ĐÀO THỊ LƯƠNG ĐÁNH GIÁ tác DỤNG CHỐNG VIÊM GIẢM ĐAU của CHẾ PHẨM ME06 TRÊN THỰC NGHIỆM KHÓA LUẬN tốt NGHIỆP dược sĩ

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI ĐÀO THỊ LƯƠNG Mã sinh viên: 1601484 ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG CHỐNG VIÊM GIẢM ĐAU CỦA CHẾ PHẨM ME06 TRÊN THỰC NGHIỆM KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Nơi thực hiện: Bộ môn Dược lực Người hướng dẫn: TS Đỗ Thị Nguyệt Quế HÀ NỘI- 2021 LỜI CẢM ƠN Lời nói đầu cho em gửi lịng biết ơn vơ sâu sắc đến TS Đỗ Thị Quyệt Quế -bộ môn Dược lực, người em vơ kính trọng ngưỡng mộ tận tình giúp đỡ, hết lịng bảo em từ ngày đầu chập chững tham gia nghiên cứu khoa học suốt trình nghiên cứu, thực đề tài Cảm ơn cô cho em học tập nhiều điều bổ ích sống đường hành nghề sau Em xin chân thành cảm ơn đến PGS TS Đào Thị Vui-Trưởng mơn Dược Lực, TS Nguyễn Thùy Dương-Phó trưởng môn Dược lực thầy cô môn Dược lực tạo điều kiện cho em học tập nghiên cứu trình thực đề tài Em xin cảm ơn chị Nguyễn Thị Thủy, chị Đinh Thị Kiều Giang anh Đinh Đại Độ - anh chị kỹ thuật viên môn Dược lực bên cạnh hướng dẫn em trình thực đề tài Em xin cảm ơn chị, bạn em học tập nghiên cứu môn giúp đỡ em nhiều trình thực đề tài Em xin trân trọng cảm ơn Ban giám hiệu, Phịng Đào Tạo tồn thể thầy cô trường Đại học Dược Hà Nội tạo điều kiện thuận lợi, giúp đỡ em trình học tập, nghiên cứu Em xin cảm ơn gia đình, người anh em đồng đội bên cạnh động viên, chia sẻ, giúp đỡ nhiều năm học tập nghiên cứu trường Dược thân yêu Hà Nội, ngày 11 tháng 06 năm 2021 Học viên Đào Thị Lương MỤC LỤC DANH MỤC VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Vài nét viêm đau 1.1.1 Vài nét viêm 1.1.2 Vài nét đau 1.2 Các nhóm thuốc giảm đau, chống viêm 1.3 Một số mơ hình giảm đau, chống viêm 1.4 Tổng quan chế phẩm nghiên cứu 14 CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19 2.1 Đối tượng nghiên cứu 19 2.1.1 Nguyên liệu nghiên cứu 19 2.1.2 Động vật tế bào thí nghiệm 20 2.1.3 Hóa chất thuốc thử 21 2.1.4 Thiết bị dụng cụ nghiên cứu 21 2.2 Nội dung nghiên cứu 22 2.3 Phương pháp nghiên cứu 23 2.3.1 Phương pháp đánh giá tác dụng chống viêm, giảm đau in vivo 23 2.3.2 Phương pháp đánh giá tác dụng ức chế COX-2 tế bào RAW 264.7 27 2.4 Phương pháp xử lý số liệu 30 CHƯƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 31 3.1 Kết đánh giá tác dụng chống viêm, giảm đau chế phẩm ME06 in vivo 31 3.2 Kết đánh giá tác dụng ức chế COX-2 tế bào RAW in vitro 35 CHƯƠNG BÀN LUẬN 36 4.1 Về tác dụng chống viêm, giảm đau chế phẩm ME06 in vivo 36 4.2 Về tác dụng ức chế COX-2 tế bào RAW 264.7 chế phẩm ME06 41 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC VIẾT TẮT TÊN ĐẦY ĐỦ VIẾT TẮT APS Ammonium persulphate solution COX Enzym cyclooxygenase DMEM Dulbecco's modified eagle medium DMSO Dimethyl sulfoxide ELISA Enzyme-liked immunosorbent assay IASP International Association for the Study of Pain FBS Huyết bào thai bò IL Interleukin LOX Enzym Lypooxygenase LPS Lipopolysaccharide LTA Acid lipoteichoic MAPKs Mitogen-activated protein kinase MPO Myeloperoxidase NF-κB Nuclear factor-kappa B NSAIDs Thuốc chống viêm không steroid PG Prostaglandin SDS Sodium dodecyl sulphate TNF Tumor necrosis factor-alpha TXA2 Thromboxan A2 DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1 Thành phần viên nang cứng ME06 19 Bảng 2.2 Thành phần stacking gel resolving gel 28 Bảng 3.1 Ảnh hưởng ME06 lên mức độ phù bàn chân chuột 31 Bảng 3.2 Ảnh hưởng ME06 lên khối lượng u hạt chuột cống trắng .32 Bảng 3.3 Ảnh hưởng chế phẩm ME06 lên số đau quặn 34 Bảng 3.4 Mức độ biểu COX-2 so với β-actin 35 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ Hình 2.1 Nội dung tiến hành nghiên cứu 22 Hình 2.2 Nghiên cứu tác dụng chống viêm cấp mơ hình gây