Phân lập microsom và đánh giá ảnh hưởng của dịch chiết một số dược liệu đến hoạt tính cyp2e1 in vitro

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI LÊ NGỌC HÀ PHÂN LẬP MICROSOM VÀ ĐÁNH GIÁ ẢNH HƯỞNG CỦA DỊCH CHIẾT MỘT SỐ DƯỢC LIỆU ĐẾN HOẠT TÍNH CYP2E1 IN VITRO LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC HÀ NỘI 2021 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI LÊ NGỌC HÀ PHÂN LẬP MICROSOM VÀ ĐÁNH GIÁ ẢNH HƯỞNG CỦA DỊCH CHIẾT MỘT SỐ DƯỢC LIỆU ĐẾN HOẠT TÍNH CYP2E1 IN VITRO LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC CHUYÊN NGÀNH HÓA SINH DƯỢC MÃ SỐ: 8720208 Người hướng dẫn khoa học: TS Nguyễn Xuân Bắc PGS.TS Nguyễn Thị Lập HÀ NỘI 2021 LỜI CẢM ƠN Với lịng kính trọng biết ơn sâu sắc, tơi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới PGS.TS Nguyễn Thị Lập, TS Nguyễn Xuân Bắc, PGS.TS Phạm Thị Nguyệt Hằng, PGS.TS Đỗ Thị Hà người thầy, người cô nhiệt tình giúp đỡ, hết lịng bảo trực tiếp hướng dẫn suốt thời gian thực đề tài Tôi xin chân thành cảm ơn thầy giáo mơn Hóa sinh Dược – trường Đại học Dược Hà Nội; anh chị nghiên cứu viên phịng Dược lý – Sinh hóa, Viện Dược liệu giúp đỡ tạo điều kiện để tơi hồn thành luận văn Tơi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến toàn thể thầy cô giáo cán trường Đại học Dược Hà Nội nhiệt tình giảng dạy, giúp đỡ mang lại cho kiến thức kinh nghiệm quý báu suốt thời gian học tập trường Tôi xin trân trọng cảm ơn Ban giám hiệu, phòng Sau đại học phòng ban khác trường Đại học Dược Hà Nội tạo điều kiện thuận lợi để tơi hồn thành chương trình đào tạo thạc sỹ thời hạn Hà Nội, ngày 08 tháng 06 năm 2021 Học viên cao học Lê Ngọc Hà MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH ĐẶT VẤN ĐỀ Chương TỔNG QUAN 1.1 Microsom 1.1.1 Đặc điểm microsom 1.1.2 Vai trò microsom nghiên cứu 1.1.3 Phương pháp phân lập microsom 1.2 Mơ hình đánh giá tương tác thuốc-dược liệu 1.2.1 Mơ hình in vitro nghiên cứu tác thuốc dược liệu 1.2.1.1 Mô hình microsom 1.2.1.2 CYP tái tổ hợp 1.2.1.3 Tế bào gan nuôi cấy 1.2.1.4 Các chất vận chuyển qua màng 1.2.2 Mơ hình silico 1.2.3 Mơ hình in vivo 1.3 Tổng quan CYP450 1.3.1 Đặc điểm danh pháp CYP450 1.3.2 Cơ chế xúc tác CYP450 10 1.4 Tổng quan CYP 2E1 10 1.4.1 Chuyển hóa thuốc CYP2E1 11 1.4.2 Biểu gen CYP2E1 loài khác 13 1.4.3 Nghiên cứu ảnh hưởng dược liệu đến hoạt tính CYP2E1 14 1.5 Tổng quan dược liệu sử dụng nghiên cứu 15 1.5.1 Diệp hạ châu 15 1.5.2 Đan sâm 16 1.5.3 Rau má 16 1.5.4 Đu đủ 17 Chương ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18 2.1 Đối tượng nghiên cứu 18 2.1.1 Nguyên vật liệu nghiên cứu 18 2.1.2 Thiết bị 19 2.2 Nội dung nghiên cứu 19 2.2.1 Ảnh hưởng số điều kiện đến hiệu suất phân lập microsom từ gan chuột cống 20 2.2.1.1 Phân lập đánh giá ảnh hưởng số điều kiện đến hiệu suất phân lập microsom từ gan chuột cống 20 2.2.1.2 Xác định hiệu suất phân lập microsom 22 2.2.1.3 Xác định hoạt tính CYP2E1 22 2.2.1.4 Xây dựng đường chuẩn 23 2.2.1.5 Xử lý kết 24 2.2.2 Đánh giá ảnh hưởng dịch chiết số dược liệu lên hoạt tính CYP2E1 24 2.2.2.1 Nguyên tắc 24 2.2.2.2 Các bước tiến hành 24 Chương KẾT QUẢ 26 3.1 Ảnh hưởng số điều kiện đến hiệu suất phân lập microsom lựa chọn điều kiện phân lập phù hợp 26 3.1.1 Phân lập đánh giá ảnh hưởng số điều kiện đến hiệu suất phân lập microsom 26 3.1.1.1 Ảnh hưởng lực thời gian ly tâm không dùng calci 26 3.1.1.2 Ảnh hưởng lực ly tâm, thời gian ly tâm nồng độ calci đến hiệu suất phân lập microsom 28 3.1.2 Phân lập