Nghiên cứu xây dựng phương pháp real time rt pcr để phát hiện virus sars cov 2

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN THỊ DUNG NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP REALTIME RT-PCR ĐỂ PHÁT HIỆN VIRUS SARS-COV-2 LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC HÀ NỘI - 2021 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN THỊ DUNG NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP REALTIME RT-PCR ĐỂ PHÁT HIỆN VIRUS SARS-COV-2 LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC CHUYÊN NGÀNH HÓA SINH DƯỢC MÃ SỐ: 8720208 Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Đồng Văn Quyền PGS.TS Nguyễn Văn Rư HÀ NỘI - 2021 LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lịng kính trọng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Đồng Văn Quyền - Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học & Công nghệ Việt Nam PGS.TS Nguyễn Văn Rư – Trường Đại học Dược Hà Nội tận tình hướng dẫn quan tâm giúp đỡ tơi suốt q trình thực hồn thành luận văn Tơi xin trân trọng cảm ơn thầy cơng tác Bộ mơn Hóa sinh Phòng Sau đại học - Trường ĐH Dược Hà Nội giúp đỡ thời gian học tập trường Tôi xin cảm ơn Ban giám đốc - Bệnh viện Vũng Tàu tạo điều kiện cho học tập nghiên cứu Tôi xin chân thành cảm ơn tới tồn thể Cán phịng Vi sinh vật học phân tử - Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học & Công nghệ Việt Nam, đặc biệt Ths Nguyễn Thị Hoa hướng dẫn giúp đỡ tơi q trình thực luận văn Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới gia đình, bạn bè, đồng nghiệp giúp đỡ động viên tơi hồn thành tốt luận văn Hà Nội, ngày 30 tháng 03 năm 2021 Học viên Nguyễn Thị Dung MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN MỤC LỤC DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT DANH MỤC BẢNG DANH MỤC HÌNH ĐẶT VẤN ĐỀ Chương TỔNG QUAN .3 1.1 Tình hình đại dịch COVID-19…………………………………………3 1.1.1 Tình hình đại dịch COVID-19 giới 1.1.2 Tình hình đại dịch COVID-19 Việt Nam 1.2 Virus SARS-CoV-2……………………………………………………….7 1.2.1 Nguồn gốc lây nhiễm virus SARS-CoV-2 1.2.2 Cấu trúc hệ gen virus SARS-CoV-2 10 1.2.3 Sự chép virus SARS-CoV-2 13 1.2.4 Sự thay đổi RNA, kháng nguyên kháng thể IgM IgG bệnh COVID-19 16 1.3 Kỹ thuật phát virus SARS-CoV-2………………………………….18 1.3.1 Kỹ thuật sinh học phân tử 18 1.3.2 Kỹ thuật xét nghiệm huyết học 20 1.3.3 Kỹ thuật giải trình tự gen hệ 21 1.3.4 Kỹ thuật nuôi cấy virus 21 1.4 Phương pháp real-time PCR…………………………………………….22 1.4.1 Phương pháp real-time PCR 22 1.4.2 Ứng dụng realtime PCR y tế 25 Chương ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU………… 27 2.1 Đối tượng, nguyên liệu, thiết bị dùng nghiên cứu……………………….27 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 27 2.1.2 