Nghiên cứu xây dựng phương pháp phân tích và đánh giá hàm lượng hoạt chất acid ferulic và acid chlorogenic trong lá và bột lá cây riềng ấm (alpinia zerumbet) theo mùa và các giai đoạn sinh trưởng

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI Viện Công nghệ Sinh học Công nghệ Thực phẩm LUẬN VĂN THẠC SĨ Nghiên cứu xây dựng phương pháp phân tích đánh giá hàm lượng hoạt chất Acid Ferulic Acid Chlorogenic bột riềng ấm (Alpinia Zerumbet) theo mùa giai đoạn sinh trưởng HOÀNG TRUNG HIẾU hoangtrunghieu@sis.hust.edu.vn Ngành Công nghệ thực phẩm Giảng viên hướng dẫn: PGS.TS: Nguyễn Thị Thảo Chữ ký GVHD Viện: Viện Công nghệ Sinh học Công nghệ Thực phẩm HÀ NỘI, 06/2021 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan, nội dung luận văn kết tìm tịi, nghiên cứu, sưu tầm từ nhiều nguồn tài liệu liên hệ với thực tiễn Các số liệu luận văn trung thực không chép từ luận văn đề tài nghiên cứu trước Tơi xin hồn tồn chịu trách nhiệm nội dung trình bày Tác giả HỒNG TRUNG HIẾU i LỜI CẢM ƠN Trong trình theo học chương trình cao học chun nghành Cơng nghệ thực phẩm Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội thời gian nghiên cứu, hoàn thiện luận văn ngày hơm kết q trình học tập với say mê dày công nghiên cứu thân Nhưng để tơi có kết nhờ giảng dạy, bảo nhiệt tình thầy, Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội ủng hộ đồng nghiệp, bạn bè gia đình Tơi xin trân trọng cảm ơn Ban Giám hiệu,Viện Đào sau Đại học, giảng vên Viện CN Sinh học CN Thực phẩm Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội giảng dạy tạo điều kiện giúp đỡ khóa học q trình thực luận văn Đặc biệt tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS :Nguyễn Thị Thảo, Ths Lê Hồng Dũng người tận tình hướng dẫn tơi q trình hồn thiện luận văn Tơi xin chân thành cảm ơn Lãnh đạo bạn đồng nghiệp Khoa Hóa Thực phẩn , Viện Dinh Dưỡng nơi tơi cơng tác để hoàn thành tốt luận văn Và thời gian học tập thời gian làm luận văn, nhận cộng tác chân thành học viên học xin gửi lời cám ơn tới họ cộng tác giúp đỡ thời gian qua Cuối xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, bạn bè ủng hộ suốt thời gian học tập làm luận văn tốt nghiệp Xin chân thành cám ơn! Hà Nội, tháng 04 năm 2021 Tác giả Hoàng Trung Hiếu ii TÓM TẮT LUẬN VĂN Nghiên cứu hướng tới xây dựng phương pháp xác định hoạt chất acid ferulic acid Chlorogenic bột chế biến từ Shell Ginger Nội dung nghiên cứu bao gồm: xây dựng quy trình chiết tách thẩm định thông số phù hợp để định lượng hoạt chất acid Ferulic acid Chlorogenic kỹ thuật HPLC Sử dụng quy trình xác định hàm lượng hai hoạt chất tươi bột riềng ấm Xây dựng quy trình chiết tách: lựa chọn điều kiện sắc ký : pha động, chương trình pha động, cột phân tích Xây dựng quy trình xử lý mẫu tối ưu nhất:nghiên cứu quy