Nghiên cứu quá trình phân hủy sinh học cao su thiên nhiên protein bằng tập hợp vi sinh vật

TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI LUẬN VĂN THẠC SĨ Nghiên cứu trình phân hủy sinh học cao su thiên nhiên loại protein tập hợp vi sinh vật NGUYỄN THỊ THU TRANG Trang.NTTCB180029@sis.hust.edu.vn Ngành Công nghệ sinh học Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Giảng viên hƣớng dẫn: PGS TS Nguyễn Lan Hương Chữ ký GVHD Bộ môn: Viện: Công nghệ Sinh học Công nghệ Sinh học & Công nghệ Thực phẩm HÀ NỘI, 06/2020 TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI LUẬN VĂN THẠC SĨ Nghiên cứu trình phân hủy sinh học cao su thiên nhiên loại protein tập hợp vi sinh vật NGUYỄN THỊ THU TRANG Trang.NTTCB180029@sis.hust.edu.vn Ngành Công nghệ sinh học Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Giảng viên hƣớng dẫn: PGS TS Nguyễn Lan Hương Chữ ký GVHD Bộ môn: Viện: Công nghệ Sinh học Công nghệ Sinh học & Công nghệ Thực phẩm HÀ NỘI, 06/2020 LỜI CAM ĐOAN Tơi xin cam đoan cơng trính nghiên cứu khoa học tơi thực hướng dẫn PGS TS Nguyễn Lan Hương Các số liệu sử dụng phân tích luận văn có nguồn gốc rõ ràng, theo quy định Các kết nghiên cứu luận văn tự thực hiện, tìm hiểu, phân tích cách trung thực chưa cơng bố hình thức Tôi xin chịu trách nhiệm nghiên cứu Tác giả Nguyễn Thị Thu Trang GVHD: PGS TS Nguyễn Lan Hương i LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành nhiệm vụ giao đề tài, nỗ lực học hỏi thân cịn có hướng dẫn tận tình thầy giúp đỡ động viên bạn bè, người thân gia đính Tơi xin bày tỏ lòng cảm ơn chân thành tới PGS TS Nguyễn Lan Hương – Bộ môn Công nghệ sinh học – Viện Công nghệ sinh học Công nghệ thực phẩm – Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội hướng dẫn bảo tận tình cho tơi suốt q trình học tập, nghiên cứu hồn thành đề tài nghiên cứu Tôi xin cảm ơn TS Nguyễn Thị Thanh cán phịng thí nghiệm Trung tâm khoa học công nghệ cao su, thầy cô thuộc Viện Công nghệ sinh học Công nghệ thực phẩm giúp đỡ bảo thời gian làm việc phịng thí nghiệm Bên cạnh đó, bố mẹ bạn bè ln động lực cho tôi, đặc biệt anh chị bạn làm việc tơi Phịng thí nghiệm Trung tâm khoa học công nghệ cao su giúp đỡ tơi nhiều suốt q trình học tập, nghiên cứu hồn thành luận văn Tơi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày tháng năm 2020 Sinh viên Nguyễn Thị Thu Trang GVHD: PGS TS Nguyễn Lan Hương ii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN I LỜI CẢM ƠN II DANH MỤC BẢNG V DANH MỤC HÌNH VI DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT VII MỞ ĐẦU CHƢƠNG I TỔNG QUAN 1.1 Cao su thiên nhiên 1.1.1 Nguồn gốc phát triển cao su thiên nhiên 1.1.2 Thành phần đặc tính .3 1.2 Cao su thiên nhiên loại protein (DPNR) 1.2.1 Giới thiệu DPNR 1.2.2 Cơ chế loại protein 1.2.3 Phân loại đặc tính cao su thiên nhiên loại protein 1.2.4 Ứng dụng cao su thiên nhiên loại protein (DPNR) 1.3 Hiện trạng xử lý phế thải cao su thiên nhiên 10 1.3.1 Tình hình xử lý phế thải cao su thiên nhiên 10 1.3.2 Các phương pháp xử lý phế thải cao su 11 1.4 Phân hủy cao su thiên nhiên vi sinh vật 13 1.4.1 Con đường phân hủy cao su thiên nhiên 13 1.4.2 Phân