Nguyên liệu, thiết bị dùng nghiên cứu 28 2.1.3 Thời gian địa điểm nghiên cứu 28 2.2 Nội dung nghiên cứu…………………………………………………….28 2.3 Phương pháp nghiên cứu……………………………………………… 29 2.3.1 Thiết kế cặp mồi đặc hiệu 29 2.3.2 Phương pháp tổng hợp cDNA 29 2.3.3 Phương pháp PCR 30 2.3.4 Phương pháp điện di gel agarose 30 2.3.5 Phương pháp định lượng RNA máy quang phổ NanoDrop 30 2.3.6 Biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào vi khuẩn E coli 31 2.3.7 Tách chiết DNA plasmid từ vi khuẩn E coli 31 2.3.8 Chuẩn bị phản ứng qPCR với SYBR Green 32 2.3.9 Chuẩn bị phản ứng qRT-PCR với SYBR Green 32 2.3.10 Đánh giá tiêu kỹ thuật realtime RT-PCR phát virus SARS-CoV-2 33 Chương KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU………………………………………36 3.1 Thiết kế cặp mồi đặc hiệu cho kỹ thuật realtime RT- PCR phát SARS-COV-2……………………………………………………………… 36 3.2 Tạo chứng dương cho phản ứng realtime RT-PCR……… …………….38 3.2.1 Khuếch đại đoạn gen ORF1ab virus SARS-CoV-2 phân lập Việt Nam 38 3.2.2 Tạo dòng plasmid mang gen ORF1ab 39 3.3 Xác định hiệu khuếch đại đường chuẩn tuyến tính (R2) phản ứng qPCR…………………………………………………………………….41 3.4 Xác định ngưỡng phát (LOD) kỹ thuật realtime RT-PCR 42 3.5 Đánh giá độ đặc hiệu kỹ thuật realtime RT-PCR……………………… 46 3.6 Độ lặp lại kỹ thuật realtime RT-PCR 47 3.6.1 Độ lặp lại lần chạy 47 3.6.2 Độ lặp lại lần chạy khác nhau… 48 3.7 Đánh giá phương pháp realtime RT-PCR với mẫu lâm sàng giả định 49 Chương BÀN LUẬN…………………………………………………… 52 4.1 Thiết kế cặp mồi đặc hiệu cho kỹ thuật realtime RT- PCR phát SARS-COV-2 53 4.2 Tạo chứng dương cho phản ứng realtime RT-PCR 55 4.3 Xác định hiệu khuếch đại đường chuẩn tuyến tính (R2) phản ứng qPCR .57 4.4 Ngưỡng phát (LOD) kỹ thuật realtime RT-PCR .57 4.5 Đánh giá độ đặc hiệu kỹ thuật realtime RT-PCR……………………… 59 4.6 Độ lặp lại kỹ thuật realtime RT-PCR 60 4.7 Đánh giá phương pháp realtime RT-PCR với mẫu lâm sàng giả định 60 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ……………………………………………….62 TÀI LIỆU THAM KHẢO DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT TT Phần Phần viết tắt viết đầy đủ Tiếng Việt DNA Deoxyribonucleic acid Axit deoxyribonucleic ARDS Acute respiratory distress Hội chứng suy hô hấp cấp syndrome RNA ELISA Enzyme-linked FDA HIV GLP Ribonucleic acid Axit ribonucleic Phản ứng hấp phụ miễn immunosorben assay dịch có gắn enzym Food and Drug Cơ quan quản lý thuốc Administration thực phẩm Hoa Kỳ Human immunodeficiency Virus gây suy giảm miễn virus dịch người Good laboratory practice Thực hành tốt phòng thí nghiệm IgG Immunoglobulin G IgM Immunoglobulin M 10 IIFT Indirect Xét nghiệm miễn dịch ImmunoFluorescense huỳnh quang gián tiếp Technology 11 PCR Polymerase chain reaction Phản ứng khuếch đại chuỗi 12 