trình phân tích phù hợp với phịng thí nghiệm, khảo sát thời gian siêu âm, nhiệt độ siêu âm, khảo sát số lần chiết mẫu Thẩm định phương pháp : độ ổn định hệ thống, tính chọn lọc, khảo sát khoảng tuyến tính lập đường chuẩn giới hạn phát giới hạn định lượng, độ lặp lại độ thu hồi phương pháp theo AOAC 2016 Kết thúc nghiên cứu sử dụng phương pháp xây dựng phân tích đánh giá hàm lượng bột riềng ấm 33 mẫu lấy xản xuất theo khoảng thời gian khác Từ khóa: “Xây dựng phương pháp xác định hàm lượng acid ferulic acid Chlorogenic bột chế biến từ riềng ấm” HỌC VIÊN Ký ghi rõ họ tên iii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii TÓM TẮT LUẬN VĂN iii MỤC LỤC iv DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT vi DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ vii DANH MỤC CÁC BẢNG viii LỜI MỞ ĐẦU CHƯƠNG I: TỔNG QUAN 1.1.Tổng quan riềng ấm 1.1.1.Đặc điểm thực vật 1.1.2.Thành phần hóa học 1.1.3 Tác dụng sinh học riềng ấm 1.1.4 Một số phương pháp phân tích Acid Ferulic Acid Chlorogenic 11 1.2 Sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) 14 1.2.1 Phương pháp lựa chọn điều kiện sắc ký 14 1.2.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến kết phân tích 15 CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16 2.1 Đối tượng nghiên cứu 16 2.2.1 Chất chuẩn 16 2.2.2 Chuẩn bị dung dịch chuẩn 16 2.2.3 Chuẩn bị dung dịch mẫu placebo 16 2.2.4 Dung mơi hóa chất 17 2.2.5 Thiết bị, dụng cụ 17 2.2.6 Phương pháp nghiên cứu 17 2.3 Nội dung nghiên cứu 18 2.3.1 Khảo sát điều kiện phân tích Acid Ferulic & Acid Chlorogenic 18 2.3.2 Khảo sát điều kiện xử lý mẫu 18 2.3.3 Thẩm định quy trình 19 2.3.4 Ứng dụng quy trình xác định hàm lượng Acid Ferulic & Acid Chlorogenic tươi bột riềng ấm 21 2.4 Xử lý kết 22 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 23 iv 3.1 Hoàn thiện quy trình phân tích 23 3.1.1 Lựa chọn điều kiện sắc ký 23 3.1.2 Khảo sát cột sắc ký 29 3.2 Xây dựng quy trình xử lý mẫu 32 3.2.1 Khảo sát thời gian siêu âm 33 3.2.2 Khảo sát nhiệt độ siêu âm 34 3.2.3 Khảo sát số lần chiết 34 3.3.Kết luận 36 3.4 Thẩm định phương pháp 36 3.4.1 Độ ổn định hệ thống 36 3.4.2 Tính chọn lọc 38 3.4.3 Khảo sát khoảng tuyến tính lập đường chuẩn 40 3.4.4 Giới hạn phát giới hạn định lượng 42 3.4.5 Độ lặp lại, độ thu hồi phương pháp 44 3.5 Sử dụng quy trình phân tích xác định đánh giá hàm lượng acid Ferulic acid Chlorogenic 49 3.5.1 Nghiên cứu đặc tính kĩ thuật lựa chọn loại thích hợp 21 3.5.2 Ứng dụng kỹ thuật xây dựng để định lượng hoạt chất acid Ferulic acid Chlorogenic riềng ấm giai đoạn sinh trưởng (lá non, già, bánh tẻ) vào mùa Hè thu mùa đông xuân, 27 mẫu bột Riềng ấm 49 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 52 TÀI LIỆU THAM KHẢO 54 PHỤ LỤC 58 PHỤ LỤC 1: MỘT SỐ SẮC KÝ ĐỒ PHÂN TÍCH 