phù bàn chân chuột .24 Hình 2.3 Nghiên cứu tác dụng chống viêm mạn mơ hình gây u hạt .25 Hình 2.4 Nghiên cứu tác dụng giảm đau quặn acid acetic 26 Hình 3.1 Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng ME06 đến mức độ phù bàn chân chuột thời điểm giờ, giờ, 32 Hình 3.2 Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng ME06 lên số đau quặn xuất 34 Hình 3.3 Hình ảnh băng protein sau rửa film X-quang 35 ĐẶT VẤN ĐỀ Viêm phản ứng bảo vệ thể trước tác nhân lạ, trình viêm phức tạp với tham gia nhiều tế bào thể chủ yếu đại thực bào bạch cầu đa nhân trung tính Viêm xuất nhiều bệnh lý gout, viêm khớp dạng thấp, viêm xương khớp Trong nhiều tình huống, viêm cấp gây nguy hiểm cho người bệnh viêm mạn tính (viêm âm ỉ, kéo dài) ngồi việc gây tổn thương mơ tiến triển chúng cịn gây cảm giác đau đớn, khó chịu cho người bệnh làm giảm chất lượng sống Hiện nay, hai nhóm thuốc điều trị viêm NSAIDs glucocorticoid (GC) Không thể phủ nhận tầm quan trọng nhóm thuốc điều trị triệu chứng viêm, đau chúng gây nhiều tác dụng không mong muốn NSAIDs làm tăng nguy viêm loét dày tá tràng, biến cố tim mạch…, việc sử dụng glucocorticoid dễ dẫn đến viêm dày, tăng huyết áp, hội chứng cushing, tăng nhãn áp… Chính vậy, việc nghiên cứu phát triển thuốc có nguồn gốc dược liệu để điều trị viêm, đau với tác dụng không mong muốn xu hướng giới Theo thống kê tạp chí “International Journal of Evirommental Research and Public Healthy” đăng tải vào tháng năm 2020, giai đoạn 1960-2001 có khoảng 1.300 nghiên cứu thuốc có nguồn gốc dược liệu công bố năm, đến giai đoạn 2001-2011 số lượng nghiên cứu tăng nhanh đỉnh điểm lên đến 6.200 nghiên cứu năm, sau mức tăng trưởng ổn định 5.000 báo công bố năm [46] Người bệnh cộng đồng chuyển hướng sang tin dùng thuốc, sản phẩm bảo vệ sức khỏe có nguồn gốc dược liệu Theo thống kê Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) cho biết doanh thu toàn cầu thuốc sản phẩm bảo vệ sức khỏe có nguồn gốc thiên nhiên từ năm 2001 17 tỷ đô la Mỹ đến năm 2012 lên đến 83 tỷ đô la Mỹ Chế phẩm nằm đề tài nghiên cứu thuốc chống viêm, giảm đau công ty cổ phần dược phẩm Medzavy, chế phẩm đời nhằm giúp người bệnh mong muốn tìm sản phẩm có nguồn gốc từ thảo dược tác dụng khơng mong muốn để điều trị viêm đau Thành phần chế phẩm phối hợp nhiều dược liệu Việt Nam toàn giới dùng điều trị tình trạng xuyên khung, độc hoạt, đỗ trọng, phòng phong, đương quy đặc biệt liễu trắng Để đánh giá tác dụng chế phẩm cung cấp tài liệu thử tiền lâm sàng hồ sơ đăng ký thuốc, tiến hành đề tài “Đánh giá tác dụng chống viêm giảm đau chế phẩm ME06 thực nghiệm” Đề tài tiến hành với hai mục tiêu chính: Đánh giá tác dụng chống viêm, giảm đau chế phẩm ME06 in vivo Đánh giá tác dụng ức chế COX-2 tế bào RAW 264.7 chế phẩm ME06 kỹ thuật Western blot CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Vài nét viêm đau 1.1.1 Vài nét viêm 1.1.1.1 Định nghĩa viêm Viêm phản ứng chỗ thể mô bị kích thích tổn thương Đó phản ứng phức tạp mơ liên kết tuần hồn mao mạch nơi bị tác động, biểu triệu chứng sưng, nóng, đỏ, đau rối loạn chức [9] 1.1.1.2 Phân loại viêm  Phân loại theo thời gian diễn biến viêm: Viêm cấp tính: Viêm cấp khởi phát đột ngột, diễn biến nhanh từ vài đến vài ngày [8] (kéo dài tuần [29]), vùng mơ bị tổn thương (cịn gọi ổ viêm cấp tính) có dấu hiệu sưng, nóng, đỏ, đau Trường hợp viêm nặng có thêm tình trạng chức riêng biệt mô quan tương ứng [17] Viêm mạn tính phản ứng viêm diễn thời gian dài (hàng tuần, hàng tháng, hàng năm) Viêm mạn phát triển tiếp sau viêm cấp, mà tác nhân gây tổn thương tồn chưa bị tiêu diệt Viêm mạn xuất từ đầu, trường hợp thường có khởi đầu ngấm ngầm, âm ỉ, khơng có triệu chứng lâm sàng rõ rệt [17] Viêm hạt dạng đặc biệt viêm mạn tính, xảy tác nhân gây viêm thuộc loại khó tiêu hủy Các tác nhân vi khuẩn, ký sinh trùng, nấm, chất hóa học chưa rõ tác nhân gây tổn thương Đặc điểm mô học viêm hạt có hình thành u hạt có đường kính nhỏ mm [17] 1.1.1.3 Cơ chế bệnh sinh viêm  Quá trình viêm cấp tính Q trình thường chia làm ba giai đoạn chính: Giai đoạn rối loạn tuần hồn ổ viêm, giai đoạn rối loạn chuyển hóa (glucid, protid, lipid) tổn thương tổ chức, giai đoạn tăng sinh tế bào để hàn gắn sửa chữa tổ chức viêm [7]  Rối loạn tuần hoàn ổ viêm: Sau thực xong đề tài, có số kiến nghị sau: - Tiếp tục đánh giá tác dụng chống viêm cấp mô hình gây viêm cấp khác - Đánh giá độc tính chế phẩm ME06 thực nghiệm - Đánh giá tác dụng ức chế COX-2 mẫu thử nồng độ khác 100 µg/ml 44 TÀI LIỆU THAM KHẢO I TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT 10 11 12 13 14 15 16 17 Nguyễn Thị Ngọc Anh (2019), "Đánh giá tác dụng giảm đau, chống viêm độc tính bán trường diễn cao chiết Ethanol Bọ Mẫy (Clerodendrum Cyrtophyllum Turcz., Verbenaceae)" Trịnh Xuân Anh (2020), "Nghiên cứu độc tính cấp tác dụng chống viêm, chống dị ứng viêm hỗ trợ điều trị ECZEMA", pp 10 Đỗ Huy Bích, Đặng Quang Chung, Bùi Xuân Chương, Nguyễn Thượng Dong, Đỗ Trung Đàm, Vũ Ngọc Lộ,Phạm Duy Mai, Phạm Kim Mãn, Đoàn Thị Nhu, Nguyễn Tập, Trần Toàn, (2006), "Cây thuốc động vật làm thuốc Việt Nam", (NXB khoa học kỹ thuật), tr 150-152 Bộ môn Dược Cổ truyền – Trường Đại học Dược Hà Nội (2005), "Dược học cổ truyền", NXB Y học, pp Bộ môn Dược Lực – Trường Đại học Dược Hà Nội (2018), "Thực tập dược lý", Trường đại học Dược Hà Nội, tr Bộ môn Dược lý-Đại học Y Hà Nội (2017), "Báo cáo tác dụng dược lý Thống phong hoàn bà Giằng", Đại học Y Hà Nội Bộ môn miễn dịch-sinh lý (2012), "Sinh lý Bệnh học", NXB Y học, pp 209-229 Bộ Y tế (2007), Dược lý học tập Nguyễn Duy Cương, Nguyễn Hữu Quỳnh (1999), "Từ điển bách khoa dược học", NXB từ điển Bách khoa, tr 630-632 Nguyễn Văn Dũng, Lò Thị Mai Thu, Nguyễn Thị Phương, Nguyễn Thùy Dương, (2020), "Nghiên cứu tác dụng chống viêm giảm đau thực nghiệm keo lơng chim", Tạp chí Dược liệu, 22, tr 56-60 Đậu Thị Giang (2016), "Nghiên cứu tác dụng giảm đau, chống viêm gối hạc (Leea rubra blume họ gối hạc Leeaceae) thực nghiệm", Trường đại học Dược Hà Nội Nguyễn Thị Kim Huế (2019), "Nghiên cứu tác dụng giảm đau, chống viêm, độc tính chế phẩm naphtoquinon từ củ Sâm đại hành (Eleutherine bulbosa (Mill.), URB.) thực nghiệm" Đỗ Thị Thùy Nhân, Lê Thị Lan Phương, Nguyễn Thị Sơn, (2018), "Đánh giá tác dụng kháng viêm viên nang Độc Hoạt Ký Sinh thang LĐ chuột nhắt trắng", Tạp chí Y học -TP Hồ Chí Minh, 22(5), tr 10-15 Lê Hồng Oanh (2020), Nghiên cứu tác dụng chống viêm thực nghiệm cao chiết từ vỏ thân núc nác (Oroxylum indicum(L.) Vent) Đào Văn Phan (2012), "Các thuốc giảm đau - chống viêm", NXB Y học, tr 45-47 Nguyễn Thị Phương Quỳnh Vũ Thị Ngọc Thanh, Nguyễn Thị Tân, (2016), "Nghiên cứu tác dụng chống viêm điều trị phì đại lành tính tuyến tiền liệt cốm tan Tiền liệt Thanh Giải thực nghiệm", Tạp chí Y Dược học-Trường Đại học Y Dược Huế, 31, tr 81-87 Nguyễn Sào Trung, Âu Nguyệt Diệu, Bùi Thị Hồng Khang, Huỳnh Ngọc Linh, Nguyễn Đình Tuấn, Lê Thị Thanh Huyền, Triệu Thị Xuân Thu, (2010), "Bài giảng lý thuyết giải phẫu bệnh", tr 29-50 II TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG ANH 18 H Wang, R Chen, H Xu, (1998), "Chemical constituents of radix angelicae sinensis", Zhongguo Zhong Yao Za Zhi, 23(3), pp 167-8, inside backcover 19 Bhargavi NL Vajja, Suresh Juluri, Manju Kumari, Labonyamoy Kole, Ranjan Chakrabarti, Vishwas D Joshi, (2004), "Lipopolysaccharide-induced paw edema model for detection of cytokine modulating anti-inflammatory agents", Int Immunopharmacol, 4(7), pp 901-9 20 Charles A Winter, Edwin A Risley, George W Nuss, (1962), "Carrageenininduced