qPCR Quantitative polymerase Phản ứng chuỗi polymerase chain reaction định lượng 13 RBD Receptor-Binding Domain 14 Tm Melting temperature Nhiệt độ nóng chảy 15 WHO World health organisation Tổ chức Y tế Thế giới DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1 Mẫu RNA số virus gây bệnh đường hô hấp dùng để đánh giá độ đặc hiệu 27 Bảng 3.1 Danh sách mồi sử dụng nghiên cứu 38 Bảng 3.2 Giá trị Ct Tm phản ứng nồng độ RNA khác 43 Bảng 3.3 Giá trị Ct Tm mẫu sử dụng đánh giá độ đặc hiệu phản ứng realtime RT-PCR 46 Bảng 3.4 Giá trị Ct Tm đánh giá độ lặp lại phản ứng realtime PCR 47 Bảng 3.5 Giá trị Ct Tm đánh giá độ lặp lại 20 lần chạy khác phản ứng realtime PCR 49 Bảng 3.6 Giá trị Ct Tm phản ứng realtime RT-PCR với mẫu âm tính mẫu lâm sàng dương tính giả định 50 DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Phát sinh loài betaronavirus giống SARS bao gồm chủng virus corona SARS-CoV-2 Hình 1.2 Minh họa cắt ngang virus SARS-CoV-2 cho thấy thành phần bên 10 Hình 1.3 Vùng ′ UTR ′ UTR vùng mã hóa COVID-19, SARSCoV MERS-CoV 11 Hình 1.4 Cấu trúc tổng thể chế lây nhiễm SARS-CoV-2 13 Hình 1.5 Chu trình nhân lên SARS-CoV-2 chất ức chế 15 Hình 1.6 Sự thay đổi mức độ RNA, kháng nguyên (antigen) SARS-CoV2, kháng thể IgM IgG người trình nhiễm SARS-CoV-2 trình hồi phục 17 Hình 1.7 Vị trí thăm dò mồi RT-qPCR gen SARS-CoV-2 liệt kê WHO 19 Hình 1.8 Cơ chế hoạt động SYBR Green 23 Hình 2.1 Sơ đồ thiết kế nghiên cứu 29 Hình 3.1 Kết so sánh trình tự đoạn gen vùng ORF1ab 36 Hình 3.2 Danh sách mồi xuôi mồi ngược đặc hiệu vùng gen ORF1ab SARS-CoV-2 37 Hình 3.3 Sản phẩm PCR khuếch đại đoạn gen ORF1ab virus SARSCoV-2 phân lập Việt Nam 38 Hình 3.4 Điện di gel agarose DNA plasmid tách từ vi khuẩn E coli DH5α 39 Hình 3.5 Điện di gel agarose sản phẩm cắt DNA plasmid enzym giới hạn EcoRI 40 Hình 3.6 Trình tự vùng gen ORF1ab SARS-CoV-2 phân lập Việt Nam 41 Hình 3.7 Đồ thị tín hiệu huỳnh quang khuếch đại DNA nồng độ khác nhau: 1,5 x 102; 1,5 x 103;1,5 x 104; 1,5 x 105; 1,5 x 106; 1,5 x 107; 1,5 x 108 sao/phản ứng 42 Hình 3.8 Phương trình đường tuyến tính phản ứng realtime PCR với SYBR Green 42 Hình 3.9 Biểu đồ tín hiệu huỳnh quang đỉnh nóng chảy phản ứng realtime PCR nồng độ RNA 5x10, 5x102, 5x103, 5x104 5x105 sao/phản ứng 43 Hình 3.10 Đồ thị phương trình đường tuyến tính xác định ngưỡng phát (LOD) nồng độ RNA 5x10, 5x102, 5x103, 5x104 5x105 sao/phản ứng 44 Hình 3.11 Đồ thị phương trình đường tuyến tính xác định ngưỡng phát (LOD) nồng độ RNA 100, 150, 200, 250 300 sao/phản ứng 45 Hình 3.12 Biểu đồ tín hiệu huỳnh quang đỉnh nóng chảy phản ứng realtime PCR nồng độ RNA 100, 150, 200, 250 300 sao/phản ứng 45 Hình 3.13 Đồ thị biểu diễn độ đặc hiệu phương pháp realtime RT-PCR 47 Hình 3.14 Biểu đồ tín