33 MẪU THU THẬP 58 PHỤ LỤC 64 v DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT Ký hiệu AOAC ACN DK HPLC LOD LOQ MeOH MP PDA ppm Ppb RSD% SD Vial Placebo Tiếng Anh Association of Official Analytical communities Acetonitril 5,6 - Dehydrokawain High performance Liquidchromatography Limit of detection Limit of quatification Methanol Mobile Phase Photodiode array Parts per million Parts per billion Relative standard deviation Standard deviation Vial Placebo vi Tiếng Việt Hiệp hội nhà hóa phân tích thức Acetonitril 5,6 - Dehydrokawain Sắc ký lỏng hiệu cao Giới hạn phát Giới hạn định lượng Methanol Pha động Detecter PDA Một phần triệu Một phần tỷ Độ lệch chuẩn tương đối Độ lệch chuẩn Lọ đựng mẫu Mẫu giả dược DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ Hình 1.1: Hình ảnh Riềng ấm Hình 1.2: cấu trúc hóa học Acid Ferulic Hình 1.3: cấu trúc hóa học Acid Chlorogenic Hình 3.1: khảo sát hệ pha động Acid Ferulic 25 Hình 3.2: khảo sát hệ pha động Acid Ferulic 25 Hình 3.3: Khảo sát hệ pha động Acid Ferulic 25 Hình 3.4: Khảo sát hệ pha động Acid Chlorogenic 27 Hình 3.5: Khảo sát hệ pha động Acid Chlorogenic 27 Hình 3.6: Khảo sát hệ pha động Acid Chlorogenic 28 Hình 3.7: Khảo sát hệ pha động Acid Chlorogenic 28 Hình 3.8: Phổ PDA Acid Ferulic 29 Hình 3.9: Phổ PDA Acid Chlorogenic 29 Hình 3.10:Sắc ký đồ chuẩn Acid Ferulic 4.8 ppm cột Agilent ZORBAX SBC18 30 Hình 3.11:Sắc ký đồ chuẩn Acid Ferulic 4.8 ppm cột Symmectry® C18 30 Hình 3.12:Sắc ký đồ chuẩn Acid Ferulic 4.8 ppm cột ODS-P Inertsill® 30 Hình 3.13: Sắc ký đồ chuẩn Acid Chlorogenic ppm cột Symmectry® C18 31 Hình 3.14: Sắc ký đồ chuẩn Acid Chlorogenic 20 ppm cột ODS-P Inertsill® 31 Hình 3.15: Sắc ký đồ chuẩn Acid Chlorogenic ppm cột C8 31 Hình 3.16: Sắc ký đồ chuẩn Acid Ferulic 48 ppm 38 Hình 3.17: Sắc ký đồ mẫu placebo Acid Ferulic 38 Hình 3.18: Sắc ký đồ mẫu placebo nạp chuẩn Acid Ferulic 39 Hình 3.19: Sắc ký đồ chuẩn Acid Acid Chlorogenic ppm 39 Hình 3.20: Sắc ký đồ mẫu placebo Acid Chlorogenic 39 Hình 3.21: Sắc ký đồ mẫu placebo nạp chuẩn Acid Chlorogenic 40 Hình 3.22: Giá trị S/N Acid Ferulic 43 Hình 3.23: Giá trị S/N Acid Chlorogenic 44 vii DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1: Thành phần hợp chất Shell Ginger Bảng 1.2: Hàm lượng polyphenol số cây, ngũ cốc, rau, củ, Bảng 1.3: Hàm lượng axit chlorogenic số cây, ngũ cốc, rau, củ, Bảng 1.4: Hàm lượng Ferulic axit số cây, ngũ cốc, rau, củ, Bảng 1.5: Một số phương pháp phân tích riềng ấm giới 12 Bảng 1.6: Một số phương pháp phân tích riềng ấm Việt Nam 13 Bảng 1.7: Tính chất số dung mơi 15 Bảng 2.1: Đặc tính kĩ thuật độ già khác 21 Bảng 3.1:Nồng độ Acid Ferulic tìm thấy với mức thời gian siêu âm khác 33 Bảng 3.2: Nồng độ Acid Ferulic tìm thấy với mức nhiệt độ siêu âm khác 34 Bảng 