Nghiên cứu quá trình phân hủy sinh học mủ cao su thải

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI Bùi Thị Trang NGHIÊN CỨU QUÁ TRÌNH PHÂN HỦY SINH HỌC MỦ CAO SU THẢI LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ SINH HỌC Hà Nội, 2013 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI Bùi Thị Trang NGHIÊN CỨU QUÁ TRÌNH PHÂN HỦY SINH HỌC MỦ CAO SU THẢI Chuyên ngành: Công nghệ sinh học NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: Nguyễn Lan Hương Hà Nội, 2013 Nghiên cứu trình phân hủy sinh học mủ cao su thải LỜI CAM ĐOAN Tôi Bùi Thị Trang xin cam đoan nội dung luận văn với đề tài “Nghiên cứu trình phân hủy sinh học mủ cao su thải” cơng trình nghiên cứu sáng tạo tơi thực hướng dẫn PGS TS Nguyễn Lan Hương Số liệu, kết trình bày luận văn hồn tồn trung thực chưa cơng bố cơng trình khoa học khác Bùi Thị Trang CNSH11B.KH Nghiên cứu trình phân hủy sinh học mủ cao su thải LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng cảm ơn chân thành sâu sắc tới PGS TS Nguyễn Lan Hương – Bộ môn Công nghệ sinh học – Viện Công nghệ sinh học Công nghệ thực phẩm – Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội bảo tận tình suốt q trình tơi học tập, nghiên cứu hồn thành luận văn Tôi xin cảm ơn thầy cô thuộc Viện Công nghệ sinh học Công nghệ thực phẩm, cán công tác Trung tâm nghiên cứu phát triển Công nghệ sinh học – Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội giúp đỡ dạy bảo thời gian làm việc trung tâm Bên cạnh người thân bạn bè động lực, nguồn động viên đặc biệt anh chị bạn làm việc Trung tâm nghiên cứu phát triển Cơng nghệ sinh học Phịng thí nghiệm Cơng nghệ sinh học C10 giúp đỡ nhiều suốt q trình học tập, nghiên cứu hồn thành luận văn Chân thành! Bùi Thị Trang Bùi Thị Trang CNSH11B.KH Nghiên cứu trình phân hủy sinh học mủ cao su thải MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN LỜI CẢM ƠN DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC BẢNG .7 DANH MỤC HÌNH MỞ ĐẦU CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 TỔNG QUAN NGÀNH CÔNG NGHIỆP SƠ CHẾ MỦ CAO SU 1.1.1 Lịch sử cao su tình hình phát triển 1.1.1.1 Giới thiệu 1.1.1.2 Trên giới 1.1.1.3 Việt Nam 1.1.2 Thành phần cấu trúc mủ nước (latex) 1.1.3 Phân biệt cao su thiên nhiên cao su tổng hợp 1.1.4 Công nghệ sơ chế cao su thiên nhiên 1.2 MỦ THẢI CAO SU THIÊN NHIÊN 1.3 VI SINH VẬT PHÂN HỦY CAO SU 1.3.1 Sự phân hủy cao su vi khuẩn xạ khuẩn 1.3.2 Sự phân hủy cao su nấm .11 1.4 CON ĐƯỜNG PHÂN HỦY MỦ CAO SU .12 1.5 CÁC PHƯƠNG PHÁP ĐÁNH GIÁ KNPH MỦ CAO SU BỞI VI SINH VẬT .13 1.5.1 Quan sát phát triển vi sinh vật bề mặt thạch MSM có bổ sung DPNR nhuộm Schiff sản phẩm phân hủy 13 1.5.2 Quan sát thay đổi bề mặt cao su mắt thường kính hiển vi điện tử quét (SEM) 14 1.5.3 Khảo sát giảm khối lượng cao su sau thời gian nuôi cấy .14 1.5.4 Khảo sát tăng sinh khối q trình ni cấy với cao su 15 Bùi Thị Trang CNSH11B.KH Nghiên cứu trình phân hủy sinh học mủ cao su thải 1.5.5 Bước đầu khảo sát sản phẩm tạo thành trình phân hủy 15 1.5.6 Bước đầu khảo sát gen liên quan tới KNPH vi sinh vật 17 CHƯƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 18 2.1 VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 18 2.1.1 Nguồn phân lập 18 2.1.1.1 Mẫu nước thải, mủ thải, đất lấy từ nhà máy chế biến mủ cao su Cẩm Thủy - Thanh Hóa 18 2.1.1.2 Mẫu nước bùn hoạt hóa bể nuôi chứa mủ cao su (Enrichment) .18 2.1.2 Cơ chất thử KNPH cao su vi sinh vật 18 2.1.2.1 Cao su tổng hợp (SR: Synthetic Rubber) .18 2.1.2.2 Găng tay cao su thiên nhiên (LG: Latex Glove) 18 2.1.2.3 Cao su loại protein dạng lỏng (Deproteinized natural rubber: DPNR) 19 2.1.2.4 Cao su loại protein dạng màng .19 2.1.3 Thiết bị 19 2.1.4 Môi trường nuôi cấy 20 2.1.5 Hóa chất 21 2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22 2.2.1 Sơ đồ nghiên cứu 22 2.2.2 Nội dung nghiên cứu 23 2.2.2.1 Phân lập vi sinh vật có KNPH mủ cao su .23 2.2.2.2 Định tên chủng lựa chọn kĩ thuật sinh học phân tử 16S-rDNA 24 2.2.2.3 Khảo sát gen lcp chủng vi sinh vật lựa chọn 27 2.2.2.4 Đánh giá khả phát triển, phân hủy cao su chủng lựa chọn 28 2.2.2.5 Khảo sát ảnh hưởng số yếu tố đến KNPH DPNR chủng NMD1 mẫu Enrichment 31 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .33 3.1 PHÂN LẬP VI SINH VẬT CÓ KNPH CAO SU 33 3.2 ĐỊNH TÊN CÁC CHỦNG LỰA CHỌN BẰNG KĨ THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ 16S- RDNA 35 Bùi Thị Trang CNSH11B.KH Nghiên cứu trình phân hủy sinh học mủ cao su thải 3.3 KHẢO SÁT GEN LCP CỦA CÁC CHỦNG LỰA CHỌN 37 3.4 ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG PHÁT TRIỂN, PHÂN HỦY CAO SU CỦA CÁC CHỦNG LỰA CHỌN 38 3.4.1 Đánh giá KNPH cao su tổng hợp .38 3.4.2 Đánh giá KNPH DPNR 39 3.4.3 Đánh giá khả phát triển phân hủy găng tay cao su thiên nhiên 40 3.4.4 Đánh giá khả phát triển phân hủy miếng DPNR màng 41 3.5 KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA MỘT SỐ YẾU TỐ ĐẾN KHẢ NĂNG PHÁT TRIỂN VÀ PHÂN HỦY DPNR CỦA CHỦNG NMD1 VÀ MẪU ENRICHMENT 43 3.5.1 Xác định đường cong sinh trưởng chủng NMD1 mẫu Enrichment môi trường nhân giống .43 3.5.2 Ảnh hưởng mật độ tế bào ban đầu chủng NMD1 mẫu Enrichment 45 3.5.3 Ảnh hưởng nồng độ NH NO mơi trường khống MSM 48 3.5.4 Ảnh hưởng pH môi trường ban đầu .50 3.5.5 Ảnh hưởng nhiệt độ nuôi cấy .53 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 57 TÀI LIỆU THAM KHẢO 59 PHỤ LỤC 63 Bùi Thị Trang CNSH11B.KH Nghiên cứu trình phân hủy sinh học mủ cao su thải Danh mục chữ viết tắt DPNR Cao su loại protein (Deproteined natural rubber) KNPH Khả phân hủy KL Khối lượng GPC Sắc ký lọc gel (Gel permeation chromatography) SEM Chụp hiển vi điện tử (Scanning electron microscopy) DRC Hàm lượng cao su khô mủ (Dried rubber concent) NMR Cộng hưởng từ hạt nhân (Nuclear magnetic resonance) TLC Sắc ký mỏng (Thin-Layer chromatography) HPLC Sắc lý lỏng cao áp (High-pressure liquid chromatography) HPLC-MS Sắc ký lỏng cao áp- khối phổ (High-pressure liquid chromatography- mass spectrometry) Bùi Thị Trang CNSH11B.KH Nghiên cứu trình phân hủy sinh học mủ cao su thải Danh mục bảng Bảng 1.1 Diện tích quy hoạch vùng trồng cao su Việt Nam Bảng 1.2 Thành phần hóa học mủ nước [3] .5 Bảng 1.3 Bảng phân loại mủ nước [3] .8 Bảng 1.4 Bảng phân loại mủ tạp [3] Bảng 2.1 Mơi trường khống MSM 20 Bảng 2.2 Môi trường hoạt hóa LB 1/5 .20 Bảng 3.1 Các chủng vi sinh vật