edema in hind paw of the rat as an assay for antiiflammatory drugs", Proc Soc Exp Biol Med, 111, pp 544-7 21 D O Gonỗalves, IBF Calou, RP Siqueira, AA Lopes, LKA Leal, GAC Brito, ARTomé, GSB Viana, (2011), "In vivo and in vitro anti-inflammatory and antinociceptive activities of lovastatin in rodents", Braz J Med Biol Res, 44(2), pp 17381 22 E Okuyama, T Hasegawa, T Matsushita, H Fujimoto, M Ishibashi, M Yamazaki, (2001), "Analgesic components of saposhnikovia root (Saposhnikovia divaricata)", Chem Pharm Bull (Tokyo), 49(2), pp 154-60 23 Earnest Oghenesuvwe Erhirhie, Chika Ndubuisi Emeghebo, Emmanuel Emeka Ilodigwe, Daniel Lotanna Ajaghaku, Blessing Ogechukwu Umeokoli, Peter Maduabuchi Eze, Kenneth Gerald Ngwoke, Festus Basden Gerald Chiedu Okoye, (2019), "Dryopteris filix-mas (L.) Schott ethanolic leaf extract and fractions exhibited profound anti-inflammatory activity", Avicenna J Phytomed, 9(4), pp 396-409 24 G Jin, J Li, H Piao, (1992), "Chemical constituents of Ledebouriella seseloides Wolff", Zhongguo Zhong Yao Za Zhi, 17(1), pp 38-40, 64 25 Guiming Liu, Jing Xie, Yurui Shi, Rongda Chen, Li Li, Mengxue Wang, Meizhu Zheng, Jiaming Xu, (2020), "Sec-O-glucosylhamaudol suppressed inflammatory reaction induced by LPS in RAW264.7 cells through inhibition of NF-κB and MAPKs signaling", Biosci Rep, 40(2), pp 26 H Süleyman, M E Büyükokuroğlu (2001), "The effects of newly synthesized pyrazole derivatives on formaldehyde-, carrageenan-, and dextran-induced acute paw edema in rats", Biol Pharm Bull, 24(10), pp 1133-6 27 J Liu (1995), "Pharmacology of oleanolic acid and ursolic acid", J Ethnopharmacol, 49(2), pp 57-68 28 J Necas, L Bartosikova (2013), "Carrageenan: a review", Veterinarni Medicina, 58(4), pp 187–205 29 Jacquelyn Banasik, Lee-Ellen Copstead (2012), "Pathophysiology", ELSEVIER Saunders, 5, pp 172-177 30 Ji Won Chung, Ran Joo Choi, Eun-Kyoung Seo , Joo-Won Nam, Mi-Sook Dong, Eun Myoung Shin, Lian Yu Guo, Yeong Shik Kim, (2012), "Anti-inflammatory effects of (Z)-ligustilide through suppression of mitogen-activated protein kinases and nuclear factor-κB activation pathways", Arch Pharm Res, 35(4), pp 723-32 31 Jian-Ying Wang, Xiao-Jun Chen, Lei Zhang, Ying-Yi Pan, Zu-Xi Gu, Shi-Min He, Zhe-Ping Song, Ying Yuan, (2018), "Comparative Studies of Different Extracts 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 from Eucommia ulmoides Oliv against Rheumatoid Arthritis in CIA Rats", Evid Based Complement Alternat Med, 2018, pp 7379893 Jin Mi Chun, Hyo Seon Kim, A Yeong Lee, Seung-Hyung Kim, Ho Kyoung Kim, (2016), "Anti-Inflammatory and Antiosteoarthritis Effects of Saposhnikovia divaricata ethanol Extract: In Vitro and In Vivo Studies", Evid Based Complement Alternat Med, 2016, pp 1984238 Josep T DiPiro, Robert L Talbert, Gary C.Yee, Gary R Malzke, Barbara G Wells, L Michael Posey, (2017), Pharmacotheraphy: A Pathophysiologic Approach 10th, pp 2687-2725 Joseph Schwager, Lidia Gagno, Nathalie Richard, Werner Simon, Peter Weber, Igor Bendik, (2018), "Z-ligustilide and anti-inflammatory prostaglandins have common biological properties in macrophages and leukocytes", Nutr Metab (Lond), 15, pp Jun Zhao, Tao Liu, Fang Xu, Shuping You, Fang Xu, Chenyang Li, Zhengyi Gu, (2016), "Anti-arthritic Effects of Total Flavonoids from Juniperus sabina on Complete Freund's Adjuvant Induced Arthritis in Rats", Pharmacogn Mag, 12(47), pp 178-83 Junichi Nagata, Hiroyuki Yokodera, Goki Maeda, (2019), "In Vitro and in Vivo Studies on Anti-Inflammatory Effects of Traditional Okinawan Vegetable Methanol Extracts", ACS Omega, 4(13) Kamel M, Kamel Amany M Gad, Suzan M Mansour, Marwa M Safar, Hala M Fawzy, (2019), "Venlafaxine alleviates complete Freund's