microsom 33 3.2 Ảnh hưởng đến hoạt tính CYP2E1 dịch chiết số dược liệu 33 3.2.1 Ảnh hưởng DMSO đến hoạt tính CYP2E1 33 3.2.2 Ảnh hưởng số dịch chiết dược liệu lên hoạt tính enzym CYP2E1 34 CHƯƠNG BÀN LUẬN 36 4.1 Phân lập đánh giá ảnh hưởng số điều kiện ảnh hưởng đến hiệu suất phân lập microsom 36 4.1.1 Ảnh hưởng thời gian ly tâm 36 4.1.2 Ảnh hưởng lực ly tâm 37 4.1.3 Ảnh hưởng nồng độ calci 38 4.2 Ảnh hưởng dịch chiết dược liệu đến hoạt tính CYP2E1 41 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 45 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT Tên viết tắt NADPH Từ gốc tiếng Anh Tiếng Việt Nicotinamide adenine Nicotinamid adenin dinucleotide phosphate dinucleotid phosphat UGT Glucuronyltransferase Glucuronyltransferase NAPQI N-acetyl-p-benzoquinone imine N-acetyl-p-benzoquinone imin CYP450 Cytochrome P450 Cytochrome P450 CYP2E1 Cytochrome P450 2E1 Cytochrom P450 2E1 DMSO Dimethyl sulfoxide Dimethyl sulfoxid HML Human liver microsome Microsom gan người APAP Paracetamol Paracetamol SULTs Sulfotransferase Sulfotransferase IC50 Half maximal inhibitory concentration uridine diphosphate glucuronic acid Nồng độ ức chế 50% hoạt tính CYP Acid uridin diphosphat glucuronic p-amino phenol p-amino phenol UDPGA PA DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1 Hóa Chất…………………………………….….…….……… 18 Bảng 2.2 Thiết bị ……………….…………………….….…………… 20 Bảng 2.3.Thành phần hỗn hợp phản ứng xác định hoạt tính CYP2E1…………………………………………………………….…… 24 Bảng 2.4 Dãy chuẩn p-aminophenol (PA)…………………… … … 25 Bảng 2.5 Thành phần hỗn hợp phản ứng xác định ảnh hưởng DMSO dược liệu đến hoạt tính CYP2E1…………………… ……….…… … 26 Bảng 3.1 Ảnh hưởng thời gian ly tâm với lực ly tâm 15000 g đến hiệu suất phân lập microsom ……………………………………….…… … 28 Bảng 3.2 Ảnh hưởng thời gian ly tâm với lực ly tâm 25000 g đến hiệu suất phân lập microsom………………………………………… ……… 29 Bảng 3.3 Ảnh hưởng thời gian ly tâm với lực ly tâm 52000 g đến hiệu suất phân lập microsom …………………………………….….… ….… 29 Bảng 3.4 Ảnh hưởng lực ly tâm nồng độ calci đến hiệu suất phân lập microsom ly tâm 15 phút………………………………… ………… 30 Bảng 3.5 Ảnh hưởng lực ly tâm nồng độ calci đến hiệu suất phân lập microsom ly tâm 30 phút….………………………………… …… 31 Bảng 3.6 Ảnh hưởng lực ly tâm nồng độ calci đến hiệu suất phân lập microsom ly tâm 60 phút……………………………… … ….… 32 Bảng 3.7 Ảnh hưởng lực ly tâm nồng độ calci đến hiệu suất phân lập microsom ly tâm 120 phút… ………………………….… ……… 33 Bảng 3.8 Ảnh hưởng thời gian ly tâm đến hiệu suất phân lập microsom lực ly tâm 25000 g nồng độ 8mM Ca2+……………….…….………… 34 Bảng 3.9 Hiệu suất hoạt tính CYP2E1……………… ……………… 35 Bảng 3.10 Ảnh hưởng dịch chiết dược liệu nồng độ 1400 µg/ml đến hoạt tính CYP2E1…………………………………………………… 37 DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 Sơ đồ phân lập microsom từ gan……………………….….….… Hình 1.2 Chu trình xúc tác cytochrome P450 [32] ….…….……… 10 Hình 1.3 Chuyển hóa chất ngoại sinh CYP2E1 gan [41]….……… 11 Hình 1.4 Tỷ lệ protein hệ enzym CYP450 [41]……………….… … 12 Hình 1.5 Các đường chuyển hóa paracetamol qua CYP2E1 chế gây độc gan paracetamol gây ra………………………………… 12 Hình 1.6 Quá trình oxy hóa ethanol CYP 2E1…………………… … 13 Hình 2.1 Sơ đồ thiết kế nghiên cứu……………………… ………… … 20 Hình 2.2 Sơ đồ phân lập Microsom …………………………………… 23 Hình 3.1 Ảnh hưởng DMSO đến hoạt tính CYP2E1…….