phân lập 33 Bảng 3.2 Đặc điểm hình thái khuẩn lạc chủng phân lập .34 Bảng 3.3 Sự giảm khối lượng hàm lượng nitơ tổng số miếng găng tay cao su sau 30 ngày nuôi cấy với chủng .40 Bảng 3.4 Sự giảm khối lượng hàm lượng nitơ tổng số miếng DPNR sau 30 ngày nuôi cấy với chủng 42 Bùi Thị Trang CNSH11B.KH Nghiên cứu trình phân hủy sinh học mủ cao su thải Danh mục hình Hình 1.1 Cấu tạo cao su thiên nhiên [3] Hình 1.2 Sơ đồ cơng nghệ sơ chế cao su thiên nhiên [3, 4] Hình 1.3 Con đường phân hủy mủ cao su 13 Hình 2.1 Bể bùn hoạt hóa Enrichment 18 Hình 2.2 Quy trình tạo cao su loại protein 19 Hình 2.3 Sơ đồ nghiên cứu 22 Hình 3.1 Khả phát triển chủng môi trường DPNR sau 14 ngày nuôi cấy 35 Hình 3.2 DNA chủng lựa chọn gel agarose 0,8% 35 Hình 3.3 Sản phẩm PCR 16S chủng lựa chọn 36 Hình 3.4 Cây quan hệ họ hàng 16S- rDNA chủng lựa chọn 37 Hình 3.5 Sản phẩm PCR-Lcp gen gel agarose 0,8% 38 Hình 3.6 Kết chạy GPC ni cấy chủng mơi trường khống với nguồn cacbon cao su tổng hợp sau 30 ngày 39 Hình 3.7 Kết chạy GPC nuôi cấy chủng môi trường khoáng với nguồn cacbon DPNR sau 30 ngày 40 Hình 3.8 Hình ảnh chụp SEM miếng găng tay cao su sau 30 ngày nuôi cấy với chủng 41 Hình 3.9 Khả phát triển chủng miếng DPNR sau 14 ngày 30 ngày nuôi cấy 42 Hình 3.10 Đường cong sinh trưởng chủng NMD1 môi trường nhân giống .44 Hình 3.11 Đường cong sinh trưởng mẫu Enrichment môi trường nhân giống .44 Hình 3.12 Ảnh hưởng mật độ tế bào ban đầu chủng NMD1 sau 30 60 ngày nuôi cấy 45 Hình 3.13 Khả phát triển chủng NMD1trên miếng DPNR sau 30 60 ngày mật độ tế bào ban đầu khác 46 Bùi Thị Trang CNSH11B.KH Nghiên cứu trình phân hủy sinh học mủ cao su thải 370C không nhiều sau 30 ngày sau 60 ngày Sau 30 ngày 300C khối lượng giảm 17.74±0.7%, 370C 18.67±0.38% sau 60 ngày 300C giảm 27.79±1.58%, 370C 26.95±0.93% Kết hoàn toàn tương đồng với phát triển mẫu Enrichment.ở 300C, 370C (hình 3.27) KNPH DPNR mẫu Enrichment.sau 60 ngày gấp khoảng 1.5 lần so với 30 ngày Như 300C-370C khoảng nhiệt độ tốt cho phát triển phân hủy mẫu Enrichment KC 300C 370C 30 ngày KC 300C 370C 60 ngày Hình 3.27 Khả phát triển mẫu Enrichment miếng DPNR sau 30 60 ngày nuôi cấy 300C, 370C Từ kết khảo sát yếu tố ảnh hưởng tới khả sinh trưởng phân hủy DPNR chủng NMD1 mẫu Enrichment thấy yếu tố ảnh hưởng nhiều nồng độ NH NO , tiếp đến nồng độ vi sinh vật ban đầu, pH môi trường ban đầu nhiệt độ So sánh với chủng Streptomyces sp La7 cơng bố chủng NMD1 có KNPH tương đương Chủng NMD1 sau 30 ngày nuôi cấy, khối lượng giảm 12.54% (ở điều kiện nuôi: 370C, pH=7, nồng độ 0.1% (wt/v), nồng độ NH NO g/l) chủng Streptomyces sp La7 sau 32 ngày nuôi không lắc 30oC, khối lượng giảm 13.5% [19] Và mẫu Enrichment có KNPH tốt hẳn so với chủng Streptomyces sp La7 Mẫu Enrichment sau 30 ngày Bùi Thị Trang 55 CNSH11B.KH Nghiên cứu trình phân hủy sinh học mủ cao su thải nuôi cấy khối lượng giảm 25.31% (ở điều kiện nuôi: 300C, pH= 7, nồng độ 0.1% (wt/v), nồng độ NH NO g/l) Tuy vậy, so với chủng Nocardia sp.835A sau 21 ngày ủ, găng tay cao su có khối lượng 60-70 mg phân hủy gần hoàn toàn chủng NMD1 mẫu Enrichment phân hủy hơn[10] Để so sánh xác KNPH chủng trên, cần sử dụng chủng chuẩn công bố