adjuvant-induced arthritis in rats: Modulation of STAT-3/IL-17/RANKL axis", Life Sci, 226, pp 6876 Karen Whalen, Richard Finkel, Thomas A Panavelil, (2016), "Lippincott IIIustrated", Wolters Kluwer Health, 6, pp 447-469 KF Swingle, FE Shideman (1972), "Phases of the inflammatory response to subcutaneous implantation of a cotton pellet and their modification by certain antiinflammatory agents", J Pharmacol Exp Ther, 183(1), pp 226-34 Li Li, Huawu Zeng, Lei Shan, Xin Yuan, Yushan Li, Runhui Liu, Weidong Zhang, (2012), "The different inhibitory effects of Huang-Lian-Jie-Du-Tang on cyclooxygenase and 5-lipoxygenase", J Ethnopharmacol, 143(2), pp 732-9 Mohd Shara Sidney J Stohs (2015), "Efficacy and Safety of White Willow Bark (Salix alba) Extracts", Phytother Res, 29(8), pp 1112-6 Omayma A Eldahshan, Mohamed M Abdel-Daim (2015), "Phytochemical study, cytotoxic, analgesic, antipyretic and anti-inflammatory activities of Strychnos nuxvomica", Cytotechnology, 67(5), pp 831-44 IASP International Association for the Study of pain (2019), "IASP's Proposed New Definition of Pain Released for Comment on august 7, 2019", IASP-Pain, pp Rajendra Gyawali, Prapanna Bhattarai, Subodh Dhakal, Brajesh Jha, Sanjeev Sharma Kattel, Prashamsa Koirala, Ashana Regmi, Sri Krishna Joshi, Tirthamaiya Shrestha, Prem Narayan, Poud (2013), "Analgesic and Anti-inflammatory Properties of Salix alba Linn and Calotropis procera (Aiton) Dryand", International Journal of Pharmaceutical & Biological Archive, 4(4), pp 873 - 877 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 Rajendra Kumar, Sarvesh Singh, Anil Kumar Saksena, Rishi Pal, Riddhi Jaiswal, Rahul Kumar (2019), "Effect of Boswellia Serrata Extract on Acute Inflammatory Parameters and Tumor Necrosis Factor-α in Complete Freund's Adjuvant-Induced Animal Model of Rheumatoid Arthritis", Int J Appl Basic Med Res, 9(2), pp 100106 Salmerón-Manzano Esther, Garrido-Cárdenas José, et al (2020), "Worldwide Research Trends on Medicinal Plants", International Journal of Environmental Research and Public Health, 17, pp 3376 Samanta Daliana Golin Pacheco, Alexia Thamara Gasparin, Carlos Henrique Alves Jesus, Bruna Bittencourt Sotomaior, Ana Clara Sans Salomão Brunow Ventura, Daiany Darlly Belo Redivo, Daniela de Almeida Cabrini, Josiane de Fátima Gaspari Dias, Marilis Dallarmi Miguel, Obdulio Gomes Miguel, Joice Maria da Cunha (2019), "Antinociceptive and Anti-Inflammatory Effects of Bixin, a Carotenoid Extracted from the Seeds of Bixa orellana", Planta Med, 85(16), pp 1216-1224 Shelar PA, Mishra A (2020), "Animal models of inflammation for assessment of anti-inflammatory drugs", SGVU Journal Of Pharmaceutical Research & Education, 5(2) Shruti Srivastava P Singh, KK Jha, Garima Mishra, S Srivastava, RL Khosa, (2013), "Antiinflammatory, Analgesic and Antipyretic Activities of Aerial Parts of Costus speciosus Koen", Indian J Pharm Sci, 75(1), pp 83-8 U Snekhalatha, M Anburajan, B Venkatraman, M Menaka, (2013), "Evaluation of complete Freund's adjuvant-induced arthritis in a Wistar rat model Comparison of thermography and histopathology", Z Rheumatol, 72(4), pp 375-82 Vipul D Prajapati, Pankaj M Maheriya, Girish K Jani, Himanshu K Solanki, (2014), "Carrageenan: a natural seaweed polysaccharide and its applications", Carbohydr Polym, 105, pp 97-112 Wen-Wan Chao, Bi-Fong Lin (2011), "Bioactivities of major constituents isolated from Angelica sinensis (Danggui)", Chin Med, 6, pp 29 Wenchang Sun, Long He Yang, Yan Qiu, Jie Ren ,Rui Huang , Jin Fu (2011), "Identify nature N-acylethanolamide-hydrolyzing acid amide (NAAA) inhibitor: effect of angelicae pubescentis radix on anti-inflammation", Zhongguo Zhong Yao Za Zhi, 36(22), pp 3161-6 WHO (2009), "Monographs on selected medicinal plants", 4, pp 244-249 Winter C A, Risley E A, et al, (1962), "Carrageenin-induced edema in hind paw of the rat as an assay for antiiflammatory drugs", Proc Soc Exp Biol Med, 111, pp 544-7 Wu Yin, Tian-Shan Wang, Fang-Zhou Yin, Bao-Chang Cai (2003), "Analgesic and anti-inflammatory properties of brucine and brucine N-oxide extracted from seeds of Strychnos nux-vomica", J Ethnopharmacol, 88(2-3), pp 205-14 Xiang Yuan, Bin Han, Zi-Ming Feng, Jian-Shuang Jiang, Ya-Nan Yang, Pei-Cheng Zhang (2020), "Three new compounds from the rhizome of Ligusticum chuanxiong and their anti-inflammation activities", J Asian Nat Prod Res, 22(10), pp 920-926 Xiaorong Li, Jiangning Wang, Lei Gao, (2013), "Anti-inflammatory and analgesic activity of R.A.P (Radix Angelicae Pubescentis) ethanol extracts", African journal of traditional, complementary, and alternative medicines, 10(3), pp 422-426 59 60 61 Y Arakawa, O Wada (1984), "Inhibition of carrageenan edema formation by organotin compounds", Biochem Biophys Res Commun, 125(1), pp 59-63 Y Ozaki (1992), "Antiinflammatory effect of tetramethylpyrazine and ferulic acid", Chem Pharm Bull (Tokyo), 40(4), pp 954-6 Yun-Yun Xing, Jian-Ying Wang, Kai Wang, Yan Zhang, Kun Liu, Xiao-Yun Chen, Ying Yuan, (2020), "Inhibition of Rheumatoid Arthritis Using Bark, Leaf, and Male Flower Extracts of Eucommia ulmoides", Evid Based Complement Alternat Med PHỤ LỤC TIÊU CHUẨN CƠ SỞ CÔNG TY CỔ VIÊN NANG CỨNG PHẦN DƯỢC ME06 PHẨM MEDZAVY Số tiêu chuẩn: MDZ.01.TCCS-SP Có hiệu lực kể từ ngày ký I YÊU CẦU KỸ THUẬT 1.1 Công thức điều chế cho viên nang Cao khô Đương quy Mười hai miligam 12 mg Cao khô Độc hoạt Mười hai miligam 12 mg Cao khô Đỗ trọng Mười hai miligam 12 mg Cao khô Xuyên khung Mười hai miligam 12 mg Cao khơ Phịng phong Sáu mươi miligam 60 mg Cao khô Liễu trắng Hai trăm miligam 200 mg PVP K30 Năm miligam mg Magnesium stearate Mười miligam 10 mg Lactose monohydrate Một trăm bảy mươi bảy miligam Vỏ nang 177 mg nang 1.2 Nguyên liệu, phụ liệu Nguyên phụ liệu Tên khoa học Tiêu chuẩn (*) Cao khô Đương quy Radix Angelicae sinensis Extract TC NSX Cao khô Độc hoạt Radix Angelicae pubescentis Extract TC NSX Cao khô Đỗ trọng Cortex Eucommiae Extract TC NSX Cao khô Xuyên khung Rhizoma Ligustici wallichii Extract TC NSX Cao khơ Phịng phong Radix Saposhnikoviae divaricatae Extract TC NSX Cao khô Liễu trắng Salicis corticis Extract PVP K30 Povidonum USP Magnesium stearate Magnessii stearas USP Lactose monohydrate Lactosum USP Ethanol 96 % (**) Ethanolum DĐVN Vỏ nang (*) Dược điển phiên hành TC NSX TC NSX (**) Tá dược bay trình sản xuất 1.3 Yêu cầu chất lượng 1.3.1 Tính chất: Viên nang cứng số 0, gồm hai nửa hình trụ lồng khít vào nhau, bên chứa cốm màu nâu, mùi thơm đặc trưng dược liệu 1.3.2 Định tính: Chế phẩm thể phép thử Liễu trắng 1.3.3 Đồng khối lượng: Khối lượng trung bình viên ± 7,5 % 1.3.4 Độ rã: Không 30 phút 1.3.5 Giới hạn nhiễm khuẩn: Đạt yêu cầu theo phụ lục 13.6, Dược điển Việt NamV + Tổng số vi sinh vật hiếu khí ≤104 CFU/g; + Tổng số nấm ≤102 CFU/g; + Tổng số vi khuẩn Gram âm dung nạp mật ≤102 CFU/g; + Khơng có Salmonella 10g; + Khơng có Escherichia coli, Staphylococus aureus 1g 1.3.6 Định lượng: Hàm lượng tổng dẫn chất salicylic tính theo salicin khơng thấp 10 mg/viên tính theo khối lượng trung bình viên II PHƯƠNG PHÁP THỬ 2.1 Tính chất: Bằng cảm quản, chế phẩm phải đạt yêu cầu nêu 2.2 Định tính: Thử theo Dược điển Việt Nam V, phụ lục 5.4, Phương pháp sắc ký lớp mỏng Xử lý mẫu thử: Lấy 20 viên nang, tháo vỏ nang lấy phần bột bên trong, trộn thu mẫu thử 2.2.1 Định tính Liễu trắng − Bản mỏng: Silica gel G hoạt hóa 100°C − Dung môi khai triển: nước-methanol-ethyl acetat (8:15:77) − Dung dịch thử A: Lấy 0,5 g