Nghiên cứu nâng quy mô sản xuất vắc xin sởi bán thành phẩm

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI LUẬN VĂN THẠC SĨ Nghiên cứu nâng quy mô sản xuất vắc xin sởi bán thành phẩm VŨ THỊ MAI Ngành Công Nghệ Sinh Học Giảng viên hướng dẫn: TS Nguyễn Thuý Hường PGS TS Nguyễn Thị Xuân Sâm Viện: Viện công nghệ sinh học công nghệ thực phẩm HÀ NỘI, 2021 TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI LUẬN VĂN THẠC SĨ Nghiên cứu nâng quy mô sản xuất vắc xin sởi bán thành phẩm VŨ THỊ MAI Ngành Công Nghệ Sinh Học Giảng viên hướng dẫn: TS Nguyễn Thuý Hường Chữ ký GVHD PGS.TS Nguyễn Thị Xuân Sâm Chữ ký GVHD Viện: Viện công nghệ sinh học cơng nghệ thực phẩm HÀ NỘI, 2021 CỘNG HỊA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc lập – Tự – Hạnh phúc BẢN XÁC NHẬN CHỈNH SỬA LUẬN VĂN THẠC SĨ Họ tên tác giả luận văn : Vũ Thị Mai Đề tài luận văn: Nghiên cứu nâng quy mô sản xuất vắc xin sởi bán thành phẩm Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số SV: CA190013 Tác giả, Người hướng dẫn khoa học Hội đồng chấm luận văn xác nhận tác giả sửa chữa, bổ sung luận văn theo Biên họp Hội đồng ngày 26/5/2021 với nội dung sau: 1) Đã bổ sung thông tin công nghệ sản xuất tế bào virus chai nhựa 10 tầng vào phần tổng quan biện luận sâu kết thu 2) Đã sửa lại kết luận luận án phù hợp với mục tiêu đề 3) Đã kiểm tra, trích dẫn tài liệu tham khảo 4) Đã bổ sung thêm thông tin cho phần Vật liệu phương pháp nghiên cứu Ngày Giáo viên hướng dẫn TS Nguyễn Thúy Hường PGS.TS Nguyễn Thị Xuân Sâm CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG PGS.TS Tô Kim Anh tháng năm 2021 Tác giả luận văn Vũ Thị Mai LỜI CAM ĐOAN Tơi xin cam đoan, cơng trình nghiên cứu khoa học nhóm nghiên cứu thuộc Trung tâm Nghiên cứu Sản xuất Vắc xin Sinh phẩm Y tế, hướng dẫn TS Nguyễn Thuý Hường PGS.TS Nguyễn Thị Xuân Sâm Các số liệu, kết luận văn trung thực chưa cơng bố cơng trình khác Học viên Vũ Thị Mai Xác nhận quan (Trung tâm Nghiên cứu, Sản xuất Vắc xin Sinh phẩm Y tế) LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới: PGS.TS Nguyễn Thị Xuân Sâm - Giảng viên Viện công nghệ sinh học công nghệ thực phẩm - Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội TS Nguyễn Thuý Hường – Phó giám đốc Trung tâm Nghiên cứu, Sản xuất Vắc xin Sinh phẩm Y tế trực tiếp giảng dạy hướng dẫn thực đề tài Trong thời gian học tập nghiên cứu vừa qua, nhận giúp đỡ tạo điều kiện thầy cô Viện Công nghệ sinh học Công nghệ thực phẩm thầy cô Phòng Đào tạo - Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội Tôi xin chân thành cảm ơn giúp đỡ quý báu đó Toàn nội dung nghiên cứu khóa luận thực phịng Kiểm định vắc xin, Trung tâm Nghiên cứu, sản xuất vắc xin sinh phẩm y tế (POLYVAC) Tôi xin chân thành cảm ơn giúp đỡ quý báu tập thể cán phòng Kiểm định tạo điều kiện nhiệt tình giúp đỡ tơi thời gian thực đề tài Nhân xin gửi lời cảm ơn chân thành tới Ban lãnh đạo Trung tâm Nghiên cứu, sản xuất vắc xin sinh phẩm y tế (POLYVAC) tạo điều kiện thuận lợi cho suốt thời gian học tập