nuôi cấy chủng điều kiện Bùi Thị Trang 56 CNSH11B.KH Nghiên cứu trình phân hủy sinh học mủ cao su thải KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận: 1) Đã phân lập 11 chủng có KNPH mủ cao su Lựa chọn chủng NMD1, M4D1b, M4T1c, T37 có KNPH tốt để tiếp tục nghiên cứu KNPH cao su 2) Đã định tên chủng lựa chọn kĩ thuật sinh học phân tử 16S rDNA cho thấy Streptomyces griseorubens [AY999870] (99%) M4T1c, NMD1, S albogriselus [AB184780] (99%) M4D1b, Nocardiopsis alba [FJ4811638] (99%) T37 3) Bước đầu khảo sát chủng NMD1, M4D1b, M4T1c mang gen lcp 4) Đã đánh giá KNPH cao su chủng lựa chọn: − Kết GPC sản phẩm sau 30 ngày nuôi cấy cho thấy chủng M4D1b có KNPH cao su thiên nhiênvà cao su tổng hợp tốt chủng khác − Kết khối lượng găng tay giảm, chụp SEM bề mặt miếng găng tay sau 30 ngày nuôi cấy với cho thấy chủng NMD1 chủng có KNPH mạnh − Kết khối lượng miếng DPNR giảm hàm lượng nitơ tổng sau 30 ngày nuôi cấy cho thấy chủng NMD1 mẫu Enrichment có KNPH tốt 5) Đã khảo sát yếu tố ảnh hưởng nhiều tới khả phát triển phân hủy DPNR màng chủng NMD1 mẫu Enrichment nồng độ NH NO , tiếp đến nồng độ vi sinh vật ban đầu, pH ban đầu nhiệt độ nuôi cấy − Nồng độ NH NO 5-10 g/l, nồng độ vi sinh vật ban đầu: 0.1% (wt/v), pH ban đầu nhiệt độ 300C điều kiện tốt cho phát triển phân hủy chủng NMD1 − Nồng độ NH NO g/l, nồng độ vi sinh vật ban đầu: 0.1% (wt/v), pH ban đầu nhiệt độ 300C-370C điều kiện tốt cho phát triển phân hủy mẫu Enrichment Bùi Thị Trang 57 CNSH11B.KH Nghiên cứu trình phân hủy sinh học mủ cao su thải Kiến nghị: 1) Tiếp tục phân lập vi sinh vật có KNPH cao su 2) Xác định thành phần vi sinh vật có mặt mẫu Enrichment kĩ thuật điện di DGGE Từ tìm mối liên hệ chủng phân lập hệ vi sinh vật 3) Nghiên cứu hệ vi sinh có KNPH mủ cao su để ứng dụng việc xử lý nước thải ngành công nghiệp cao su Bùi Thị Trang 58 CNSH11B.KH Nghiên cứu trình phân hủy sinh học mủ cao su thải TÀI LIỆU THAM KHẢO Cơng ty cổ phần chứng khốn FPT chi nhánh Hồ Chí Minh (2012), Báo cáo ngành Cao su thiên nhiên Nguyễn Thị Huệ (2007), Cây cao su, Hiệp hội cao su Việt Nam Trường trung học kỹ thuật nghiệp vụ cao su (2003), Lý thuyết kỹ thuật chế biến cao su Tổng công ty cao su Việt Nam( lưu hành nội bộ) 11-23 Nguyễn Hữu Trí (2008), Công nghệ cao su thiên nhiên Linos A., Berekaa M., Steinbuchel A., Kim K K., Sproer C., and Kroppenstedt R M (2002), ''Gordonia westfalica sp nov., a novel rubberdegrading actinomycete'', Int J Syst Evol Microbiol, 52,(Pt 4), p 1133-9 Linos A., Berekaa M.M., Reichelt R., Keller U., Schmitt J., Flemming H.C., and et al (2000), ''Biodegradation of poly (cis-1,4-polyisoprene) rubbers by distinct actinomycetes: microbial strategies and detailed surface analysis'', A E Microbiol, (66), p 1639-1645 Linos A., Reichelt R., Keller U., and Steinbuchel A (2000), ''A Grambegative bacterium, identified as Pseudomonas aeruginosa AL98, is a potent degrader ò natural rubber and synthetic cis-1,4- polyisoprene'', FEMS Microbiol Lett(182), p 155-161 Tsuchii A and Takeda K (1990), ''Rubber- degrading enzyme from a bacterial culture'', A E Microbiol, (56), p 269-274 Tsuchii A., Suzuki T., and Takeda K (1985), ''Microbial