0,47B² + 0,27C² (2) Quy trình sấy phun tối ưu cho hàm mục tiêu Y1 (hàm lượng protein) đạt giá trị lớn Y2 (độ ẩm sản phẩm) đạt giá trị nhỏ Giải pháp tối ưu lựa chọn bảng 4.29 Tại điều kiện thơng số cơng nghệ, giá trị dự đốn hàm mục tiêu Y1 = 67,72 (g/100g) Y2 = 4,57 (%) Bảng 4.29 Kết tối ưu hóa biến cơng nghệ Biến mã hóa A B Biến thực C Tốc độ đĩa phun Nhiệt độ Tốc độ bơm (vịng/phút) khí sấy vào dịch 0,411 0,247 0,337 9.822 ( C) (mL/phút) 145 46,7 18 Kết thực nghiệm điều kiện tối ưu có giá trị gần với giá trị dự đoán hàm mục tiêu Do mơ hình tính tốn tối ưu phù hợp với thực nghiệm 4.5 Sản xuất bột cua lột thủy phân quy mô pilot 4.5.1 Quy trình sản xuất: Hình 4.25 Quy trình sản xuất bột cua lột thủy phân enzym 19 4.5.2 Thành phần hóa học sản phẩm thủy phân cua lột 4.5.2.1 Thành phần hàm lượng dinh dưỡng Hàm lượng ẩm bột cua lột thủy phân đạt 5,07% Hàm lượng protein bột cua lột thủy phân 65,67%, cao gấp lần so với cua lột nguyên (31,98% khối lượng khô) Hàm lượng peptid đạt 61,2% Hàm lượng lipid đạt 8,06% khối lượng khô Hàm lượng tổng axit amin bột cua lột thủy phân enzym có tỷ lệ tăng lên đáng kể, từ 31,77 g/100g khối lượng khô cua lột nguyên lên 65,58 g/100g khối lượng khô (Bảng 4.31) Điều giải thích bột cua lột thủy phân thu loại bỏ thành phần vỏ chitin mềm, phần mang, ngực thành phần không phân giải sau thủy phân Bảng 4.31 Thành phần hàm lượng axit amin bột cua lột thủy phân STT Chỉ tiêu Hàm lƣợng (%) STT Chỉ tiêu Hàm lƣợng (%) I Threonine 2,08 ± 0,01 Proline Leucine 4,28 ± 0,03 10 Serine 3,45± 0,01 Phenylalanine 1,20 ± 0,05 11 Glycine 2,31 ± 0,03 Isoleucine 2,71 ± 0,03 12 Cysteine 5,52 ± 0,04 Lysine 3,45 ± 0,03 13 Axit aspartic 4,31 ± 0,06 Valine 6,56 ± 0,02 14 Arginine 2,92 ± 0,03 Methionine 4,35 ± 0,04 15 Tyrosine 4,72 ± 0,01 Histidine 3,90 ± 0,02 16 Alanine 3,45 ± 0,04 17 Axit glutamic 1,63 ± 0,02 EAA 28,53 ± 0,04 NEAA 37,05 ± 0,02 TAA 65,58 ± 0,03 II Protein 65,67 ± 0,03 III Peptid 61,2 ± 0,02 IV Lipid 8,06 ± 0,12 V Độ ẩm 5,07 ± 0,12 8,74 ± 0,03 20 4.5.2.2 Thành phần hàm lượng khống chất Kết phân tích thành phần khống bột cua lột thủy phân xác định khoáng chất tương tự cua lột nguyên con, gồm Ca, P, Mg, Na, K, Fe, Zn, Cu, Mn (bảng 4.32) Đáng ý hàm lượng Ca P bột cua lột thủy phân đạt 1,16 0,86 g/100g khối lượng khô thấp không nhiều so với cua lột nguyên (1,76 1,13g/100g khối lượng khơ), điều chứng tỏ q trình thủy phân thu khoáng với hiệu suất cao (với Ca 65,9 P 76,1%) 4.5.2 Hoạt tính chống loãng xƣơng sản phẩm thủy phân cua lột sản phẩm thực phẩm chức Boness từ bột cua lột thuỷ phân Kết nghiên cứu hoạt tính cho thấy bột cua lột thủy phân sản phẩm thực phẩm bảo vệ sức khỏe Boness thể khả cảm ứng biệt hóa nguyên bào xương chống lỗng xương tốt nồng độ 20 µg/ml số tạo khoáng, tạo collagen tăng cường hoạt động ALP (P