nghiên cứu Cuối xin chân thành cảm ơn bạn bè đồng nghiệp gia đình ln quan tâm giúp đỡ động viên suốt thời gian học tập hồn thành khóa luận Hà Nội, ngày 12 tháng 05 năm 2021 Học viên Vũ Thị Mai MỤC LỤC DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT iii DANH MỤC CÁC HÌNH v DANH MỤC CÁC BẢNG vi ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Dịch tễ học bệnh sởi 1.1.1 Mầm bệnh 1.1.2 Tình hình bệnh Sởi 1.1.3 Nguồn truyền nhiễm 1.1.4 Phương thức lây truyền 1.1.5 Tính cảm nhiễm miễn dịch 1.2 Các biện pháp phòng chống dịch bệnh sởi 1.3 Quá trình phát triển vắc xin sởi 1.3.1 Trên giới 1.3.2 Tại Việt Nam 1.4 Sản xuất vắc xin sởi POLYVAC 1.4.1 Chủng sản xuất 1.4.2 Sản xuất vắc xin sởi chủng AIK-C 1.5 Các yếu tố ảnh hưởng đến phát triển virus sởi 1.6 Tiêu chuẩn chất lượng vắc xin Sởi Bán thành phẩm 11 1.7 Một số giải pháp nâng cao qui mơ sản xuất vắc xin virus nói chung vắc xin sởi nói riêng 13 1.7.1 Thay đổi vật liệu nuôi cấy tế bào 13 1.7.2 Nâng kích cỡ lơ hay nâng tuyến tính số lượng chai ni mà khơng thay đổi quy trình thiết lập 14 1.7.3 Sản xuất chai nhựa nhiều tầng 14 1.7.4 Nuôi tế bào vero hệ thống Bioreactor 15 1.7.5 Nuôi tế bào chai lăn (Roller) 15 1.7.6 Cải tiến phương pháp thu hoạch virus (Gặt): 16 CHƯƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17 2.1 Đối tượng 17 2.2 Nguyên vật liệu, thiết bị, dụng cụ, tài liệu 17 2.2.1 Nguyên vật liệu 17 2.2.2 Máy móc - Thiết bị 18 2.2.3 Dụng cụ 19 2.3 Thiết kế quy trình ni cấy virus sởi 19 2.3.1 Các quy trình sản xuất vắc xin bán thành phẩm dùng thử nghiệm 20 2.3.2 Các công đoạn sản xuất virus sởi 21 2.3.3 Đánh giá kết nghiên cứu 22 2.3.4 Đánh giá hiệu sản xuất 22 2.4 Phương pháp nghiên cứu 23 2.4.1 Xác định một số thông số sản xuất vắc xin bán thành phẩm chai nhựa 23 2.4.2 Xây dựng quy trình sản xuất vắc xin sởi bán thành phẩm chai nhựa 10 tầng 25 2.5 Các phương pháp phân tích 26 2.5.1 Chuẩn độ hiệu giá: Chuẩn độ hiệu giá virus sởi sống giảm độc lực phương pháp PFU (Phụ lục 3) 26 2.5.2 Xác định số phát triển tế bào (CGI) 26 2.5.3 Kiểm tra vô trùng phương pháp màng lọc 27 2.5.4 Kiểm tra Mycopalasma phương pháp nuôi cấy 27 2.5.5 Thử nghiệm BSA tồn dư 28 2.5.6 Thử nghiệm đo pH 28 2.6 Xử lý số liệu 28 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 29 3.1Xác định số thông số sản xuất vắc xin sởi bán thành phẩm chai nhựa 29 3.1.1 Đánh giá bám dính phát triển tế bào CEC nuôi chai nhựa 29 3.1.2 Đánh giá hiệu giá virus chai thử nghiệm 34 3.2 Xây dựng quy trình sản xuất vắc xin sởi bán thành phẩm chai nhựa 10 tầng 38 3.2.1 Khảo sát một số thông số nuôi cấy virus chai nhựa 10 tầng 38 3.2.2 Đề xuất quy trình cải tiến ni cấy virus chai nhựa 10 tầng 40 3.2.3 Đánh giá hiệu quy trình cải tiến ni chai nhựa 10 tầng41 3.3 Đánh giá chất lượng vắc xin sởi bán thành phẩm 42 KẾT LUẬN 44 TÀI LIỆU THAM KHẢO 47 PHỤ LỤC 51 ii DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Tên đầy đủ Tên phiên dịch AIK-C America-Iran-Kitasato Chick Embryo Cell America-Iran-Kitasato Chick Embryo