hiệu huỳnh quang đỉnh nóng chảy đánh giá phản ứng realtime RT-PCR với mẫu lâm sàng giả định 51 sinh bệnh học virus [24, 45] Gen mã hóa protein E bảo thủ với biến đổi SARS-CoV-2 SARS-CoV khoảng 5,3%, có tính đặc hiệu cao chẩn đốn COVID-19 [18] Protein N có vai trị quan trọng q trình tổng hợp phiên mã RNA virus [20, 42] Protein N có mức độ biến đổi (9,6%) SARS-CoV-2 SARS-CoV Sự bảo thủ gen N có giá trị việc chẩn đoán SARS-CoV-2 [21] ORF1ab chiếm tới 2/3 chiều dài hệ gen virus, mã hóa cho 16 protein không cấu trúc liên quan tới phiên mã dịch mã virus, RdRp đóng vai trị quan trọng tái virus lý để gen chọn làm gen đích chẩn đốn [21] Các nghiên cứu gần tập trung vào gen ORF1ab làm gen đích phát virus SARS-CoV-2 Trong khn khổ thời gian thực luận văn, lựa chọn gen ORF1ab cho nội dung nghiên cứu nhằm xây dựng phương pháp phát SARS-CoV-2 kỹ thuật realtime RT- PCR sử dụng chất phát quang SYBR Green Trong xét nghiệm tác nhân gây bệnh virus, vi khuẩn,…sử dụng kỹ thuật PCR hay realtime PCR, mồi/primer đóng vai trị định thành cơng xét nghiệm Các cặp mồi phải thiết kế cho chúng bắt cặp đặc hiệu với trình tự đối tượng cần phát mà không bắt cặp với trình tự DNA tác nhân khác, mồi xuôi mồi ngược không bắt cặp với Trong nghiên cứu này, cặp mồi thiết kế dựa việc so sánh trình tự gen, vùng gen SARS-CoV-2, SARS-CoV MERS-CoV đăng ký Genbank trình tự đoạn gen giải mã từ chủng virus SARS-CoV-2 gây bệnh bệnh nhân Việt Nam mơ tả phần phương pháp Các trình tự mồi thiết kế lựa chọn, sàng lọc công cụ tin sinh, sau kiểm nghiệm lại mẫu RNA virus SARS-CoV-2 virus gây bệnh đường hơ hấp khác Từ đó, chúng tơi lựa chọn cặp mồi đặc hiệu 54 cho xây dựng phương pháp realtime RT- PCR sử dụng SYBER Green để phát SARS-CoV-2 (Bảng 3.1) 4.2 Tạo chứng dương cho phản ứng realtime RT-PCR Trong kỹ thuật xét nghiệm kỹ thuật sinh học phân tử realtime PCR cần có chứng dương để kiểm sốt hoạt động xét nghiệm giúp loại trừ nguyên nhân ảnh hưởng đến kết xét nghiệm hóa chất, sinh phẩm hỏng hay q trình thao tác chuẩn bị xét nghiệm sai sót mà phản ứng bị thiếu thành phần đó, kết cho kết âm tính với chứng dương Vì vậy, nghiên cứu tiến hành tạo chứng dương cho phương pháp realtime RTPCR phát SARS-CoV-2 Để tạo chứng dương, gen ORF1ab SARSCoV-2 khuếch đại PCR sau tách dòng vào vector pCR2.1 Plasmid tái tổ hợp biến nạp vào tế bào khả biến E.coli chủng DH5 Nhờ máy tổng hợp vi khuẩn, plasmid tái tổ hợp nhân lên với số lượng lớn Quá trình biến nạp vectơ tái tổ hợp vào tế bào khả biến thực phương pháp sốc nhiệt Trình tự tiến hành trình bày phần phương pháp nghiên cứu pCR2.1 vector tách dòng thiết kế đầu so le, mang gen Lac-Z tổng hợp nên β-galactosidase có khả chuyển hố X-gal thành hợp chất có màu xanh Do đó, tế bào nhận vector tự đóng