mẫu thử, hòa ml methanol, đem siêu âm phút, lọc pha loãng thành 10 ml methanol, thu dung dịch thử A − Dung dịch thử B: Lấy ml dung dịch thử A thêm ml dung dịch chuẩn natri carbonat khan 0,5 M, đun cách thủy 60°C, làm lạnh thu dung dịch thử B − Dung dịch đối chiếu: Hòa tan 2mg chất chuẩn salicin 2mg acid clorogenic ml methanol − Cách tiến hành: chấm riêng biệt lên bảng mỏng 10µl dung dịch đối chiếu dung dịch thử Sau triển khai sắc ký, mỏng để khơ ngồi khơng khí hay sấy nhẹ cho bay hết dung mơi Phun thuốc thử lên mỏng (thuốc thử gồm acid sulfuric methanol tỷ lệ 1:19), đem sấy nhiệt độ 100-105°C phút, đem mỏng quan sát ánh sáng thường − Kết quả: Trên sắc ký đồ dung dịch thử phải có vết màu sắc giá trị Rf với vết sắc ký đồ dung dịch đối chiếu, dung dịch salicin đối chiếu 2.3 Đồng khối lượng: Thử theo Dược Điển Việt Nam V - Phụ lục 11.3, phép thử độ đồng khối lượng 2.4 Độ rã: Thử theo Dược Điển Việt Nam V - Phụ lục 11.6, phép thử độ rã viên nén viên nang 2.5 Giới hạn nhiễm khuẩn: Thử theo Dược điển Việt Nam V - Phụ lục 13.6 Thử giới hạn nhiễm khuẩn – Phương pháp đĩa thạch (sử dụng phương pháp cấy trộn) - Chuẩn bị mẫu thử nghiệm: Lấy 10 g mẫu thử hòa 100 ml dung dịch đệm phosphat pH 7,2 nồng độ 10-1 Pha loãng thành nồng độ nhỏ dung dịch đệm phosphat pH 7,2 (Hút 5ml dung dịch cần pha thêm 45ml dung dịch đệm phosphat pH 7,2 thu dung dịch nồng độ nhỏ 10 lần) - Thử nghiệm Tổng số vi sinh vật hiếu khí: Lấy dung dịch thử có độ pha lỗng 10-3, 10-4, 10-5 cho vào hộp Petri, hộp 1ml Thêm vào hộp 15 ml đến 20 ml môi trường thạch casein đậu tương môi trường thạch thường đun chảy để nguội đến 45°C Đậy hộp, trộn cách xoay qua, xoay lại Sau để yên cho thạch đơng cứng nhiệt độ phịng Lật ngược hộp, mang ủ 30 - 35 °C từ đến ngày Sau thời gian ủ, kiểm tra vi khuẩn mọc đĩa, đếm số lượng khuẩn lạc - Thử nghiệm Tổng số nấm: Lấy dung dịch có độ pha loãng 10-1, 10-2, 10-3 cho vào hộp Petri, hộp 1ml Thêm vào hộp 15 ml đến 20 ml mơi trường thạch Sabouraud-dextrose (có cho thêm 50 mg cloramphenicol vào L môi trường trước hấp tiệt khuẩn) đun chảy để nguội đến 45°C Đậy hộp, trộn cách xoay qua, xoay lại Sau để n cho thạch đơng cứng nhiệt độ phòng Lật ngược hộp, mang ủ 20 - 25 °C từ đến ngày Sau thời gian ủ, kiểm tra, đếm số lượng khuẩn lạc - Thử nghiệm Tổng số vi khuẩn Gram âm dung nạp mật: Lấy 10ml dung dịch có độ pha lỗng 10-1, thêm vào 100 ml môi trường lỏng tăng sinh Enterobacteria-Mossel Ủ 30 °C đến 35 °C 24 h đến 48 h Cấy chuyển lên môi trường thạch muối mật tím đỏ Ủ 30 °C đến 35 °C 18 h đến 24 h Mẫu thử khơng có Enterobacteria không thấy khuẩn lạc mọc môi trường Đánh giá số lượng: Phân lập cấy chuyển: Cấy lượng mẫu thử chuẩn bị theo phần Chuẩn bị mẫu thử tiền ủ tương ứng chứa 0,1 g; 0,01 g 0,001 g 0,1 ml; 0,01 ml 0,001 ml vào thể tích thích hợp mơi trường lỏng tăng sinh Enterobacteria-Mossel Ủ 30 °C đến 35 °C 24 h đến 48 h Cấy chuyển từ ống môi trường sang môi trường thạch muối mật tím đỏ Ủ 30 °C đến 35 °C 18 h đến 24 h Đánh giá kết quả: Khuẩn lạc mọc môi trường chứng tỏ kết dương tính Ghi lượng nhỏ chế phẩm mà cho kết dương tính lượng lớn chế phẩm mà cho kết âm tính Xác định số lượng vi khuẩn theo Bảng 13.6.5 - Thử nghiệm phát Salmonella: Lấy 100ml dung dịch có độ pha lỗng 10-1 vào thể tích phù hợp môi trường lỏng casein đậu tương, trộn ủ 30 °C đến 35 °C 18 h đến 24 h Phân lập cấy chuyển: Cấy chuyển 0,1 ml môi trường lỏng casein đậu tương sang 10 ml môi trường tăng sinh Salmonella Rappaport Vassiliadis ủ 30 °C đến 35 °C 18 h đến 24 h Tiếp tục cấy chuyển sang đĩa môi trường thạch xylose, lysin, deoxycholat ủ 30 °C đến 35 °C 18 h đến 48 h Đánh giá kết quả: Khuẩn lạc màu đỏ, có khơng có trung tâm màu đen mọc mơi trường cho thấy mẫu thử có Salmonella Tiếp tục xác định nhiều phản