3.3: Nồng độ Acid Ferulic tìm thấy với số lần chiết khác 35 Bảng 3.4 Độ ổn định hệ thống Acid Ferulic 37 Bảng 3.5 Độ ổn định hệ thống Acid Chlorogenic 37 Bảng 3.6: Kết khảo sát khoảng tuyến tính Acid Ferulic 41 Bảng 3.7: Kết khảo sát khoảng tuyến tính Acid Chlorogenic 41 Bảng 3.8: Giá trị S/N peak nạp chuẩn Acid Ferulic kết LOQ, LOD 42 Bảng 3.9: Giá trị S/N peak nạp chuẩn Acid Chlorogenic kết LOQ, LOD 43 Bảng 3.10: Kết xác định độ lặp lại,độ thu hồi mức nạp chuẩn nồng độ thấp quy trình chiết acid ferulic 45 Bảng 3.11 Kết xác định độ lặp lại thu hồi mức nạp chuẩn nồng độ trung bình quy trình chiết acid ferulic 46 Bảng 3.12: Kết xác định độ lặp lại, thu hồi mức nạp chuẩn nồng độ cao quy trình chiết acid ferulic 46 Bảng 3.13: Kết xác định độ lặp lại, độ thu hồi mức nạp chuẩn nồng độ thấp với quy trình chiết acid chlorogenic 47 Bảng 3.14: Kết xác định độ thu hồi mức nạp chuẩn nồng độ trung bình với quy trình chiết acid chlorogenic 48 Bảng 3.15: Kết xác định độ thu hồi mức nạp chuẩn nồng độ cao với quy trình chiết acid chlorogenic 48 Bảng 3.16 :Kết phân tích hàm lượng acid ferrulic cây: 49 Bảng 3.17: Kết phân tích hàm lượng acid ferulic, acid chlorogenic 33 mẫu bột Riềng ấm 50 viii LUẬN VĂN THẠC SĨ HOÀNG TRUNG HIẾU LỜI MỞ ĐẦU Hiện nay, vấn đề bảo vệ sức khỏe ngày người quan tâm nhiều trước bệnh chuyến hóa, virus, kháng thuốc.Vì mà xu hướng nay, ngày hướng đến, ưa chuộng dòng thuốc thực phẩm chức có nguồn gốc từ thảo dược tự nhiên Thậm chí cịn ứng dụng biến tấu để thảo dược xuất bữa ăn ngày Trong khuôn khổ hợp tác Viện Dinh dưỡng, Viện Nghiên cứu Phát triển Vùng Công ty Makise, Nhật Bản từ năm 2016, riềng ấm từ Nhật Bản trồng nhân giống tỉnh Vĩnh Phúc Hiện Viện Dinh dưỡng nghiên cứu phát triển sản phẩm bột riềng ấm để cung cấp cho đối tác Nhật Bản phát triển sản phẩm bảo vệ sức khỏe Ngoài thành phần có hoạt tính sinh học mà PTN Viện nghiên cứu acid ferulic acid chlorogenic hoạt chất DK tỏ hứa hẹn hàm lượng cao riềng ấm trồng Việt Nam Để đảm bảo chất lượng nguyên liệu bột thành phẩm Shell Ginger cho sản xuất thực phẩm chức nước xuất khẩu, việc xây dựng phát triển kỹ thuật phân tích định lượng acid ferulic acid chlorogenic bột Viện dinh dưỡng cần thiết Với lý đó, chúng tơi tiến hành đề tài nghiên cứu “Nghiên cứu xây dựng phương pháp phân tính đánh giá hàm lượng hoạt chất acid Ferulic acid Chlorogenic bột riềng ấm (Alpinia Zerumbet) theo mùa giai đoạn sinh trưởng” nhằm xây dựng phương pháp kỹ thuật xác định hoạt chất acid ferulic acid Chlorogenic bột chế biến từ Shell Ginger, theo dõi giám sát việc trồng thu hái- chọn mẫu thời điểm để xác định nguồn nguyên liệu có hàm lượng hoạt chất cao nhất, xác định hoạt chất quy trình chế biến bột Shell Ginger với mục tiêu sau: - Xây dựng quy trình chiết tách phân tích phù