degradation of natural rubber vulcanizates'', A E Microbiol, (50), p 965-970 10 Tsuchii A., Kiyoshi Takeda, Tomoo Suzuki, and Yutaka Tokiwa (1996), ''Colonization and degradation of rubber pieces by Nocardia sp'', Biodegradation, 7, p 41-48 11 Broker D., Dietz D., Arenskotter M., and Steinbuchel A (2008), '' The genomes of the non-clearing- zone- forming and natural rubber degrading species Godornia polyisopreneivorans and Gordonia westfalica harbor genes expressing lcp activity in Streptomyces strains'', A E Microbiol, (74), p 2288-2297 Bùi Thị Trang 59 CNSH11B.KH Nghiên cứu trình phân hủy sinh học mủ cao su thải 12 Broker D., Arenskotter M., Legatzki A., Nies DH., and Steinbuchel A (2004), ''Characterization of the 101-kilobase-pair megaplasmid pKB1, isolated from the rubber - degrading bacterium Gordonia westfalica Kb1.'', J.Bacteriol, (186), p 212-225 13 Jendrossek D., Tomasi G., and Kroppenstedt R.M (1997), ''Bacterial degradation of natural rubber: a privilege of actinomycetes?'', FEMS Microbiol Lett, (150), p 179-188 14 Jendrossek D and Reinhardt S (2003), ''Sequence analysis of a gene product synthesized by Xanthomonas sp during growth on natural rubber latex'', FEMS Microbiol Lett, (224), p 61-65 15 Kwiatkowska D., Zyska B.J., and Zankowicz L.P (1980), '' Microbial deterioration of natural rubber sheets by soil microorganisms '', Biodeterioration, 4, p 135–141 16 Spence D and Van Niel C.B (1936), ''Bacteriol decomposition of the rubber in Hevea latex'', Ind.Eng.Chem, 28, p 847-850 17 Ibrahim E.M., Arenskotter M., Lufmann H., and Steinbuchel A (2006), ''Identification of poly (cis-1,4-isoprene) degradation intermediates during growth of moderately thermophilic actinomycetes on rubber and cloning of a functional lcp homologue from Nocardia farcinia strains E1'', A E Microbiol, (72), p 3375-3382 18 Williams G.R (1982), '' The breakdown of rubber polymers by microorganisms.'', Int Biodeterior Bull , 18, p 31–36 19 Claudia Gallert (2000 ), ''Degradation of latex and of natural rubber by Streptomyces strain La 7'', Syst Appl Microbiol, 23, p 433-41 20 Bode H.B., Kerkhoff K., and Jendrossek (2001), ''Bacterial degradation of natural and synthetic rubber '', Biomacromolecules 2, p 295-303 21 Bode HB., Zeeck, Pluckhahn K., and Jendrossek K (2000), ''Physiological and chemical investtigation into microbial degradation of synthetic poly(cis1,4-isoprene)'', A E Microbiol, (66), p 3680-3685 Bùi Thị Trang 60 CNSH11B.KH Nghiên cứu trình phân hủy sinh học mủ cao su thải 22 Rose K and Steinbuchel K (2002), ''Construction and intergeneric conjugative transfer of a pSG5-based cosmid vector from Escheriachia coli to the polyisoprene rubber degrading strain Micromonospora aurantiaca W2b'', FEMS Microbiol Lett, (211), p 129-132 23 Rose K., Tenberge K.B., and Steinbuchel A (2005), ''Identification and characterization of genes from Streptomyces sp strain K30 reponsible for clear zone formation on natural rubber latex and poly (cis-1,4-isoprene) rubber degradation'', Biomacro molecules, (6), p 180-188 24 Arenskotter M., Baumeister D., Berekaa M.M., Potter G., Kroppenstedt R