vịng có gen Lac-Z hoạt động thường tạo enzym β-galactosidase chuyển hoá X-gal nên khuẩn lạc có màu xanh Cịn khuẩn lạc màu trắng nhận plasmid tái tổ hợp có đoạn DNA ngoại lai xen vào lac promoter gen cấu trúc LacZ nên khơng có hình thành enzym β-galactosidase để phân huỷ X-gal Kết biến nạp cho thấy, môi trường chọn lọc, xuất khuẩn lạc xanh, trắng riêng rẽ Theo lý thuyết điện di, phân tử DNA có kích thước lớn di chuyển chậm nên đường chạy điện di ngắn, phân tử 55 kích thước nhỏ gọn di chuyển dễ dàng qua mạng lưới gel agarose nên đường chạy điện di dài DNA plasmid tách chiết từ khuẩn lạc màu xanh, plasmid gốc không mang gen ngoại lai, nên sử dụng làm đối chứng Do đó, điện di gel agarose 1%, plasmid chứa gen ngoại lai có đường chạy cao plasmid đối chứng có kích thước lớn Quan sát kết điện di Hình 3.4, chúng tơi nhận thấy DNA plasmid kênh số 3, 4, 11 kí hiệu pCRO_2, pCRO_3, pCRO_8 pCRO_10 có đường chạy cao đường chạy kênh số (Đối chứng, plasmid khơng mang gen) Điều chứng tỏ, dịng có khả mang gen ngoại lai Tuy nhiên, nhận thấy DNA plasmid tách chiết từ khuẩn lạc màu trắng khác lại có đường chạy với đường chạy plasmid đối chứng Điều giải thích trình thao tác cắt, nối plasmid gen Lac Z bị đứt gẫy vài nucleotide dẫn đến sai lệch khung đọc (ORF) không hoạt động nên không phiên mã tạo enzym β-galactosidase, kết X-gal không chuyển hóa, tạo nên khuẩn lạc có màu trắng Theo thiết kế, vector tách dịng pCR ®2.1 có vị trí cắt enzym EcoRI đầu vùng cắt đa vị sát vị trí gắn sản phẩm PCR Nếu vector mang gen điện di tạo thành băng, băng sản phẩm PCR băng vector gốc Kết (Hình 3.5), dịng pCRO_2, pCRO_3, pCRO_8 pCRO_10 mang gen mong muốn Để lựa chọn dòng plasmid tái tổ hợp mang gen ORF1ab, chúng tơi tiến hành giải trình tự DNA Kết phân tích trình tự cho thấy, gen ngoại lại tách dịng vào pCR2.1 ORF1ab virus SARS-CoV-2, có kích thước 1280 bp (Hình 3.6) 56 4.3 Xác định hiệu khuếch đại đường chuẩn tuyến tính (R2) phản ứng qPCR Phương trình tuyến tính (R2) phương trình biểu diễn mối tương quan chu kì ngưỡng (y = Ct) với log10 số lượng đích ban đầu có ống phản ứng (x), hàm số dạng: y = ax + b Trong đó, a slope hay gọi độ dốc đường tuyến tính, b –intercept, đường hiển thị biểu đồ chuẩn Dựa vào giá trị slope tính hiệu phản ứng theo công thức E = 10-(1/slope) - [13] Để kiểm tra độ tuyến tính hiệu phản ứng, chuẩn bị nồng độ pha lỗng từ DNA plasmid tách dịng mang gen với nồng độ ban đầu 3x1010 sao/µL, sử dụng µL cho nồng độ/phản ứng Kết quả, phương trình tuyến tính là: y = -3,3861x + 44,531, hệ số tương quan R² = 0,9931, hiệu phản ứng đạt 100% Kết thực lặp lại khơng có khác biệt kết lần thí nghiệm Hệ số tương quan R đánh giá độ xác thao tác kỹ thuật Hiệu phản ứng (E) thơng số có giá trị để nhà nghiên cứu tối