hủy cao su thiên nhiên chủng vi sinh vật 15 1.5 Tình hình nghiên cứu nước 16 1.5.1 Các nghiên cứu nước .16 1.5.2 Các nghiên cứu nước .18 1.6 Các phương pháp đánh giá khả phân phủy sinh học DPNR vi sinh vật 19 1.6.1 Phương pháp đánh giá giảm khối lượng miếng cao su 19 1.6.2 Phương pháp nhuộm Schiff 20 1.6.3 Phân tích quang phổ hồng ngoại – FTIR 20 1.6.4 Xác định tập hợp vi sinh vật 22 GVHD: PGS TS Nguyễn Lan Hương iii CHƢƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 23 2.1 Vật liệu nghiên cứu 23 2.1.1 Nguồn phân lập .23 2.1.2 Nguồn vi sinh vật có sẵn 23 2.1.3 Cơ chất thử KNPH cao su vi sinh vật .23 2.1.4 Môi trường 24 2.1.5 Hóa chất 25 2.1.6 Thiết bị 25 2.2 Phương pháp nghiên cứu 26 2.2.1 Sơ đồ nghiên cứu 26 2.2.2 Các phương pháp nghiên cứu 28 2.3 Nội dung nghiên cứu 32 2.3.1 Làm giàu tập hợp vi sinh vật 32 2.3.2 Phân lập vi sinh vật có khả phân hủy (KNPH) cao su 33 2.3.3 Đánh giá khả phân hủy DPNR chủng vi sinh vật hỗn hợp chủng tập hợp 33 CHƢƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 35 3.1 Khả phân hủy DPNR tập hợp vi sinh vật làm giàu 35 3.1.1 Đánh giá giảm khối lượng DPNR tập hợp vi sinh vật làm giàu 35 3.1.2 Sự thay đổi cấu trúc phân tử DPNR từ canh trường làm giàu 36 3.2 Đánh giá biến động tập hợp vi sinh vật canh trường làm giàu 40 3.2.1 Sự biến động tập hợp vi sinh vật canh trường làm giàu 40 3.2.2 Mối quan hệ tập hợp vi sinh vật lần chuyển canh trường hiệu giảm khối lượng miếng DPNR 46 3.3 Phân lập vi sinh vật có khả phân hủy DPNR từ mẫu đất Sapa 50 3.4 Khả phân hủy DPNR tập hợp chủng lựa chọn 54 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 56 TÀI LIỆU THAM KHẢO 57 PHỤ LỤC 65 GVHD: PGS TS Nguyễn Lan Hương iv DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Thành phần latex cao su thiên nhiên Bảng 1.2 Tính chất cao su DNPR dạng khối Bảng 1.3 Ứng dụng DPNR ảng 2.1 Thành phần hàm lượng môi trường khoáng W 24 Bảng 2.2 Thành phần tham gia phản ứng PCR 30 Bảng 2.3 Chương trính chạy cho phản ứng PCR 31 Bảng 3.1 Tỷ lệ chi vi khuẩn theo 16S rRNA canh trường chứa DPNR 42 Bảng 3.2 Mô tả chủng vi sinh vật phân lập từ mẫu đất Sapa 51 GVHD: PGS TS Nguyễn Lan Hương v DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Cơng thức hóa học phân tử cao su Hính 1.2 Đồng phân cis - 1,4 cao su thiên nhiên Hình 1.3 Các hạt cao su (a) trước - (b) sau protein Hính 1.4 Sơ đồ quy trình chế biến DPNR Hình 1.5 Các sản DPNR Công ty cao su Sumitomo Hình 1.6 Cao su DPNR dạng khối sản phẩm từ DPNR dạng khối Hình 1.7 Con đường phân giải cao su nhờ vi sinh vật 15 Hính 1.8 Phản ứng nhóm aldehyde với thuốc thử Schiff 20 Hình 2.1 Mẫu đất thu thập từ đỉnh núi Sapa, tỉnh Lào Cai, Việt Nam 23 Hính 2.2 Sơ đồ quy trình tạo cao su thiên nhiên loại protein 24 Hình 2.3 Máy quang phổ hồng ngoại FTIR (Jasco-4600, Nhật Bản) 26 Hính 2.4 Sơ đồ nghiên cứu 27 Hình 2.5 Miếng DPNR tan dung dịch Chloroform 32 Hình 3.1 Hiệu suất giảm khối lượng miếng DPNR sau lần chuyển canh trường làm giàu (%) 35 Hình 3.2 Phổ FTIR miếng DPNR môi trường W ban đầu 37 Hình 3.3 Phổ FTIR miếng DPNR mẫu kiểm chứng (KC) mẫu canh trường (E1, E3, E6 E9) lần làm giàu thứ 1, 3, 38 Hình 