M., Linos A., and and Steinbuchel A (2001), ''Taxonomic characterization of two rubber degrading bacteria belong to the spieces Gordonia polyisoprenivorants and analysis of hapervariable regions of 16S rDNA sequence '', FEMS Microbiol.Lett, 205, p 277-282 25 Arenskotter M., Broker D., and Steinbuchel A (2004), ''Biology of metabolically diverse genus Gordonia'', A E Microbiol, (70), p 3195-3204 26 Borel M., Kergomard A., and Renard M.F (1982), ''Degradation of natural rubber by fungi imperfecti'', Agric Biol Chem, 46, p 877–881 27 Yikmis M., Arenskotter M., Rose K., Lange N., Wernsman H., Wiefel L., and et al (2008), ''Secretion and transcriptional regulation of the latex- clear protein, Lcp, by the rubber degrading bacterium Streptomyces sp strain K30'', A E Microbiol, (74), p 5373-5382 28 Braaz R., Fischer P., and Jendrossek D (2004), ''Novel type of hemedependent oxygenase catalyzes oxidative cleavage of rubber (poly-cis-1,4isoprene)'', A E Microbiol, (70), p 7388-7395 29 Braaz R., Armbruster W., and Jendrossek D (2005), ''Heme-dependent rubber oxygenase RoxA of Xanthomonas sp cleaves the carbon backbone of poly(cis-1,4-isoprene) by a dioxygenase mechanism'', A E Microbiol, (71), p 2473-2478 30 Warneke S., Arenskötter M., Tenberge K.B., and Steinbüchel A (2007 ), Bùi Thị Trang 61 CNSH11B.KH Nghiên cứu trình phân hủy sinh học mủ cao su thải ''Bacterial degradation of poly(trans-1,4-isoprene) (gutta percha)'', Microbiology, 153, p 347-56 31 Imai Shunsuke, Ichikawa Kazuya, Muramatsu Yuki, Kasai Daisuke, Masai Eiji, and Fukuda Masao (2011), ''Isolation and characterization of Streptomyces, Actinoplanes, and Methylibium strains that are involved in degradation of natural rubber and synthetic poly(cis-1,4-isoprene)'', Enzyme and Microbial Technology, 49, p 82751-82756 32 Sirimaporn Watcharakul, Kamontam Umsakul, Brian Hodgson, Wannapa Chumeka, and Varaporn Tanrattanakul (2012), ''Biodegradation of a blended starch/natural rubber foam biopolymer and rubber gloves by Streptomyces coelicolor CH13'', Electronic Journal of Biotechnology 15, p 0717-3458 Bùi Thị Trang 62 CNSH11B.KH Nghiên cứu trình phân hủy sinh học mủ cao su thải PHỤ LỤC Phụ lục 1: Hình ảnh chủng vi sinh vật phân lập Bùi Thị Trang 63 CNSH11B.KH Nghiên cứu trình phân hủy sinh học mủ cao su thải Phụ lục Hỉnh ảnh nhuộm Gram chủng NMD1 M4D1a M4D1b M4D1c M4T1a M4T1b M4T1c M4T1d T37 T81 Bùi Thị Trang T82 64 CNSH11B.KH Nghiên cứu trình phân hủy sinh học mủ cao su thải Phụ lục Trình tự 16S rRNA gen chủng lựa chọn Chủng M4D1b GTCGAACGATGAACCACTTCGGTGGGGATTAGTGGCGAACGGGT GAGTAACACGTGGGCAATCTGCCCTGCACTCTGGGACAAGCCCTGGA AACGGGGTCTAATACCGGATACTGACCCGCTTGGGCATCCAAGCGGT TCGAAAGCTCCGGCGGTGCAGGATGAGCCCGCGGCCTATCAGCTTGT TGGTGAGGTAATGGCTCACCAAGGCGACGACGGGTAGCCGGCCTGAG AGGGCGACCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACG GGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGAAAGCCTGATGC AGCGACGCCGCGTGAGGGATGACGGCCTTCGGGTTGTAAACCTCTTT CAGCAGGGAAGAAGCGAAAGTGACGGTACCTGCAGAAGAAGCGCCG GCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGCGCGAGCGTT GTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGAGCTCGTAGGCGGCTTGTCACGTC