… … … 36 Hình 3.2 Ảnh hưởng dịch chiết Diệp hạ châu Đu đủ đến hoạt tính CYP2E1………………………………………………………… … …… 37 ĐẶT VẤN ĐỀ Hiện nay, dược liệu sử dụng nhiều hình thức khác nhau, từ dạng thuốc theo phương thức y học cổ truyền thuốc thang, chè thuốc, cao thuốc dạng bào chế đại dạng thực phẩm bổ sung Thêm vào đó, dược liệu nguồn nguyên liệu làm thuốc quan trọng phục vụ cho việc phòng điều trị bệnh cho người Việc sử dụng dược liệu đồng thời với thuốc tổng hợp hóa học phổ biến Đặc biệt điều trị bệnh mạn tính Điều tiềm ẩn nhiều nguy tương tác thuốc-dược liệu, làm tăng giảm tác dụng thuốc dùng Vì vậy, dự đốn tương tác thuốc–dược liệu góp phần làm tăng tính an tồn, hiệu sử dụng thuốc Các mơ hình in vitro, mơ hình sử dụng microsom có vai trị quan trọng nghiên cứu tương tác thuốc – dược liệu [30] Mơ hình sử dụng microsom sử dụng phổ biến nghiên cứu tương tác thuốc giai đoạn chuyển hóa pha I [28], [ 36], [ 41] Trong nghiên cứu, phân lập thành công microsom từ gan chuột cống tuần tuổi xác định hoạt độ riêng enzym CYP2E1 [3] Cho đến nay, chưa có nhiều nghiên cứu đánh giá ảnh hưởng dược liệu đến hoạt tính enzym Để phân lập microsom phục vụ cho nghiên cứu mình, chúng tơi tiến hành đánh giá yếu tố ảnh hưởng đến hiệu suất phân lập microsom lựa chọn điều kiện phân lập phù hợp Trong nghiên cứu khác, nhóm nghiên cứu thấy phân lập microsom từ gan chuột cống tuần tuổi cho hiệu suất cao [2] Do đó, tiến hành đề tài “Phân lập microsom đánh giá ảnh hưởng dịch chiết số dược liệu đến hoạt tính CYP2E1 in vitro” nhằm mục đích phân lập microsom từ gan chuột cống tuần tuổi nghiên cứu ảnh hưởng dịch chiết dược liệu đến hoạt tính CYP2E1 với hai mục tiêu sau: Phân lập đánh giá ảnh hưởng số điều kiện đến hiệu suất phân lập microsom từ gan chuột cống Đánh giá ảnh hưởng dịch chiết số dược liệu đến hoạt tính CYP2E1 có microsom phân lập từ gan chuột cống 27 Kamath S A and E Rubin (1972), "Interaction of calcium with microsomes: a modified method for the rapid isolation of rat liver microsomes", Biochem Biophys Res Commun 49(1), pp 52-9 28 Knights K M et al (2016), "In Vitro Drug Metabolism Using Liver Microsomes", Curr Protoc Pharmacol 74, pp 7.8.1-7.8.24 29 Kobayashi Kaoru et al (2003), "Selectivities of human cytochrome P450 inhibitors toward rat P450 isoforms: study with cDNA-expressed systems of the rat" 31(7), pp 833-836 30 Lee S Y et al (2013), "In vitro and in vivo assessment of cytochrome P450-mediated herb-drug interaction of Ssang-hwa-tang", Food Chem 136(2), pp 450-7 31 Mahli A., W Erwin Thasler and C Hellerbrand (2019), "Establishment of a p-nitrophenol oxidation-based assay for the analysis of CYP2E1 activity in intact hepatocytes in vitro", Toxicol Mech Methods 29(3), pp 219-223 32 Manikandan P and S Nagini (2018), "Cytochrome P450 Structure, Function and Clinical Significance: A Review", Curr Drug Targets 19(1), pp 38-54 33 McGill Mitchell R and Hartmut %J Pharmaceutical research Jaeschke (2013), "Metabolism and disposition of acetaminophen: recent advances in relation to hepatotoxicity and diagnosis" 30(9), pp 2174-2187 34 Meunier V et al (2000), "Expression and induction of CYP1A1/1A2, CYP2A6 and CYP3A4 in primary cultures of human hepatocytes: a 10year follow-up", Xenobiotica 30(6), pp 589-607 35 Otsuki N et al (2010), "Aqueous extract of Carica papaya leaves exhibits anti-tumor activity and immunomodulatory effects", J Ethnopharmacol 127(3), pp 760-7 36 Perryman A L et al (2016), "Predicting Mouse Liver Microsomal Stability with "Pruned" Machine Learning Models and Public Data", Pharm Res 33(2), pp 433-49 37 Porubsky P R., K