ưu kỹ thuật realtime RT- PCR Nếu hiệu PCR thấp thiết kế mồi chưa đạt độ nhạy Theo Adams, phản ứng realtime tối ưu cần phải có hệ số tương quan R² ≥ 0,98, hiệu khuếch đại đạt 90 – 105% [13] Như vậy, phản ứng realtime với cặp mồi thiết kế nghiên cứu đạt yêu cầu độ tuyến tính, hay nói cách khác cho độ xác cao 4.4 Ngưỡng phát (LOD) kỹ thuật realtime RT-PCR Realtime PCR xem chuẩn vàng để phát virus SARS-CoV2 với độ xác cao Các nghiên cứu trước đây, kit chẩn đoán SARS-CoV-2 thương mại hoá gần đầu chủ yếu sử dụng Taqman probe Tuy nhiên, việc phụ thuộc vào Taqman probe đại dịch xảy toàn cầu, nguồn cung sinh phẩm hạn chế, không đủ để cung cấp tồn giới, bên cạnh giá thành xét nghiệm chẩn đoán realtiem PCR sử dụng Taqman probe cao, đo việc phát triển 57 kỹ thuật realtime PCR sử dụng chất phát quang rẻ hơn, nguồn cung dồi cần thiết Do realtime PCR sử dụng SYBR Green quan tâm Tuy nhiên, việc giảm giá thành xét nghiệm khơng có ý nghĩa phương pháp khơng đảm bảo độ xác, độ nhạy/ngưỡng phát độ đặc hiệu Ngưỡng phát phản ứng realtime hiểu số lượng tế bào nồng độ acid nucleic thấp cho kết dương tính tất lần thí nghiệm 95% số lần lặp lại [39] Khác với realtime PCR sử dụng Tagman prboe, để phân tích kết phản ứng realtime PCR sử dụng SYBR Green cần dựa phân tích nhiệt độ nóng chảy (Tm) sản phẩm Ganguly cộng nghiên cứu sử dụng realtime RT-PCR với SYBR Green phát virus SARS-CoV-2 dựa gen N, ORF1b LOD với gen đích ORF1b 256-1024 sao/phản ứng [25] Bên cạnh đó, Marianoel cộng có nghiên cứu đánh giá realtime PCR với SYBR Green cho việc chẩn đoán phát virus SAR-CoV-2 từ mẫu bệnh phẩm dựa gen N ORF1b-nsp14 Nghiên cứu rằng, LOD cho gen ORF1b-nsp14 N 10 sao/phản ứng với kỹ thuật qPCR sử dụng probes Trong khi sử dụng với SYBR Green LOD 50 sao/phản ứng cho gen ORF1b-nsp14 250 sao/phản ứng cho gen đích N [35] Đồng Văn Quyền cộng sử dụng phương pháp realtime PCR với Taqman probe để phát virus SAR-CoV-2 dựa gen N ORF1ab cho giá trị LOD tương ứng 50 sao/phản ứng gen N 25 sao/phản ứng với gen ORF1ab (Báo cáo tổng kết đề tài cấp Viện Hàn lâm KHCN Việt Nam) Phân tích giá trị LOD phương pháp realtime RT- PCR sử dụng SYBR Green xây dựng đề tài luận văn (Hình 3.11 Hình 3.12), chúng tơi xác định ngưỡng phát phản ứng 100 RNA/phản ứng, Ct< 35, Tm ~ 82oC Kết tương đồng với kết nghiên cứu trước, cần tiếp tục nghiên cứu tối ưu 58 điều kiện phản ứng nhiệt độ bắt cặp, nồng độ mồi, sinh phẩm… để tăng độ nhạy xét nghiệm 4.5 Đánh giá độ đặc hiệu kỹ thuật realtime RT-PCR Realtime PCR định lượng (qPCR) kỹ thuật sử dụng rộng rãi việc xác định định lượng DNA đích qPCR dựa tín hiệu huỳnh quang để đo tổng lượng DNA đích có mặt chu kỳ khuếch đại q trình PCR Tín hiệu huỳnh quang phổ biến TaqMan probe thuốc nhuộm liên kết DNA sợi