siRNA VÀ ỨNG DỤNG TRONG ĐIỀU TRỊ UNG THƯ Giới thiệu - RNA phân tử polymer có nhiều vai trị sinh học mã hóa, dịch - mã, điều hòa, biểu gene RNA có có loại sau: mRNA, tRNA, rRNA, siRNA, miRNA, tmRNA Trong đó, siRNA loại mà tìm hiểu Vậy siRNA gì? Khái niệm - siRNA gọi RNA can thiệp hay RNA im lặng gồm khoảng 25 - - ribônuclêôtit, thường sinh tác động virus Chúng có chức tương tự miRNA điều chỉnh hoạt động mARN tương thích hoạt động phạm vi can thiệp RNA Can thiệp RNA (RNAi)là chế ức chế biểu gen giai đoạn dịch mã cách cản trở trình phiên mã gen cụ thể.Một hệ thống bên tế bào sống tham gia vào việc kiểm soát hoạt động gen Mỗi sợi siRNA có: • 5’-phosphate termini • 3’-hydroxyl termini • 2/3-nucleotide ’nhơ Lịch sử - Mello Fire Năm 1998, nhà nghiên cứu Craig C Mello Trường Y Đại - - • • • học Massachusetts Andrew Z Fire Đại học Stanford cơng bố cơng trình đột phá RNAi Trong đó, họ sử dụng đoạn RNA sợi kép (dsRNA) để ức chế ngăn chặn biểu gen giun tròn giun tròn (C elegans) Cơ chế ức chế biểu gen xảy tự nhiên RNAi Giải Nobel 2006 Năm 2006, Mello Fire trao giải Nobel cho việc khám phá gen tắt Chức RNAi có nhiều chức quan trọng tế bào: Chúng bảo vệ tế bào chống lại gene ký sinh trùng, virut yếu tố di truyền vận động Điều hoà biểu gene Điều khiển phát triển tổ chức Giữ gìn NST tăng cường phiên mã Các chức RNAi gồm: Ức chế dịch mã đơn vị mRNA Ức chế phiên mã gene nhân Phân giải mRNA đích • Ức chế q trình xâm nhiễm vi khuẩn, nấm, virus Chống chịu với tác nhân độc hại môi trường: tia UV, mặn, khô hạn, ngập,thiếu dinh dưỡng, kim loại nặng, Con đường hình thành siRNA & chế làm tắt gene - Quá trình hình thành siRNA diễn tế bào chất (cytoplasma) Trong tế bào, biểu cảm ứng RNA mạch kép dài kết bắt cặp mạch mang mã mạch đối mã RNAi kích hoạt dsRNA (double strand RNA) - đoạn RNA dài mạch kép mang trình tự bắt cặp bổ sung với gene mục tiêu, có đầy đủ cặp bazơ có 21 -23 cặp bazơ Còn phân tử dsRNA dài cắt thành mảnh có độ dài khoảng 21-23 bp enzyme tế bào chất gọi "Dicer" Khi dsRNA vào tế bào, bị Dicer (một loại enzyme cắt RNA mạch kép) cắt thành đọan ngắn gọi siRNA (khoảng 21-28 nucleotide) Những mảnh siRNA liên kết protein RNA- phức hệ gây nên im lặng (RISC) Những phức hệ RISC nhận làm suy biến RNA sợi đơn tương ứng trình tự siRNA Sau siRNA tháo xoắn tác dụng enzyme helicase mạch nạp vào phức hợp protein cách chọn lọc gọi phức hợp cảm ứng bất hoạt RISC Trong mạch đơn này, mạch có đầu 5’ có hoạt lực với Agronauttrong phức hệ RISC gắn với phức hệ RISC => tạo phức hợp siRNA-RISC Mạch cịn lại đầu 5’ khơng có hoạt lực với Agronauttrong => không liên kết với RISC Sự xuất mạch đơn siRNA hoạt hoá RISC thành trạng thái hoạt động (RISC*) Cuối phức hợp siRNA-RISC* tìm kiếm transcriptome (sản phẩm trình phiên mã) cách đặc hiệu RNA mục tiêu tiềm Sợi đơn siRNA sau nạp vào RISC gọi mạch hướng dẫn, đóng vai trò đạo việc đưa phức hợp siRNA-RISC* đến phân tử mRNA có trình tự bổ sung với • • • • Việc đạo siRNA thơng qua endonuclease có RISC Agronaute protein • • • • - RISC* xâm nhập vào nhân tế bào kết cặp với trình tự tương đồng phân tử DNA hệ gene.Lúc RISC* huy động số protein làm cải biến chất nhiễm sắc quanh vị trí promoter gene => kìm hãm phiên mã Cơ chế tắt gen lúc phụ thuộc vào mức độ tương đồng siRNA mRNA đích Nếu tương đồng siRNA mRNA đích hồn tồn phân tử mRNA có xu hướng bị cắt phân giải (do hoạt tính nuclease RISC) => khơng có mRNA mã hố cho protein Nếu tương đồng siRNA mRNA phần xu hướng xảy ức chế dịch mã chung bám mRNA => ngăn cản dịch chuyển Ribosome trình dịch mã => trình dịch mã bi ngưng lại => không