M Meneely and E E Scott (2008), "Structures of human cytochrome P-450 2E1 Insights into the binding of inhibitors and both small molecular weight and fatty acid substrates", J Biol Chem 283(48), pp 33698-707 38 Porubsky P R., K P Battaile and E E Scott (2010), "Human cytochrome P450 2E1 structures with fatty acid analogs reveal a previously unobserved binding mode", J Biol Chem 285(29), pp 22282-90 39 Puviani A C et al (1998), "An update on high-yield hepatocyte isolation methods and on the potential clinical use of isolated liver cells", Comp Biochem Physiol A Mol Integr Physiol 121(2), pp 99-109 40 Quintieri L et al (2008), "In vitro hepatic conversion of the anticancer agent nemorubicin to its active metabolite PNU-159682 in mice, rats and dogs: a comparison with human liver microsomes", Biochem Pharmacol 76(6), pp 784-95 41 Ravindran Selvan et al (2018), "In Vitro Biotransformation in Drug Discovery", Drug Discovery - Concepts to Market 42 Razali N N M., C T Ng and L Y Fong (2019), "Cardiovascular Protective Effects of Centella asiatica and Its Triterpenes: A Review", Planta Med 85(16), pp 1203-1215 43 Sabatini D D (2014), "Preparation of rough microsomes from rat liver", Cold Spring Harb Protoc 2014(8), pp 845-51 44 Santana L F et al (2019), "Nutraceutical Potential of Carica papaya in Metabolic Syndrome", Nutrients 11(7) 45 Schenkman J B and D L Cinti (1978), "Preparation of microsomes with calcium", Methods Enzymol 52, pp 83-9 46 Sidelmann Ulla G et al (1996), "750 MHz HPLC−NMR Spectroscopic Studies on the Separation and Characterization of the Positional Isomers of the Glucuronides of 6,11-Dihydro-11- oxodibenz[b,e]oxepin-2-acetic Acid", Analytical Chemistry 68(1), pp 106-110 47 Smith D A et al (1998), "Human cytochrome P450s: selectivity and measurement in vivo", Xenobiotica 28(12), pp 1095-128 48 Su C Y et al (2015), "Salvia miltiorrhiza: Traditional medicinal uses, chemistry, and pharmacology", Chin J Nat Med 13(3), pp 163-82 49 Taesotikul T et al (2011), "Inhibitory effects of Phyllanthus amarus and its major lignans on human microsomal cytochrome P450 activities: evidence for CYP3A4 mechanism-based inhibition", Drug Metab Pharmacokinet 26(2), pp 154-61 50 Taesotikul T et al (2012), "Effects of Phyllanthus amarus on the pharmacokinetics of midazolam and cytochrome P450 activities in rats", Xenobiotica 42(7), pp 641-8 51 Venkatakrishnan K et al (2003), "Drug metabolism and drug interactions: application and clinical value of in vitro models", Curr Drug Metab 4(5), pp 423-59 52 Waterschoot R A and A H Schinkel (2011), "A critical analysis of the interplay between cytochrome P450 3A and P-glycoprotein: recent insights from knockout and transgenic mice", Pharmacol Rev 63(2), pp 390-410 53 Wright K M et al (2020), "Centella asiatica Water Extract Shows Low Potential for Cytochrome P450-Mediated Drug Interactions", Drug Metab Dispos 48(10), pp 1053-1063 54 Yu L X et al (1996), "Transport approaches to the biopharmaceutical design of oral drug delivery systems: prediction of intestinal absorption", Adv Drug Deliv Rev 19(3), pp 359-76 55 Zhou S et al (2003), "Interactions of herbs with cytochrome P450", Drug Metab Rev 35(1), pp 35-98 56 Zhou X et al (2015), "Danshen (Salvia miltiorrhiza) water extract inhibits paracetamol-induced toxicity in primary rat hepatocytes via reducing CYP2E1 activity and oxidative stress", J Pharm Pharmacol 67(7), pp 980-9 57 Yang Y et