đôi (SYBR Green) Phương pháp phát dựa SYBRGreen có số ưu điểm so với phương pháp hóa học TaqMan, rẻ không yêu cầu tổng hợp đầu dò cụ thể Tuy nhiên, DNA sợi kép bao gồm sản phẩm PCR không đặc hiệu dimer mồi, thường xảy vào giai đoạn cuối chu kỳ nhiệt Taq polymerase hoạt động kém, dẫn đến kết dương tính giả kết chẩn đốn dựa liệu khuếch đại Vì lý này, điều quan trọng phải kiểm sốt tính đặc hiệu tín hiệu huỳnh quang quan sát cuối PCR cách phân tích đường cong nóng chảy (Tm melting curve) Bằng phân tích Tm phân biệt sản phẩm khuếch đại đặc hiệu sản phẩm không đặc hiệu Tm phụ thuộc vào chiều dài tỷ lệ bazơ nitơ A, T, G, C sản phẩm PCR Độ đặc hiệu kỹ thuật phương pháp định lượng bẳng realtime PCR định nghĩa khả nhân chọn lọc vật liệu di truyền tác nhân đích khả định lượng xác trường hợp có chất ức chế diện mẫu [33] Kết đánh giá cho thấy, kỹ thuật realitme PCR xây dựng có độ xác cao, cặp mồi thiết kế có độ đặc hiệu cao, bắt cặp đặc hiệu với SARS-CoV-2, không phản ứng chéo với virus bệnh đường hô hấp khác ( Bảng 3.3) Dựa vào kết Tm, chúng tơi xác định xác mẫu xét nghiệm SARS-CoV-2 mẫu dương tính giả Đỉnh biểu đồ nóng chảy (Tm) sản phẩm PCR không đặc 59 hiệu không trùng với Tm sản phẩm PCR từ RNA SARS-CoV-2 hay DNA plasmid chứng dương 4.6 Độ lặp lại kỹ thuật realtime RT-PCR Độ lặp lại (repeatability) tiêu cần đánh giá kit chẩn đoán nghiên cứu tiền lâm sàng Một phương pháp chẩn đoán tốt kết sau lần chạy khác phải giống nhau, hay nói cách khác phải có tính lặp lại Độ lặp lại thể qua hệ số biến thiên (Coefficent of variation - CV), phản ánh sai lệch kết xét nghiệm Các sai lệch người thao tác, hố chất thí nghiệm, dụng cụ thiết bị,… Đối với phương pháp định lượng hệ số biến thiên nên nhỏ 10% Kết nghiên cứu cho thấy, phương pháp realtime RT- PCR sử dụng SYBR Green cho kết ổn định, có tính lặp lại cao, đáp ứng yêu cầu kỹ thuật xét nghiệm 4.7 Đánh giá phương pháp realtime RT-PCR với mẫu lâm sàng giả định Tách chiết vật liệu di truyền (RNA) khâu quan trọng kỹ thuật xét nghiệm Do đó, việc tạo mẫu RNA giả định giúp đánh giá phương pháp gần sát với mẫu thực tế (mẫu bệnh phẩm lâm sàng) Mọi phương pháp, kỹ thuật xét nghiệm khơng có giá trị khơng phát tác nhân gây bệnh quan tâm mẫu bệnh phẩm lâm sàng Phản ứng PCR/realtime PCR bị ức chế thành phần có mẫu tách từ dịch họng người, bắt cặp không đặc hiệu với RNA người vi khuẩn, vi rút,…khác có lẫn dịch họng, qua ảnh hưởng đến độ đặc hiệu phản ứng Do quy định an toàn sinh học nên chúng tơi chưa có điều kiện đánh giá độ đặc hiệu lâm sàng phương pháp với mẫu bệnh phẩm lâm sàng Để đánh giá khả hoạt động phương pháp realtime RT- PCR sử dụng SYBR Green mà đề tài tạo ra, tạo mẫu SARS-CoV-2 giả lâm sàng Kết Bảng 3.6 cho thấy, số mẫu âm tính mẫu có giá trị Ct