ứng sinh hóa khác Mẫu thử khơng có Salmonella khơng có khuẩn lạc có đặc điểm mô tả mọc môi trường phản ứng sinh hóa để xác định Salmonella có kết âm tính - Thử nghiệm phát Escherichia coli: Lấy 10ml dung dịch có độ pha lỗng 10vào thể tích phù hợp mơi trường lỏng casein đậu tương, trộn ủ 30 °C đến 35 °C 18 h đến 24 h Phân lập cấy chuyển: Lắc bình mơi trường lỏng casein đậu tương, cấy chuyển ml môi trường lỏng casein đậu tương sang 100 ml môi trường lỏng MacConkey ủ 42 °C đến 44 °C 24 h đến 48 h Tiếp tục cấy chuyển sang đĩa môi trường thạch MacConkey ủ 30 °C đến 35 °C 18 h đến 72 h Đánh giá kết quả: Khuẩn lạc mọc môi trường cho thấy mẫu thử có E coli Tiếp tục xác định nhiều phản ứng sinh hóa khác Mẫu thử khơng có E coli khơng có khuẩn lạc mọc mơi trường phản ứng sinh hóa để xác định E Coli có kết âm tính - Thử nghiệm phát Staphylococus aureus: Lấy 10ml dung dịch có độ pha lỗng 10-1 vào thể tích phù hợp môi trường lỏng casein đậu tương, trộn ủ 30 °C đến 35 °C 18 h đến 24 h Phân lập cấy chuyển: Cấy chuyển sang đĩa môi trường thạch muối manitol ủ 30 °C đến 35 °C 18 h đến 72 h Đánh giá kết quả: Khuẩn lạc màu vàng trắng có vịng màu vàng bao quanh mọc mơi trường cho thấy mẫu thử có S aureus Tiếp tục xác định nhiều phản ứng sinh hóa khác Mẫu thử khơng có S aureus khơng có khuẩn lạc có đặc điểm mơ tả mọc mơi trường phản ứng sinh hóa để xác định S aureus có kết âm tính 2.7 Định lượng: Thử theo Dược điển Việt Nam V, phụ lục 5.3, Phương pháp sắc ký lỏng - Dung dịch thử: cân xác 0,75 g (m1) mẫu thử, thêm 20ml methanol 20 ml NaOH 0,1M Đun hồi lưu bể cách thuỷ khoảng 60°C, lắc liên tục Làm lạnh, thêm 2,0 ml HCl 1M, lọc hỗn dịch cho vào bình định mức 50,0 ml, rửa lại lần dung môi A1 (dung môi A1 gồm nước methanol tỷ lệ 1:1) định mức vừa đủ đến 50,0 ml dung môi A1 Lọc qua màng lọc có (kích thước lỗ lọc 0,45μm) thu dung dịch thử - Dung dịch chuẩn: Hoàn tan chất chuẩn picein vào 25,0 ml hỗn hợp dung môi nước methanol với tỷ lệ 1:4 thu dung dịch C Hòa tan 15,0 mg salicin chuẩn vảo 25 ml hỗn hợp dung môi nước methanol (1:4), thu dung dịch D Thêm 5,0 ml dung dịch D vào dung dịch C thêm nước vừa đủ 50,0 ml - Cột chạy sắc ký: Kích thước cột: l= 0,10 m Ø=4,6 mm Pha tĩnh: silica gel R-18 (3μm) Pha động: Pha động A: tetrahydrofuran, acid phosphoric 0,5% (v/v) tỷ lệ 1,8:98,2 Pha động B: tetrahydrofuran Chương trình chạy: Thời gian chạy (phút) Pha động A Pha động B (phần trăm v/v) (phần trăm v/v) 0-15 100 15-17 100→90 0→10 17-23 90 10 23-25 90→100 10→0 25-40 100 Tốc độ dòng: 1,0 ml/phút Bước sóng phát 270 nm Thể tích tiêm mẫu: 10μl Thời gian lưu: salicin 6,4 phút picein 7,7 phút Tính thích hợp hệ thống: Yêu cầu: Rs ≥ 1,5 pic salicin picein Tính tốn nồng độ tổng dẫn chất salicylic, biểu thức sau: S1: Diện tích pic salicin mẫu thử S2: Diện tích pic salicin mẫu chuẩn m1: Khối lượng mẫu thử m2: Khối lượng salicin sử dụng làm mẫu chuẩn p: Độ tinh khiết chất chuẩn BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI ĐÀO THỊ LƯƠNG ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG CHỐNG VIÊM GIẢM ĐAU CỦA CHẾ PHẨM ME06 TRÊN THỰC NGHIỆM KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI - 2021 ... cứu Đánh giá tác dụng chống viêm, giảm đau chế phẩm ME06 in vivo  Đánh giá tác dụng chống viêm cấp cuả chế phẩm ME06 mơ hình gây phù chân chuột  Đánh giá tác dụng chống viêm mạn chế phẩm ME06. .. viêm, giảm đau chế phẩm ME06 in vivo 3.1.1 Kết đánh giá tác dụng chống viêm cấp chế phẩm ME06 Sử dụng mơ hình gây phù bàn chân chuột carrageenan để đánh giá tác dụng chống viêm cấp chế phẩm ME06. .. nghiên cứu 2.3.1 Phương pháp đánh giá tác dụng chống viêm, giảm đau in vivo 2.3.1.1 Phương pháp đánh giá tác dụng chống viêm cấp chế phẩm ME06 Tác dụng chống viêm cấp ME06 tiến hành theo phương