3.4 Tỷ lệ ngành vi khuẩn canh trường chứa DPNR dựa vào trình tự 16S rRNA 41 Hình 3.5 Biểu đồ phân cụm mức phân loại ngành 47 Hình 3.6 Biểu đồ biplot biểu diễn mối tương quan hiệu suất giảm khối lượng miếng DPNR thành phần vi sinh vật mức ngành canh trường lần chuyển mẫu 48 Hình 3.7 Hình thái khuẩn lạc chủng 3D1 phân lập từ mấu đất Sapa 52 Hình 3.8 Nhuộm Schiff chủng 3D1 đĩa thạch DPNR lớp 53 Hính 3.9 Hiệu suất giảm khối lượng miếng DPNR chủng vi sinh vật riêng lẻ tập hợp vi sinh vật kết hợp lại 54 GVHD: PGS TS Nguyễn Lan Hương vi DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT Ký hiệu Nội dung ANRPC Association of Natural Rubber Producing Countries – Hiệp hội Các nước Sản xuất Cao su tự nhiên CA Cluster Analysis – Phân tích cụm CSTN Cao su thiên nhiên DES Deep Eutectic Solvents DNA Deoxyribonucleic Acid Deproteinized natural rubber – Cao su thiên nhiên loại protein Deprotein Natural Rubber with Enzyme – Cao su thiên nhiên loại protein enzyme Food anh Drug Administration – Cục quản lý dược phẩm DPNR E-DPNR FDA FTIR GPC HANR Fourier Transform InfraRed – Quang phổ hồng ngoại biến đổi Fourier Gel permeation chromatography – Sắc ký thẩm thấu gel Hight Amoni Natural Rubber – Cao su thiên nhiên hàm lượng nitơ cao HNS Hydroxylamine Neutral Sulphate KHPH PBS PCA PCR Khả phân hủy Sodium Phosphate Buffer Principal Components Analysis Polymerase Chain Reaction Protein Precipitation Solution – Dung dịch kết tủa protein Sodium Dodecyl Sulfate Salt/Ethanol Wash Solution DNase-free Tris-Acetic-EDTA Tiêu Chuẩn Việt Nam Upflow Anearobic Sludge Blanket Deprotein Natural Rubber with Ure Vi sinh vật PPS SDS SEWS-M TAE TCVN UASB U-DPNR vsv GVHD: PGS TS Nguyễn Lan Hương vii MỞ ĐẦU Cao su thiên nhiên (CSTN) vật liệu sản xuất từ mủ cao su (Hevea brasiliensis) CSTN có nhiều đặc tình tuyệt vời như: tình kháng nước, tình cách điện, tình dẻo, tình đàn hồi thân thiện với môi trường nên chúng lựa chọn làm vật liệu để sản xuất thiết bị y tế chuyên dụng (gang tay, ống dẫn truyền,…), đồ dùng gia đính (lốp xe, nệm cao su, ủng, giầy dép,…), xây dựng (các loại vật liệu chống trơn trượt sàn), cầu đường, thiết bị ngành cơng nghiệp đóng tàu Tuy nhiên, hợp phần protein mủ cao su chứng minh nguyên nhân chình gây dị ứng da sử dụng sản phẩm có tiếp xúc với người ên cạnh CSTN chứa hàm lượng protein lớn gây mùi thối q trính bảo quản Việc loại bỏ protein khỏi CSTN mang lại nhiều lợi ìch như: chống dị ứng, làm tăng tình đàn hồi, giảm độ bền ứng suất, cải thiện độ dẻo vật liệu nên chịu ma sát, chịu nén tốt nên người tiêu dùng ưa chuộng Do xu hướng sử dụng CSTN loại protein (DPNR) để thay loại cao su thông thường Ngành công nghiệp cao su mang lại lợi ích kinh tế lớn ngành gặp khó khăn vấn đề xử lý chất thải Hiện biện pháp xử lý chất thải cao su chủ yếu phương pháp đốt chôn lấp Hạn chế phương pháp đốt gây nhiễm thứ cấp cho khơng khì, cịn phương pháp chôn lấp với thời gian phân hủy cao su kéo dài nên cần diện tích lớn Để thúc đẩy thời gian phân hủy cao su với giải pháp an tồn thân thiện với mơi trường, nghiên cứu nước tập trung vào việc sử dụng vi sinh vật để phân giải CSTN Các nghiên cứu chủ yếu phân lập vi sinh vật có khả phân giải cao su Một số nghiên cứu gen mã hóa tổng hợp enzyme xúc tác cho phản ứng liên quan đến đường phân giải cao su tiến hành tạo lập tập hợp vi sinh vật chưa đánh giá đầy đủ mẫu canh trường làm giàu từ nguồn khác nhau, mặt khác kết đem lại hiệu suất phân giải cao su thấp với thời gian phân giải kéo dài Trong nghiên cứu khơng kích hoạt tập hợp vi sinh vật phân hủy CSTN mà phân lập vi sinh vật từ mẫu đất có vị trì địa lý đặc biệt, chưa chịu tác động môi trường không liên quan đến nguồn thải cao su để nghiên cứu trình phân hủy sinh học tím kiếm, đưa GVHD: PGS TS Nguyễn Lan Hương 33 Linos, A., Berekaa M., Reichelt R., et al., Biodegradation of cis-1,4polyisoprene rubbers by distinct actinomycetes: microbial strategies and detailed surface analysis, Applied and environmental microbiology, 66(4): p 1639-1645, 2000 34 Liu, Y., Jin J., Liu H., et al., Dokdonella immobilis sp nov., isolated from a batch reactor for the treatment of triphenylmethane dye effluent, (14665034 (Electronic)), 2012 35 Nawong, C., Umsakul K., Sermwittayawong N., Rubber gloves biodegradation by a consortium, mixed culture and pure culture isolated from soil samples, Brazilian journal of microbiology : [publication of the Brazilian Society for Microbiology], 49(3): p 481-488, 2018 36 Premadasa, M.R.B., Monthly Overview of NR Economy: Natural Rubber Trends & Statistics Jan-Feb 2020, Association of Natural Rubber Producing Countries, 2020 37 Reinhard, B., Fischer P., Jendrossek D., et al., Novel type of hemedependent oxygenase catalyzes oxidative cleavage of rubber (poly-cis-1,4isoprene), (0099-2240 (Print)), 2004 38 Scientific, T., NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometer: p 1-9, 2012 39 Sharma, S.V., Birke G., Mobeen J., et al., Metabolic and taxonomic insights into the Gram-negative natural rubber degrading bacterium Steroidobacter cummioxidans sp nov., strain 35Y, PloS one, 13(5): p e0197448-e0197448, 2018 40 Spence, D., and C B van Niel, Bacterial decomposition of the rubber in Hevea latex, Ind Eng Chem, 28: p 847–850, 1936 41 Technologies, P., "Transmission Sampling Techniques – Theory and Applications", Pike Technologies: p 2, 2018 42 Trademark, SeLatex Trademark Information, Trademakia, 2005 43 Tsuchii A., K.T., T Suzuki, Colonization and degradation of rubber pieces by Nocardia sp, Biodegradation, 7: p 41-48, 1996 44 Watari, T., et al., Development of a BR-UASB-DHS system for natural rubber processing wastewater treatment, (1479-487X (Electronic)), 2016 GVHD: PGS TS Nguyễn Lan Hương 60 45 Yikmis, S.A., Importance of the latex-clearing protein (Lcp) for poly(cis1,4-isoprene) rubber cleavage in Streptomyces sp K30, MicrobiologyOpen, 1(1): p 13-24, 2012 46 Birke, J., et al., Functional Identification of Rubber Oxygenase (RoxA) in Soil and Marine Myxobacteria, Applied and Environmental Microbiology, 79(20): p 6391, 2013 47 Imai, S., et al., Isolation and characterization of Streptomyces, Actinoplanes, and Methylibium strains that are involved in degradation of natural rubber and synthetic poly(cis-1,4-isoprene), Enzyme and