GGTTGTGAAAGCCCGGGGCTTAACCCCGGGTCTGCAGTCGATACGGG CAGGCTAGAGTTCGGTAGGGGAGATCGGAATTCCTGGTGTAGCGGTG AAATGCGCAGATATCAGGAGGAACACCGGTGGCGAAGGCGGATCTCT GGGCCGATACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGG ATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGGTGGGCACTAGGTGT GGGCGACATTCCACGTCGTCCGTGCCGCAGCTAACGCATTAAGT Chủng M4T1c CCACTTCGGTGGGGATTAGTGGCGAACGGGTGAGTAACACGTGG GCAATCTGCCCTGCACTTTGGGACAAGCCCTGGAAACGGGGTTTAAT ACCGGATACTGACCCGCTTGGGCATCCAAGCGGTTCGAAAGCTCCGG CGGTGCAGGATGAGCCCGCGGCCTATCAGCTTGTTGGTGAGGTAATG GCTCACCAAGGCGACGACGGGTAGCCGGCCTGAGAGGGCGACCGGC CACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGT GGGGAATATTGCACAATGGGCGAAAGCCTGATGCAGCGACGCCGCGT GAGGGATGACGGCCTTCGGGTTGTAAACCTCTTTCAGCAGGGAAGAA GCGAAAGTGACGGTACCTGCAGAAGAAGCGCCGGCTAACTACGTGCC Bùi Thị Trang 65 CNSH11B.KH Nghiên cứu trình phân hủy sinh học mủ cao su thải AGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGCGCGAGCGTTGTCCGGAATTATTG GGCGTAAAGAGCTCGTAGGCGGCTTGTCACGTCGGTTGTGAAAGCCC GGGGCTTAACCCCGGGTCTGCAGTCGATACGGGCAGGCTAGAGTTCG GTAGGGGAGATCGGAATTCCTGGTGTAGCGGTGAAATGCGCAGATAT CAGGAGGAACACCGGTGGCGAAGGCGGATCTCTGGGCCGATACTGAC GCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGG TAGTCCACGCCGTAAACGGTGGGCACTAGGTGTGGGCGACATTCCAC GTCGTCCGTGCCGCAGCTAACGCATTAAGTGCCCCGCCTGGGGA Chủng NMD1 CCACTTCGGTGGGGATTAGTGGCGAACGGGTGAGTAACACGTGG GCAATCTGCCCTGCACTCTGGGACAAGCCCTGGAAACGGGGTTTAAT ACCGGATACTGACCCGCTTGGGCATCCAAGCGGTTCGAAAGCTCCGG CGGTGCAGGATGAGCCCGCGGCCTATCAGCTTGTTGGTGAGGTAATG GCTCACCAAGGCGACGACGGGTAGCCGGCCTGAGAGGGCGACCGGC CACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGT GGGGAATATTGCACAATGGGCGAAAGCCTGATGCAGCGACGCCGCGT GAGGGATGACGGCCTTCGGGTTGTAAACCTCTTTCAGCAGGGAAGAA GCGAAAGTGACGGTACCTGCAGAAGAAGCGCCGGCTAACTACGTGCC AGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGCGCGAGCGTTGTCCGGAATTATTG GGCGTAAAGAGCTCGTAGGCGGCTTGTCACGTCGGTTGTGAAAGCCC GGGGCTTAACCCCGGGTCTGCAGTCGATACGGGCAGGCTAGAGTTCG GTAGGGGAGATCGGAATTCCTGGTGTAGCGGTGAAATGCGCAGATAT CAGGAGGAACACCGGTGGCGAAGGCGGATCTCTGGGCCGATACTGAC GCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGG TAGTCCACGCCGTAAACGGTGGGCACTAGGTGTGGGCGACATTCCAC GTCGTCCGTGCCGCAGCTAACGCATTAAGTGCCCCGCCTGGGGA Chủng T37 TCGGGGTACACGAGCGGCGAACGGGTGAGTAACACGTGAGCAA CCTGCCCCTGACTCCGGGATAAGCGGTGGAAACGCCGTCTAATACCG Bùi Thị Trang 66 CNSH11B.KH Nghiên cứu trình phân hủy sinh học mủ cao su thải GATACGACCCTCCTCCGCATGGTGGGGGGTGGAAAGTTTTTTCGGTCG GGGATGGGCTCGCGGCCTATCAGCTTGTTGGTGGGGTAACGGCCTAC CAAGGCGATTACGGGTAGCCGGCCTGAGACCTGAGAGGGCGACCGGC CACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTGCGGGAGGCAGCAGT GGGGAATATTGCGCAATGGGCGAAAGCCTGACGCAGCGACGCCGCGT GGGGGATGACGGCCTTCGGGTTGTAAACCTCTTTTACCACTCACGCAG GCCCCACGTTTTCGTGGGGTTGACGGTAGGTGGGGAATAAGGACCGG CTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGTCCGAGCGTTG TCCGGAATTATTGGGCGTAAAGAGCTCGTAGGCGGCGTGTCGCGTCT GCTGTGAAAGACCGGGGCTTAACCCCGGTTCTGCAGTGGATACGGGC ATGCTAGAGGTAGGTAGGGGAGACTGGAATTCCTGGTGTAGCGGTGA AATGCGCAGATATCAGGAGGAACACCGGTGGCGAAGGCGGGTCTCTG GGCCTTACCTGACGCTGAGGAGCGAAAGCATGGGGAGCGAACAGGA TTAGATACCCTGGTAGTCCATGCCGTAAACGTTGGGCGCTAGGTGTGG GGACTTTCCACGGTTTCCGCGCCGTAGCTAACGCATTAAGCGCCCCGC CTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGG GCCCGCACAAGCGGCGGAGCATGTTGCTTAATTCGACGCCACGCGAA GAACCTTACCAAGGTTTGACATCACCCGTGGACCTGTAGAGATACAG GGTCATTTGGTTGGCGGGTGACAGGTGGTGCATGGCTGTCGTCAGCTC GTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGTT CCATGTTGCCAGCACGTAATGGTGGGGACTCATGGGAGACTGCCGGG GTCAACTCGGAGGAAGGTGGGGACGACGTCAAGTCATCATGCCCCTT ATGTCTTGGGCTGCAAACATGCTACAATGGCCGGTACAATGGGCGTG CGATACCGTGAGGTGGAGCGAATCCCTAAAAGCCGGTCTCAGTTCGG ATTGGGGTCTGCAACTCGACCCCATGAAGGTGGAGTCGCTAGTAATC GCGGATCAGCAACGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACA CCGCCCGTCACGTCATGAAAGTCGGCAACACCCGAA Bùi Thị Trang 67 CNSH11B.KH Nghiên cứu trình phân hủy sinh học mủ cao su thải Phục lục Hình ảnh miếng DPNR màng Phụ lục Khối lượng sinh khối chủng NMD1 mẫu Enrichment theo thời gian xác định Bảng Khối lượng sinh khối NMD1 sau ngày hoạt hóa Ngày KL sk 0.67±0.01 1.255±0.015 1.83±0.01 2.04±0.02 1.995±0.015 Bảng Khối lượng sinh khối Enrichment sau hoạt hóa Giờ 24 32 40 48 56 64 KL sk 0.845±0.035 1.225±0.005 1.56±0.001 1.815±0.005 1.98±0.01 2.09±0.01 2.14±0.03 Phụ lục Sự giảm khối lượng miếng DPNR sau 30 60 ngày nuôi cấy với chủng NMD1 mẫu Enrichment (Enrich) điều kiện khác Bảng Ảnh hưởng mật độ tế bào ban đầu chủng NMD1 mẫu Enrichment sau 30 60 ngày nuôi cấy % Khối lượng giảm Mẫu KC 107 NMD1 60 ngày 0.11±0.11 0.2±0.2 106 105 8.06±0.2 12.17±0.21 12.54±0.16 1014 Enrich 30 ngày 1013 1012 25.31±0.94 17.74±0.7 16.68±0.37 Bùi Thị Trang 68 107 106 105 15.21±0.65 21.31±0.18 24.51±0.31 1014 1013 1012 29.77±0.02 26.95±0.93 22.41±1.64 CNSH11B.KH Nghiên cứu trình phân hủy sinh học mủ cao su thải Bảng Ảnh hưởng nồng độ NH NO sau 30 60 ngày nuôi cấy với chủng NMD1 mẫu Enrichment % Khối lượng giảm Mẫu 30 ngày 10 KC 0.11±0.11 0.11±0.11 NMD1 12.49±0.2 12.17±0.21 60 ngày 10 0.11±0.11 0.2±0.2 0.2±0.2 0.2±0.2 8.11±0.06 25.12±0.42 21.31±0.18 12.53±0.39 Enrich 19.9±0.93 17.74±0.7 12.92±0.01 27.3±0.22 26.95±0.93 16.57±0.88 Bảng Ảnh hưởng pH (8, 7, 6) sau 30 60 ngày nuôi cấy với chủng NMD1 mẫu Enrichment % Khối lượng giảm Mẫu 30 ngày KC 0.34±0.11 60 ngày 0.11±0,11 0.11±0.11 0.2 0.2±0.2 0.42±0.02 NMD1 11.86±0.39 12.17±0.21 Enrich 17.47±0.1 1.91±0.12 19.33±0.58 21.31±0.18 3±0.37 17.74±0.7 16.68±0.37 20.05±0.19 26.95±0.93 18.66±0.46 Bảng Ảnh hưởng nhiệt độ sau 30 60 ngày nuôi cấy với chủng NMD1 mẫu Enrichment % Khối lượng giảm Mẫu 30 ngày 60 ngày 300C 370C 300C 370C KC 0.11±0.11 0.11±0.11 0.2±0.2 0.2±0.2 NMD1 15.85±0.15 12.17±0.21 23.62±1.5 21.31±0.18 Enrich 17.74±0.7 18.67±0.38 26.95±0.93 27.79±1.58 Bùi Thị Trang 69 CNSH11B.KH ... cứu trình phân hủy sinh học mủ cao su thải LỜI CAM ĐOAN Tôi Bùi Thị Trang xin cam đoan nội dung luận văn với đề tài ? ?Nghiên cứu trình phân hủy sinh học mủ cao su thải? ?? công trình nghiên cứu sáng... hủy cao su vi khuẩn xạ khuẩn Vi sinh vật phân hủy mủ cao su thải nghiên cứu 100 năm qua Một số vi khuẩn xạ khuẩn có KNPH cao su tìm trình phân hủy sinh học diễn chậm Phương pháp phân lập vi sinh. .. CNSH11B.KH Nghiên cứu trình phân hủy sinh học mủ cao su thải chế chiếm khoảng 2-3% tổng nguyên liệu đầu vào (số liệu thực tế nhà máy sơ chế cao su Cẩm Thủy) 1.3 Vi sinh vật phân hủy cao su 1.3.1 Sự phân