al (1993), "[The effects of salvia miltiorrhiza, polysaccharide sulphate, dextran 40 and mannitol on the viscoelasticity properties of red blood cell suspension]", Hua Xi Yi Ke Da Xue Xue Bao 24(2), pp 143-6 58 Aashish Pandit Tarun Sachdeva and Pallavi Bafna (2013), "Ameliorative Effect of Leaves of Carica papaya in Ethanol and Antitubercular Drug Induced Hepatotoxicity", British Journal of Pharmaceutical Research 3(4), pp 14 59 Chen Ang et al (2016), "Evaluation of the inhibition potential of plumbagin against cytochrome P450 using LC-MS/MS and cocktail approach", Scientific reports 6(1), pp 1-12 60 Choi Myung‑Joo et al (2016), "Protective effects of Centella asiatica leaf extract on dimethylnitrosamine‑induced liver injury in rats", Molecular medicine reports 14(5), pp 4521-4528 61 Gao Na, Dan Zou and Hai-Ling Qiao (2013), "Concentration-dependent inhibitory effect of baicalin on the plasma protein binding and metabolism of chlorzoxazone, a CYP2E1 probe substrate, in rats in vitro and in vivo", PLoS One 8(1) 62 Kahraman Cigdem, Zekiye Ceren Arituluk and Iffet Irem Tatli Cankaya (2020), "The Clinical Importance of Herb-Drug Interactions and Toxicological Risks of Plants and Herbal Products", Medical Toxicology, IntechOpen 63 Kamath SA., FA Kummerow and K Ananth Narayan (1971), "A simple procedure for the isolation of rat liver microsomes", Febs Letters 17(1), pp 90-92 64 Kamath SA and Emanuel Rubin (1972), "Interaction of calcium with microsomes: a modified method for the rapid isolation of rat liver microsomes", Biochemical and biophysical research communications 49(1), pp 52-59 65 Korobkova Ekaterina A (2015), "Effect of natural polyphenols on CYP metabolism: implications for diseases", Chemical research in toxicology 28(7), pp 1359-1390 66 Kulthong Kornphimol et al (2009), "Effects of the standard extract of Centella asiatica (ECa233) on rat hepatic cytochrome P450", Thai Journal of Pharmaceutical Sciences 33 67 Kumar Kuzhuvelil Bhaskarannair Hari and Ramadasan Kuttan (2006), "Inhibition of Drug Metabolizing Enzymes (Cytochrome P450) in Vitro as Well as in Vivo by Phyllanthus amarus S CHUM & T HONN", Biological and Pharmaceutical Bulletin 29(7), pp 1310-1313 68 Lee Sang Yoon et al (2013), "Cytochrome P450-mediated herb–drug interaction potential of Galgeun-tang", Food and chemical toxicology 51, pp 343-349 69 Lee Sang Yoon et al (2013), "In vitro and in vivo assessment of cytochrome P450-mediated herb–drug interaction of Ssang-hwa-tang", Food chemistry 136(2), pp 450-457 70 Obermeier MT, RE White and CS Yang (1995), "Effects of bioflavonoids on hepatic P450 activities", Xenobiotica 25(6), pp 575-584 71 Parmentier Y et al (2007), "In vitro studies of drug metabolism" 72 Pham Hang Thi Nguyet et al (2021), "Effect of Centella asiatica on cognitive deficits caused in trimethyltin-induced neurotoxicity model mice" 63(1), pp 59-63 73 Rodrigues A David and Shekman L Wong, J Advances in Pharmacology (1997), "Application of human liver microsomes in metabolism-based drug-drug interactions: in vitro-in vivo correlations and the Abbott Laboratories experience" 43, pp 65-101 74 Schenkman John B and Dominick L Cinti (1978), "Preparation of microsomes with calcium", Methods in enzymology, Elsevier, pp 83-89 75 Seeka Pichayapa et al (2012), "Effects of the standardized extract of Centella asiatica ECa233 on human cytochrome P450", Thai Journal of Pharmaceutical Sciences 36(1) 