Microbial Technology, 49(6): p 526-531, 2011 48 Jendrossek, D., G Tomasi, andR.M Kroppenstedt, Bacterial degradation of natural rubber: a privilege of actinomycetes?, FEMS Microbiology Letters, 150(2): p 179-188, 1997 49 Kanwal, N., et al., Optimization of pH and temperature for degradation of tyre rubber by Bacillus sp strain S10 isolated from sewage sludge, International Biodeterioration & Biodegradation, 103: p 154-160, 2015 50 Linh, D.V., et al., Characterization and functional expression of a rubber degradation gene of a Nocardia degrader from a rubber-processing factory, Journal of Bioscience and Bioengineering, 123(4): p 412-418, 2017 51 Madigan, M.andJ.M (eds.), Brock Biology of Microorganisms, ed 11, 2005 52 Tsuchii, A.andK Takeda, Rubber-degrading enzyme from a bacterial culture, (0099-2240 (Print)), 1990 53 Watcharakul, S., et al., Biochemical and spectroscopic characterization of purified Latex Clearing Protein (Lcp) from newly isolated rubber degrading Rhodococcus rhodochrous strain RPK1 reveals novel properties of Lcp, BMC Microbiology, 16(1): p 92, 2016 54 Arenskötter, B.M., Berekaa D , Pötter M , Gabriele K., Linos R , Steinbüchel A., Taxonomic characterization of two rubber degrading bacteria belonging to the species Gordonia polyisoprenivorans and GVHD: PGS TS Nguyễn Lan Hương 61 analysis of hyper variable regions of 16S rDNA sequences, FEMS microbiology letters, 205: p 277-82, 2002 55 Bode, H., Kerkhoff K., Jendrossek D., et al., Bacterial degradation of natural and synthetic rubber, Biomacromolecules, 2: p 209-303, 2001 56 Chia, K., Nanthinia J., Thottathi G., et al., Identification of new rubberdegrading bacterial strains from aged latex, Polymer Degradation and Stability, 109: p 354-361, 2014 57 Claudia, G., Degradation of Latex and of Natural Rubber by Streptomyces Strain La 7, Systematic and Applied Microbiology, 23(3): p 433-441, 2000 58 Dedysh, S., Dunfield P., Methods in enzymology: Methods in Methane Metabolism, Part B, 495: p 32-34, 2011 59 Fatta, D., Papadopoulos A., Loizidou M., et al., A study on the landfill leachate and its impact on the groundwater quality of the greater area, Environmental Geochemistry and Health, 21: p 175-190, 1999 60 Fawaz, M., Revealing the Ecological Role of Gemmatimonadetes Through Cultivation and Molecular Analysis of Agricultural Soils, Master's Thesis, University of Tennessee: p vi, 2013 61 Hidayaty, K., Shamsul A., et al., Comparisons of Some Properties of Deproteinised Natural Rubber Vulcanisates and Observations on Dynamic Load Analysis, Journal of Rubber Research, 14: p 129-138, 2011 62 Hubbe, C., Dogu, Velzen, Analytical Staining of Cellulosic Materials: A Review, Bioresources, 14: p 15-16, 2019 63 Lan, G., et al., The drivers of soil bacterial communities in rubber plantation at local and geographic scales, Archives of Agronomy and Soil Science, 2019 64 Lawless, H., Heymann H., Sensory Evaluation of Food: Principles and Practices, New York: Chapman & Hall, 1998 65 Linh, D.V., Huong N., Tabata M., et al., Characterization and functional expression of a rubber degradation gene of a Nocardia degrader from a GVHD: PGS TS Nguyễn Lan Hương 62 rubber-processing factory, Journal of Bioscience and Bioengineering, 2017 66 Nayanashree, G.T., B., Biodegradation of Natural Rubber by Laccase and Manganese Peroxidase Enzyme of Bacillus subtilis, Environmental Processes, 2(4): p 761-772, 2015 67 Pranamuda, T., Tokiwa A., Poly (L-lactide)Degrading Enzyme Produced by Amycolatopsis sp, Macromolecular Bioscience, 1: p 25-29, 2001 68 Rifaat HM, Y.M., Identification and characterization of rubber degrading actinobacteria, Appl Ecol Environ Res, 2: p 63-70, 2004 69 Rose, K.S., Alexander, Biodegradation of Natural Rubber and Related Compounds: Recent Insights into a Hardly Understood Catabolic Capability of Microorganisms, Applied and Environmental Microbiology, 71(6): p 2803, 2005 70 Rowhani, A.R., Thomas, Scrap Tyre Management Pathways and Their Use as a Fuel—A Review, Energies, 9: p 888, 2016 71 Shah, A., Shah F.,Khattak Z., et al., Degradation of polyisoprene rubber by newly isolated Bacillus sp AF-666 from soil, Prikladnaia biokhimiia i mikrobiologiia, 48: p 45-50, 2012 72 Smitha H.S, S., et al., Bioremediation of rubber processing industry effluent by Arthrobacter sp, Vol 31-34, 2012 73 Sumitomo Rubber Industries, L., The development of "SeLatex," a deproteinized natural rubber, makes gloves comfortable for people with sensitive skin, 2005 74 Tatiana, G., Ekatariana I., Natalia O., et al., New Generation Formulations of Agrochemicals Apple Academic Press, 3: p 5-21, 2020 75 Thao, T., Watari T., Hirakataa Y., et al., Anaerobic Baffled Reactor in Treatment of Natural Rubber Processing Wastewater: Reactor Performance and Analysis of Microbial Community, Journal of Water and Environment Technology, 15(6): p 241–251, 2017 GVHD: PGS TS Nguyễn Lan Hương 63 76 Trang, B., Linh B., Huong D., Screening of Natural Rubber-Degrading Microorganisms from Rubber Processing Factory Waste in Vietnam, International Journal of Waste Resources, 3: p 9-12, 2013 77 Urakami, T., Sasaki J., Suzuki K., et al., Characterization and Description of Hyphomicrobium denitrificans sp nov, International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 45(3): p 528-532, 1995 78 Vidya, G., Lali, Biodegradation of rubber using actinobacteria isolated from rubber contaminated soil, Indian Journal of Environmental Protection, 37: p 1016-1025, 2017 79 Yunginger, R.T., et al., Extractable latex allergens and proteins in disposable medical gloves and other rubber products, Journal of Allergy and Clinical Immunology, 93(5): p 836-842, 1994 GVHD: PGS TS Nguyễn Lan Hương 64 PHỤ LỤC Phụ lục Sản lƣợng suất cao su từ 2007-2017 [6] Sản lƣợng Năm (tấn) Năng suất (kg/ha/năm) 2007 605.800 1.603 2008 660.000 1.654 2009 711.300 1.698 2010 751.700 1.712 2011 789.300 1.716 2012 877.100 1.720 2013 946.900 1.728 2014 966.600 1.696 2015 1.012.700 1.676 2016 1.035.300 1.666 2017 1.094.500 1.676 Nguồn: Tổng cục Thống kê, Hiệp hội cao su Việt Nam tổng hợp 2018 Phụ lục Các yêu cầu kỹ thuật đƣợc quy định latex CSTN đặc có hàm lƣợng protein thấp STT Tên tiêu Loại I Loại II Loại III Hàm lượng nitơ tổng, % khối 0,05 0,15 0,3 61,5 61,5 61,5 60 60 60 lượng/tổng chất rắn, không lớn Tổng hàm lượng chất rắn, % khối lượng, không nhỏ Hàm lượng cao su khô, % khối GVHD: PGS TS Nguyễn Lan Hương 65 lượng, không nhỏ Độ ổn định học a, s, không 630 630 650 1,7 1,7 1,7 0,06 0,06 0,06 0,1 0,1 0,1 8 8 8 0,7 0,7 0,7 nhỏ Chất rắn phi cao su, % khối lượng, không lớn Trị số axit béo bay (VFA), không lớn Hàm lượng cặn, % khối lượng, không lớn Hàm lượng đồng mg/kg tổng chất rắn, không lớn Hàm lượng mangan, mg/kg tổng chất rắn, không lớn 10 Trị số KOH, không lớn Phụ lục Quy tr nh sản xuất DPNR dạng latex - Ly tâm hai lần: Sản phẩm sau ly tâm xong, hạ hàm lượng lần thứ sau ly tâm lần hai, sản phẩm thu có hàm lượng protein thấp 0,08% Cách làm dễ thực nhiên giá thành cao chi phí cho ly tâm lần thứ hai cao có số lượng cao su ly tâm lần thứ (đã sản phẩm ly tâm lần) thất ngồi qua dạng skim từ đến 10%, sản phẩm loại có giá thành cao - Kem hóa lần ly tâm lần: Nguyên liệu vườn nhà máy xử lý kem hóa trước để loại bỏ phần protein (coi ly tâm lần chi phì giá thành thấp), sau ly tâm lại (coi ly tâm lần hai) Sản phẩm loại đạt yêu cầu mặt giá thành hạ phải kiểm sốt tốt q trính kem hóa (sản phẩm sau kem hóa phải khơng cịn lượng dư chất kem hóa ví q trính tồn kho sản phẩm bị kem hóa lần nữa) GVHD: PGS TS Nguyễn Lan Hương 66 Phụ lục Quy trình sản xuất DPNR CV DPNR điều chế cách xử lý latex với proteinase để thủy phân protein latex sau rửa q trính chế biến Amoniac, chất hoạt động bề mặt không ion, proteinase HNS thêm vào mủ đồng loạt cho phép phản ứng 72 bể phản ứng đáy hính nón thép khơng gỉ Sau hoàn thành phản ứng thủy phân enzyme, mủ phản ứng trung hịa axit formic lỗng đơng lại nước thiết bị đông tụ cột thiết kế đặc biệt Các coagula kết sau xử lý cách liên tục thơng qua loạt kẽ hở cuối cắt nhỏ thành mảnh vụn nhỏ máy hủy Các mảnh vụn bơm qua hính tĩnh trước vào hộp máy sấy Các mảnh vụn ướt sau sấy khơ khoảng 85°C khoảng - máy sấy khơng khì nóng Sau làm mát, mảnh vụn cân, ép, đóng kiện đóng gói theo tiêu chuẩn SMR [14] Phụ lục Phƣơng pháp vùng Vùng Số sóng Nhóm chức Alcon O-H Vùng 3700-3200 cm-1 Amit/Amin N-H Alkin đầu mạch ≡C-H Ankyl C-H (mũi < 3000 cm-1) Vùng -1 Aryl vinyl C-H (mũi > 3000 cm-1) 3200-2700 cm Anđehit C-H Axit cacboxylic O-H Ankin C≡C Vùng 2300-2000 cm-1 Vùng 1850-1650 cm-1 Các nhóm chức cacbonyl (C=O) Vùng 1680-1450 cm-1 Anken C=C Nitril C≡N GVHD: PGS TS Nguyễn Lan Hương 67 Phụ lục Hình thái khuẩn lạc chủng ngân hàng vi sinh vật Viện công nghệ sinh học & Công nghệ thực phẩm – Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội Phụ lục H nh thái khuẩn lạc chủng phân lập từ mẫu đất Sapa loại đĩa thạch môi trƣờng GVHD: PGS TS Nguyễn Lan Hương 68 Trong đó: (a): hình thái khuẩn lạc chủng vi sinh vật đĩa thạch W có bổ sung 2% fructose; (b): hình thái khuẩn lạc chủng vi sinh vật đĩa thạch W- DPNR lớp bổ sung 2% fructose; (c): hình thái khuẩn lạc chủng vi sinh vật đĩa thạch W- DPNR lớp Phụ lục Kết nhuộm Schiff chủng phân lập từ mẫu đất Sapa GVHD: PGS TS Nguyễn Lan Hương 69 Phụ lục Thơng tin trình tự sử dụng cho phản ứng PCR khuếch đại đoạn gen 16S rRNA Tên STT Trình tự Barcode