hợp AOAC để định lượng hoạt chất acid Ferulic acid Chlorogenic kỹ thuật HPLC - Sử dụng quy trình phân tích xác định đánh giá hàm lượng acid Ferulic acid Chlorogenic tươi bột riềng ấm LUẬN VĂN THẠC SĨ HOÀNG TRUNG HIẾU - Kết phân tích hàm lượng acid ferulic, acid chlorogenic 33 mẫu bột Riềng ấm khảo sát theo quy trình sản xuất xuất sản phẩm bột sau : Bảng 3.17: Kết phân tích hàm lượng acid ferulic, acid chlorogenic 33 mẫu bột Riềng ấm Đơn vị Tên mẫu TT tính Phương pháp/ Kết Acid Acid Ferrulic Chlorogenic M1 Mẫu (25ml*10^6) mg/kg 11 3950.7 M2 Mẫu (10ml*10^6) mg/kg 15 4224.2 M3 Mẫu (50ml*10^6) mg/kg 6.2 4191.1 M4 Mẫu mg/kg 5.5 4496.8 M5 Mẫu (ngâm 20%) mg/kg 8.2 3455 M6 Mẫu (không ngâm) mg/kg 2.8 4187.9 M7 Mẫu (ngâm 10%) mg/kg 12.1 3653.9 M8 Mẫu (ngâm 30%) mg/kg 12.9 2795.8 M9 Mẫu (2 ngày) mg/kg 8.3 3588.1 10 M10 Mẫu 10 (5 ngày) mg/kg 8.8 3933.2 11 271001 Ngâm 8h mg/kg 8.1 3815.6 12 271002 Ngâm qua đêm mg/kg 6.2 3050.2 13 271003 Ngâm 8h lên men mg/kg 3.7 4919.7 14 271004 Ngâm 15h lên men mg/kg 2.6 4393.3 15 1-11 1-11 mg/kg 2.5 2801 16 2-11 2-11 mg/kg 3.8 2544 17 3-11 3-11 mg/kg 4.0 3111 18 4-11 4-11 mg/kg 4.6 2919 19 5-11 5-11 mg/kg 6.9 3232 20 6-11 6-11 mg/kg 23.1 3053 50 LUẬN VĂN THẠC SĨ HOÀNG TRUNG HIẾU 21 7-11 7-11 mg/kg 6.2 2681 22 6-1 6-1 mg/kg 2.4 2739 23 6-2 6-2 mg/kg 4.5 3060 24 15.1 15.1 mg/kg 14.5 2328 25 M1 Bột M1 mg/kg 4448.9 26 M2 Bột M2 mg/kg 4357.1 27 M3 Bột M3 mg/kg 3815.4 28 M4 Bột M4 mg/kg 4180.7 Nhận xét: kết phân tích bột sau sản xuất thử nghiệm có tiêu vi sinh đạt theo quy định hành an toàn vệ sinh thực phẩm theo yêu cầu Trung tâm y học Makise Clinic & Makise Lifeup Laboratary, Nhật Bản Các tiêu hàm lượng hoạt chất acid ferulic acid chlorogenic đảm bảo độ ổn định quy trình sản xuất nghiên cứu 51 LUẬN VĂN THẠC SĨ HOÀNG TRUNG HIẾU KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận Đã xây dựng phương pháp xác định hàm lượng acid ferulic acid chlorogenic - Xử lý mẫu: Mẫu chiết NaOH 0.2M thời gian 120 phút, trung hòa HCL đặc định mức ethanol với quy trình phân tích acid ferulic chiết MeOH thời gian 30 phút với quy trình phân tích acid chlorogenic cho hiệu xử lý mẫu tốt, tiết kiệm hóa chất thời gian - Phân tích HPLC- PDA: thơng số tối ưu : quy trình chiết, thời gian chiết mẫu, nhiệt độ siêu âm phù hợp với quy trình Đã xác nhận giá trị sử dụng phương pháp gồm: - Độ chọn lọc/độ đặc hiệu tốt - Khoảng tuyến tính: từ 2,4 đến 480 ppm quy trình chiết acid ferulic từ 0.5 đến 300ppm quy trình chiết acid chlorogenic - Giới hạn phát (LOD) tươi bột với quy trình chiết acid ferulic µg/g, µg/g acid chlorogenic 5µg/g, 10µg/g - Giới hạn định lượng (LOQ) tươi bột với quy trình chiết acid ferulic 12µg/g, 15µg/g acid chlorogenic 15µg/g, 30µg/g - Độ lặp lại phương pháp điểm nồng độ thấp, trung bình, cao µg/g