76 Subramanya Sandeep B et al (2018), "Therapeutic potential of plants and plant derived phytochemicals against acetaminophen-induced liver injury", International journal of molecular sciences 19(12), pp 3776 77 Sun Min et al (2014), "Inhibitory effects of celastrol on rat liver cytochrome P450 1A2, 2C11, 2D6, 2E1 and 3A2 activity", Fitoterapia 92, pp 1-8 78 Wang Baolian et al (2014), "Multifaceted interaction of the traditional Chinese medicinal herb Schisandra chinensis with cytochrome P450mediated drug metabolism in rats", Journal of ethnopharmacology 155(3), pp 1473-1482 79 Wang Xin et al (2010), "Major tanshinones of Danshen (Salvia miltiorrhiza) exhibit different modes of inhibition on human CYP1A2, CYP2C9, CYP2E1 and CYP3A4 activities in vitro", Phytomedicine 17(11), pp 868-875 80 Wang Ying et al (2014), "Inhibiton of cytochrome P450 isoenzymes and P-gp activity by multiple extracts of Huang-Lian-Jie-Du decoction", Journal of ethnopharmacology 156, pp 175-181 81 Wang Yinghao et al (2015), "Inhibitory effects of cytochrome P450 enzymes CYP1A2, CYP2A6, CYP2E1 and CYP3A4 by extracts and alkaloids of Gelsemium elegans roots", Journal of ethnopharmacology 166, pp 66-73 82 Wei Jinlan, Hongying Zhang and Qingling Zhao (2018), "In vitro inhibitory effects of Friedelin on human liver cytochrome P450 enzymes", Pharmaceutical biology 56(1), pp 363-367 83 Yao Hsien-Tsung et al (2011), "Suppressive effect of the ethanolic extract of adlay bran on cytochrome P-450 enzymes in rat liver and lungs", Journal of agricultural and food chemistry 59(8), pp 4306-4314 84 Yu Jin et al (2021), "Cytochrome P450 CYP2E1 suppression ameliorates cerebral ischemia reperfusion injury", Antioxidants 10(1), pp 52 85 Yuan Fang et al (2010), "Effects of matrine and oxymatrine on catalytic activity of cytochrome P450s in rats", Basic & clinical pharmacology & toxicology 107(5), pp 906-913 86 Zhou Xuelin et al (2015), "Danshen (Salvia miltiorrhiza) water extract inhibits paracetamol‐induced toxicity in primary rat hepatocytes via reducing CYP2E1 activity and oxidative stress", Journal of Pharmacy and Pharmacology 67(7), pp 980-989 Phụ lục Chuẩn bị dịch chiết dược liệu: Đan sâm, Diệp hạ châu, Đu đủ, Rau má đánh giá ảnh hưởng CYP2E1 Nguồn gốc dược liệu: + Đan sâm thu hái Mộc Châu, Sơn La + Diệp hạ châu thu hái Hà Nội + Lá Đu đủ thu hái Bắc Giang + Rau má thu hái Tỉnh Thanh Hóa Quy trình chiết cao dược liệu Cao chiết dược liệu thực Khoa Hóa Phân tích, Viện Dược liệu Quy trình chiết cao dược liệu Diệp hạ châu, Đan sâm, Đu đủ: Dược liệu sấy khô, xay thô, ngâm với ethanol 90%, nhiệt độ phòng lần, lần ngày Các dịch chiết gộp lại thu hồi dung môi áp suất giảm đến cắn Cao khô bảo quản 0°C đến sử dụng thí nghiệm Quy trình chiết Rau má: phận khơng cắt thành mảnh nhỏ sấy khô 550C Nguyên liệu thực vật (650 gam) chiết xuất cồn 80% (1: w/v) nhiệt độ phòng 24 giờ, lọc làm khô chân không 50 0C Phần lại ngâm H2O, sau lắc phân đoạn với n-butanol Nbutanol kết hợp dịch chiết cô đặc chân không 600C, thu 40 gam dịch chiết khơ Phân tích hoạt chất cao dược liệu Các hoạt chất cao dược liệu phân tích Khoa Hóa phân tích, Viện Dược liệu Hiệu suất hàm lượng cao chiết thu bảng sau: Bảng hiệu suất hàm ẩm cao dược liệu Loại cao Khối lượng (gam) Hiệu suất chiết (%) Hàm ẩm (%) Đan sâm 12,14 3,34 6,95 Diệp Hạ Châu 38,54 8,65 11,93 40 6,15 22,6 11,26 Rau má Đu đủ 14,89 VIỆN DƯỢC LIỆU Khoa Hóa Phân tích – Tiêu chuẩn BÁO CÁO KẾT QUẢ PHÂN TÍCH HĨA HỌC MỘT SỐ MẪU CAO CHIẾT Người gửi mẫu: Lê Ngọc Hà Đơn vị: Trường Cao đẳng Vĩnh Phúc I Phân tích cao Diệp hạ châu đắng theo chuyên luận Diệp hạ châu – Dược điển Việt Nam V 1.1.1 Định tính phương pháp sắc ký lớp mỏng (TLC) Áp dụng điều kiện phân tích TLC theo chuyên luận Diệp hạ châu đắng – DĐVN V Kết thu hình Hình SKĐ TLC định tính cao Diệp hạ châu Ghi chú: 1-chất đối chiếu phyllanthin; 2-mẫu cao Diệp hạ châu; A-Hình ảnh quan sát ánh sáng thường B-Hình ảnh quan sát UV 365 nm sau phun thuốc thử Nhận xét: SKĐ mẫu cao Diệp hạ châu có vết trùng Rf màu sắc với vết dung dịch đối chiếu phyllanthin, chứng tỏ mẫu cao Diệp hạ châu có thành phần phyllanthin 1.2 Định lượng phyllanthin hypophyllanthin phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao kết nối detector DAD Áp dụng điều kiện phân tích HPLC-DAD theo chuyên luận Diệp hạ châu đắng (DĐVN V) Bên cạnh phyllanthin, Diệp hạ châu đắng có thành phần hypophyllanthin thành phần chính, có cấu trúc hóa học độ phân cực giống với phyllanthin Do đó, q trình phân tích HPLC, tín hiệu pic phyllanthin hypophyllanthin dễ bị xen phủ Trong thí nghiệm này, sử dụng chất phân tích để khẳng định khả tách phyllanthin mẫu Diệp hạ châu đắng, đồng thời giúp đánh giá hàm lượng hypophyllanthin Kết thu hình bảng Mẫu cao Diệp hạ châu đắng Hỗn hợp chuẩn phyllanthin (1) hypophyllanthin (2) Hình SKĐ HPLC phân tích phyllanthin hypophyllanthin cao Diệp hạ châu đắng Bảng Kết định lượng phyllanthin hypophyllanthin cao Diệp hạ châu đắng Mẫu Độ ẩm (%) Hàm lượng (%) phyllanthin* Hàm lượng (%) hypophyllanthin* Cao Diệp hạ châu đắng 11,93 1,31 ± 0,03 0,45 ± 0,02 *Tính khối lượng khơ kiệt II Phân tích cao Đan sâm theo chuyên luận Đan sâm – Dược điển Việt Nam V 2.1 Định tính phương pháp sắc ký lớp mỏng • Định tính tanshinon IIA Áp dụng điều kiện phân tích TLC theo chuyên luận Đan sâm – DĐVN V Kết thu hình Hình SKĐ TLC định tính tanshinon IIA cao Đan sâm Ghi chú: 1-chất đối chiếu tanshinon IIA; 2-mẫu cao Đan sâm Nhận xét: SKĐ mẫu cao Đan sâm khơng có vết trùng Rf màu sắc với vết dung dịch đối chiếu tanshinon IIA, chứng tỏ mẫu cao Đan sâm (hoặc có ít) thành phần tanshinon IIA • Định tính acid salvianolic B Áp dụng điều kiện phân tích TLC theo chuyên luận Đan sâm – DĐVN V Kết thu hình Hình SKĐ TLC định tính acid salvianolic B cao Đan sâm Ghi chú: 1- Mẫu cao Đan sâm; 2-Chất đối chiếu acid salvianolic B A-SKĐ quan sát UV 254 nm B-SKĐ quan sát UV 366 nm Nhận xét: SKĐ mẫu cao Đan sâm có vết trùng Rf màu sắc với vết dung dịch đối chiếu acid salvianolic B, chứng tỏ mẫu cao Đan sâm có thành phần acid salvianolic B 2.2 Định lượng tanshinon IIA acid salvianolic B phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao kết nối detector DAD Áp dụng điều kiện phân tích HPLC-DAD theo chuyên luận Đan sâm (DĐVN V) Kết thu hình bảng Mẫu cao Đan sâm mAU 286nm,4nm (1.00) 325 300 275 250 225 200 175 150 125 100 75 50 25 -25 -50 -75 -100 0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 Acid salvianolic B Hình SKĐ HPLC phân tích acid salvianolic B cao Đan sâm Bảng Kết định lượng acid salvianolic B tanshinon IIA cao Đan sâm Mẫu Cao Đan sâm Độ ẩm (%) 6,95 *tính khối lượng khơ kiệt Hàm lượng (%) acid Hàm lượng (%) salvianolic B* tanshinon IIA* 6,96 ± 0,05 Khơng phát III Phân tích cao Đu đủ 3.1 Định tính phương pháp sắc ký lớp mỏng • Định tính carpain Tiến hành định tính carpain cao Đu đủ phương pháp TLC theo số điều kiện sau: Bản mỏng: Silica gel GF254 Hệ dung