Trình tự mồi gắn GGAGACAAGGGA GTGCCAGCMGCCGCGGTAA E1-1 Uni515F CCAGTGTATGCA GTGCCAGCMGCCGCGGTAA E1-2 Uni515F GGATGGTGTTGC GTGCCAGCMGCCGCGGTAA E3-1 Uni515F GCGATATATCGC GTGCCAGCMGCCGCGGTAA E3-2 Uni515F TAGGATTGCTCG GTGCCAGCMGCCGCGGTAA E5-1 Uni515F ATGTGCACGACT GTGCCAGCMGCCGCGGTAA E5-2 Uni515F ACGCGCAGATAC GTGCCAGCMGCCGCGGTAA E6-1 Uni515F GACTTTCCCTCG GTGCCAGCMGCCGCGGTAA E6-2 Uni515F ATCCCGAATTTG GTGCCAGCMGCCGCGGTAA E9-1 Uni515F 10 GTTGGTCAATCT GTGCCAGCMGCCGCGGTAA E9-2 Uni515F GVHD: PGS TS Nguyễn Lan Hương mẫu Tên mồi 70 Phụ lục 10 Giá trị riêng phần trăm tích lũy phƣơng sai phân tích mức phân loại ngành Scree plot 97,492 3.5 3,722 90,879 80 Giá trị riêng 2.5 2,639 53,178 60 40 1.5 20 0.5 0,463 0,176 Phần trăm tích lũy phƣơng sai (%) 100,000 100 F1 F2 F3 F4 Phụ lục 11 Tỷ lệ ngành vi khuẩn chiếm ƣu theo 16S rRNA canh trƣờng chứa DPNR (%) Lần làm giàu E0 E1 E3 E5 E6 E9 Actinobacteria 86,57 6,20 15,82 24,56 22,32 6,18 Bacteroidetes 0,06 10,09 20,50 27,13 17,62 46,23 Firmicutes 0,33 7,01 5,18 1,59 5,11 2,46 Gemmatimonadetes 0,00 1,19 1,32 1,08 1,02 0,23 Proteobacteria 12,55 69,42 52,80 44,55 51,19 40,40 Verrucomicrobia 0,01 2,16 0,27 0,10 0,28 1,30 Ngành khác 0,48 3,93 4,11 0,98 2,46 3,19 chuyển canh trƣờng GVHD: PGS TS Nguyễn Lan Hương 71 Phụ lục 12 Phần trăm chi chiếm ƣu ngành Actinobacteria (%) Lần làm giàu chuyển E0 E1 E3 E5 E6 E9 Mycobacterium 0,02 9,10 42,21 83,21 74,40 84,08 Nocardia 0,00 48,75 28,95 12,66 16,40 6,40 Rhodococcus 0,01 9,19 13,09 0,94 3,58 2,32 Khác 99,97 32,97 15,75 3,19 5,63 7,20 canh trƣờng Phụ lục 13 Thí nghiệm đánh giá khả phân hủy DPNR sử dụng tập hợp chủng vi sinh vật Chú thích: (e): Thí nghiệm đánh giá KNPH DPNR môi trường W không chứa vi sinh vật; (f): Thí nghiệm đánh giá KNPH DPNR môi trường W tập hợp M4 (chủng 3D1, 5A1 G9) Phụ lục 14 Hiệu suất giảm khối lƣợng miếng DPNR sau lần chuyển canh trƣờng làm giàu (%) STT Lần làm giàu chuyển canh trƣờng Hiệu suất (%) 1 10,77 ± 2,25 2 17,07 ± 1,82 GVHD: PGS TS Nguyễn Lan Hương 72 3 14,5 ± 1,42 32,01 ± 2,83 39,16 ± 1,95 20,32 ± 3,22 24,71 ± 1,9 18,41 ± 3,35 (Thí nghiệm không đánh giá lần 4) Phụ lục 15 Kết đánh giá giảm khối lƣợng chủng có sẵn tập hợp vi sinh vật Chủng tập hợp Kí hiệu chủng vi sinh vật tập hợp STT Hiệu suất (%) 1A1 19,82 ± 2,83 5A1 43,92 ± 2,3 G9 3,81 ± 1,41 3D1 G9 M1 5,59 ± 0,19 3D1 5A1 M2 6,55 ± 2,41 3D1 1A1 M3 46,56 ± 2,19 3D1, 5A1 G9 M4 46,72 ± 0,87 Phụ lục 16 Kết nhuộm Gram chủng phân lập từ mẫu đất Sapa GVHD: PGS TS Nguyễn Lan Hương 73 GVHD: PGS TS Nguyễn Lan Hương 74 ... ? ?Nghiên cứu trình phân hủy sinh học cao su thiên nhiên loại protein tập hợp vi sinh vật? ?? Mục tiêu đề tài: - Nghiên cứu trình phân hủy sinh học cao su thiên nhiên loại protein tập hợp vi sinh vật. .. khả phân hủy cao su thiên nhiên loại protein tập hợp vi sinh vật làm giàu - Đánh giá biến động tập hợp vi sinh vật canh trường làm giàu - Phân lập vi sinh vật có khả phân hủy cao su thiên nhiên. .. vi sinh vật enzyme tiết từ vi sinh vật * Sử dụng vi sinh vật: Phân hủy phế thải cao su nhờ hoạt động vi sinh vật Quá trình nghiên cứu gần 100 năm chế phân hủy hạn chế Phân hủy cao su nhờ vi sinh