tạo protein Ung thư Tế bào ung thư hình thành sau rối loạn thể dẫn tới biến đổi cấu trúc tế bào Những tế bào không chết theo quy luật Apoptossis mà công tế bào bình thường khác Cơ thể người cấu tạo từ nhiều loại tế bào Trong điều kiện bình thường, tế bào lớn lên, phân chia tạo tế bào khác thể cần đến chúng Quá trình giúp cho thể khoẻ mạnh Tuy nhiên, đơi q trình có trật tự bị trục trặc Vật liệu di truyền (DNA) tế bào bị hư hỏng thay đổi, gây đột biến có ảnh hưởng đến tăng trưởng phân chia tế bào bình thường Khi điều xảy ra, tế bào không chết chúng cần tế bào hình thành thể khơng cần đến chúng; tạo thành khối tổ chức mà người ta gọi tăng sinh khối u Khối u lành tính ác tính - • Sự khám phá chế can thiệp RNAi cơng cụ cần thiết để dị tìm chế phân tử bị thay đổi tế bào ung thư Do tính đặc hiệu q trình can thiệp RNA kết hợp với tính dễ dàng nhân rộng tiến trình thực nghiệm từ hàng ngàn gene lên tới tồn genome thí nghiệm, hệ thống "điểm yếu" ung thư giải mã hàng loạt thuốc đặc hiệu ung thư điều chế Các nhà nghiên cứu dùng nhiều phương pháp để đưa RNA can thiệp vào tế bào mục đích khám phá đường tín hiệu sinh tồn có tế bào ung thư Cơ chế tắt gene siRNA có hiệu cao, cần lượng nhỏ siRNA đưa vào tế bào cố thể đủ để làm tắt hoàn toàn biểu gene (vốn có nhiều thể đa bào).=> ứng dụng điều trị ung thư Ứng dụng điều trị ung thư siRNA thăm dò với tư cách cơng cụ điều hịa xuống sản phẩm nhiễm sắc thể Philadelphia Willda cộng sử dụng dòng TB người bị bệnh bạch cầu dòng tủy mạn tính biểu M -BCR/ABL mRNA để test khả siRNA tổng hợp việc điều hòa xuống đặc hiệu tương ứng với tín hiệu protein, làm tăng nhạy cảm TB apoptosis Khi thâm chuyển tức thời siRNA nhắm vào việc kháng lại vùng cầu nối chung M -BCR/ABL làm giảm xuống đặc hiệu mức p210 không ảnh hưởng tới protein ABL vimentin nội sinh Protein tổng hợp BCR-ABL, (9; 22) sản phẩm dịch mã thiếu để tạo, trì tiến triển bệnh bạch cầu dịng tủy mãn tính Sự can thiệp RNA cách tiếp cận gen im lặng cấp độ sau phiên mã thấy dsRNA nhắm mục tiêu chống lại vùng dịch chuyển dẫn đến ức chế 90% mRNA BCR-ABL Nhiễm sắc thể Philadelphia [t (9; 22) (q34; q11)] dấu hiệu tế bào học bệnh bạch cầu dịng tủy mãn tính người Sự chuyển vị dẫn đến hợp gen nhiễm sắc thể 22 (BCR) với phần gen gây ung thư ABL từ nhiễm sắc thể siB3A2 nhắm mục tiêu vùng chuyển điểm siRNA sang BCR-ABL trải dài ngang gen BCR c-ABL SiRNA kiểm sốt (siControl) chuỗi xáo trộn khơng mã hóa cho gen biết.siRNA sử dụng nồng độ μ g × 10 tế bào điện hóa Các tế bào chuyển sang môi trường RPMI Sau 24 giờ, điện di lặp lại Đối với thử nghiệm phản ứng liều lượng (Hình 4e, bảng giữa), nồng độ siRNA μ g / × 10 tế bào lấy 100%, 0, μ g / × 10 50% 0, 25 g / × 10 tế bào im lặng 25% Sự giảm đặc biệt M -BCR/ABL tế bào K562 nhờ điện xung với siRNA loại rõ mức c -bcr c -abl nội sinh khơng có biến đổi Khi điện xung M -BCR/ABL siRNA vào tế bào PBMC CD34+ khiết lấy từ bệnh nhân bị bệnh bạch cầu dịng tủy mạn tính với siRNA làm giảm ung thư tới 50-79% ... lượng nhỏ siRNA đưa vào tế bào cố thể đủ để làm tắt hoàn toàn biểu gene (vốn có nhiều thể đa bào).=> ứng dụng điều trị ung thư Ứng dụng điều trị ung thư siRNA thăm dị với tư cách cơng cụ điều hòa... thuốc đặc hiệu ung thư điều chế Các nhà nghiên cứu dùng nhiều phương pháp để đưa RNA can thiệp vào tế bào mục đích khám phá đường tín hiệu sinh tồn có tế bào ung thư Cơ chế tắt gene siRNA có hiệu... tương đồng siRNA mRNA phần xu hướng xảy ức chế dịch mã chung bám mRNA => ngăn cản dịch chuyển Ribosome trình dịch mã => trình dịch mã bi ngưng lại => không tạo protein Ung thư Tế bào ung thư hình