môi: cloroform: methanol: amoniac (12: 1: 0,1) Thuốc thử: dragendorff Mẫu thử: hịa methanol để có dung dịch thử nồng độ 50 mg cao/ml Mẫu đối chiếu: hòa methanol để có dung dịch đối chiếu nồng độ 50 mg/ml Hình SKĐ TLC định tính carpain cao Đu đủ Ghi chú: 1-Mẫu cao Đu đủ; 2- Chất đối chiếu carpain Nhận xét: SKĐ mẫu cao Đan sâm có vết trùng Rf màu sắc với vết dung dịch đối chiếu carpain, chứng tỏ mẫu cao Đu đủ có thành phần carpain • Định tính flavonoid Tiến hành định tính flavonoid cao Đu đủ phương pháp TLC theo số điều kiện sau: Bản mỏng: Silica gel GF254 Hệ dung môi: Ethyl acetat: methanol: nước: acid formic (10: 1: 1: 1) Thuốc thử: acid boric/ acid oxalic 10% (2:1) Hình ảnh quan sát UV 365 nm trước sau phun thuốc thử Hình SKĐ TLC định tính nhóm chất flavonoid cao Đu đủ Ghi chú: A-SKĐ quan sát UV 366 nm trước phun thuốc thử B- SKĐ quan sát UV 366 nm sau phun thuốc thử Nhận xét: SKĐ xuất vết phát quang sau phun thuốc thử, chứng tỏ mẫu cao Đu đủ có thành phần flavononoid 3.2 Định lượng carpain cao Đu đủ phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao kết nối detector DAD [1] Tiến hành định tính carpain cao Đu đủ phương pháp HPLC-DAD theo số điều kiện sau: Mẫu thử: cân xác khoảng 0,5 gam cao, thêm xác 10 ml methanol 80%, siêu âm 30 phút, lọc vào bình định mức 10 ml, bổ sung đến vạch mức methanol 80%, thu dung dịch mẫu thử Mẫu chuẩn carpain: hòa tan chất chuẩn carpain methanol 80% để thu dung dịch chuẩn có nồng độ xác khoảng 50 µg/ml Cột: C18 (250 x 4,6 mm; µm) Pha động: Acetonitril/amoniacetat 0,05M (25/75, v/v) Detector: UV 254 nm Tốc độ dịng: 0,8 ml/phút Thể tích tiêm mẫu: 10 µl Kết phân tích thu hình bảng Mẫu cao Đu đủ Carpain Hình SKĐ HPLC phân tích carpain cao Đu đủ Bảng Kết định lượng carpain cao Đu đủ Mẫu Độ ẩm (%) Hàm lượng (%) carpain* Cao Đu đủ 14,89 0,12 ± 0,01 *tính khối lượng khô kiệt 3.3 Định lượng flavonoid tổng số tính theo quercetin phương pháp quang phổ hấp thụ phân tử (UV-VIS) [3] Tiến hành định tính flavonoid tổng số cao Đu đủ phương pháp UV-VIS, tính theo chuẩn quercetin Kết thu trình bày Bảng Bảng Kết định lượng flavonoid tổng số cao Đu đủ Mẫu Hàm lượng (%) flavonoid tổng số* (tính theo quercetin) Cao Đu đủ 7,65 ± 0,06 *Tính khối lượng khơ kiệt Tài liệu tham khảo [1] Dược điển Việt Nam V (2017), chuyên luận Diệp hạ châu đắng, trang 1143-1144; chuyên luận Đan sâm, trang 1152-1153 [2] Xiuyi Wang (2015), Isolation and Identification Carpaine in Carica papaya L Leaf by HPLC-UV Method, International Journal of Food Properties, Volume 18, 2015 - Issue [3] Nguyễn Thanh Nhật Phương (2017), Khảo sát hàm lượng flavonoid, alkaloid khả kháng khuẩn cao chiết cỏ Mần trầu (Eleusine indica), Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ, Tập 53, Phần B (2017): 54-60 Cán thực Khoa Hóa Phân tích – Tiêu chuẩn Trưởng khoa TS Nguyễn Thị Hà Ly PGS TS Đỗ Thị Hà ... 2.1: Phân lập microsom đánh giá ảnh hưởng dịch chiết số dược liệu đến hoạt tính CYP2E1 in_ vitro Phân lập đánh giá ảnh hưởng số điều kiện đến hiệu suất phân lập microsom từ gan chuột cống Đánh giá. .. liệu đến hoạt tính CYP2E1 với hai mục tiêu sau: Phân lập đánh giá ảnh hưởng số điều kiện đến hiệu suất phân lập microsom từ gan chuột cống Đánh giá ảnh hưởng dịch chiết số dược liệu đến hoạt tính. .. ? ?Phân lập microsom đánh giá ảnh hưởng dịch chiết số dược liệu đến hoạt tính CYP2E1 in vitro? ?? nhằm mục đích phân lập microsom từ gan chuột cống tuần tuổi nghiên cứu ảnh hưởng dịch chiết dược liệu