Cell ARN Axit ribonucleic Axit ribonucleic CAM Chick chorioallantoic membrane Màng đệm túi niệu gà CGI Cell Growth Index Chỉ số phát triển tế bào CE Chick Embryo intra-amniotic cavity Màng ối phôi gà CEF Chick Embryo Fibroblast Tế bào sợi phôi gà DK Dog Kidney Thận chó EK Erythromycine kanamycine Kháng sinh Erythromycine kanamycine EL Erythromycine kanamycine Lactose Kháng sinh ErythromycineKanamycine và đường lactose GMP Good Manufacturing Practice Thực hành sản xuất tốt GPK Guinea Pig Kidney Thận chuột lang HA Human Amnion Màng ối người HI Haemagglutination Inhibition Phản ứng ức chế ngưng kết hồng cầu HK Human Kidney Thận người IgA Imunoglobulin A Kháng thể IgA IgG Imunoglobulin G Kháng thể IgG IgM Imunoglobulin M Kháng thể IgM WHO World Health Organization Tổ chức Y tế Thế giới KDSV Kitasato Daiichi Sankyo Vaccine Công ty vắc xin Daiichi Sankyo M199/PR (+) Medium 199 (+) Mơi trường M199 có đỏ phenol M199/PR (-) Medium 199 (-) Mơi trường M199 khơng có đỏ phenol MMR Measles, Mumps, Rubella Sởi, Quai bị Rubella MOI Multiplicity Of Infection Liều gây nhiễm MR Measles-Rubella Sởi – rubella iii Chữ viết tắt MS Tên đầy đủ Master Seed Tên phiên dịch Chủng giống gốc Tên thương mại vắc xin sởi MVVAC NBCS Newborn calf serum Huyết bê sinh POLYVAC Center for Research and Production of Vaccines and Biologicals Trung tâm nghiên cứu, sản xuất vắc xin Sinh phẩm Y tế RbBM Rubella bulk material Vắc xin bán thành phẩm sau lọc SCD Soybean Casein Digest Môi trường Casein đậu tương SPF Specific Pathogen Free Không chứa tác nhân gây bệnh TCMR Tiêm chủng mở rộng TGC Thioglycholate Môi trường nuôi cấy vi khuẩn WS Working Seed Chủng sản xuất iv DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 Hình thái và cấu trúc virus sởi [4] Hình 1.2 Lịch sử chủng sử dụng sản xuất vắc xin sởi [41] Hình 1.3 Ảnh hưởng pH lên hiệu giá virus sởi chủng Edmonston 10 Hình 1.4 Hiệu giá virus sởi giá trị pH khác 11 Hình 2.1 Thiết kế nghiên cứu quy trình sản xuất vắc xin Sởi bán thành phẩm 20 Hình 2.2 Kết Mycoplasma phương pháp màng lọc 28 Hình 3.1.Hình ảnh tế bào quan sát thời điểm sản xuất 33 Hình 3.2 Biểu đồ hiệu giá nhóm qui trình thử nghiệm 37 Hình 3.3 Biểu đồ hiệu giá thử nghiệm chai nhựa 10 tầng với thể tích mơi trường trì 39 Hình 3.4 Quy trình sản xuất vắc xin sởi bán thành phẩm chai nhựa 10 tầng 40 Hình 3.5 Nuôi tế bào chai nhựa 10 tầng nuôi chai Roux 42 v 26 Peter M Strebel, Mark J Papania, Paul A Gastañaduy, and James L Goodson (2017), "Measles Vaccines", Plotkin's Vaccines, 7th edition, Elsevier, Philadelphia, USA, pp.579-618 27 Hitoshi Murakami et al (2008), "Epidemiological impatc of a nationwide measles immunization campaign in Vietnam: a crtical review", Bulletin of the World Health Organization, 86 (12), pp.948-954 28 Paul E.M Fine, Kim Mulholland et al (2017), "Community Protection", Plotkin's Vaccines, 7th edition, Elsevier, Philadelphia, USA, pp.1512-1531 29 Guerra FM, Bolotin, Lim G et al (2017), "The basic reproduction number (R0) of measles: a systematic review", Lancet Infect Dis, 17(12), pp.420-428 30 WHO (2009), "The immunological basis for immunization series: module 7measles", The immunological basis for immunization series - Update 2009, WHO, Geneva, pp.1-43 31 Audet S., Virata-Theimer M.L., Beeler J.A et al (2006), "Measles-virusneutralizing antibodies in intravenous immunoglobulins", JID, 194(6), pp.781– 789 32 William J Moss (2007), "Measles still has a devastating impact in unvaccinated populations", PLoS Med, 4(1), pp.24 33 Satoshi Makino (1983), "Development and Characteristics of Live AIK-C Measles Virus Vaccine: A Brief Report", Reviews of infectious diseases, 5(3), pp.504-505 34 Shigeharu Ueda (2009), "Development of measles vaccines in Japan", Vaccine, 27, pp.3230-3231 35 Tetsuo Nakayama, Akihito Sawada, Yoshiaki Yamaji, Takashi Ito (2016), "Recombinant measles AIK-C vaccine strain expressing heterologous virus antigens", Vaccine, 34(2), pp.292-295 36 Nakayama T, Komase K, Uzuka R et al (2001), "Leucine at position 278 of the AIK-C measles virus vaccine strain fusion protein is responsible for reduced syncytium formation", The Journal of general virology, 82(9), pp.2143-2150 37 Katsuhiro Komase, Tetsuo Nakayama, Masumi Iijima et al (2006), "The phosphoprotein of attenuated measles AIK-C vaccine strain contributes to its temperature-sensitive phenotype", Vaccine, 24, pp.826–834 49 38 Black Fl (1959), “Growth and stability of measles virus” Virology ;7(2):184– 192 39 Markino S, Sasaki K, Nakamura N et al (1974), “Studies on modification of the live AIK measles vaccine”, Kitasato Arch Exp Med, Volume 47, pp: 13-21 40 Tsai HY, Huang LM, Shih YT et al (1999), “Immunogenicity and safety of standard-titer AIK measles vaccine in nine-month -old infants”, Viaral Immunol, Volume 12, pp: 343-348 41 Weiss K, Salzig D, Muhlebach MD, Cichutek K, Portner R and Czermak P (2012) Key parameters of Measles virus production for oncolytic virotherapy American Journal of Biochemistry and Biotechnology; 8(2): 81 – 98 42 Freshney R I., John Wiley & Sons Inc (1993): Culture of animal cells , New York A manual of basic techniques, 3rd Edition 43 Samia Rourou, Arno van der Ark, Tiny van der Velden, Hela Kallel (2007) “A microcarrier cell culture process for propagating rabies virus in Vero cells grown in a stirred bioreactor under fully animal component free conditions”, Vaccine, 25, pp: 3879–3889 44 Ahmad Fayaz, Alireza Zavarei*, Nader Howaizi, and Nasser Eslami (October 1997) “Production of Rabies Vaccine Using BHK-21 with Roller Bottle Cell Culture Technique” Iranian Biomedical Journal; (1): 35-38 45 WHO Technical Report Series (1994) Requirements for Measles, Mumps and Rubella Vaccines and Combined Vaccine (Live) Adopted 1992, TRS 840, Annex3 46 Catalog: Corning cellstack culture chambers 50 PHỤ LỤC Phụ lục Mô tả chi tiết công đoạn và qui trình sản xuất vắc xin sởi bán thành phẩm Qui trình M1: Nhận trứng và ấp trứng Nhập trứng gà SPF từ nhà cung cấp Thời gian vận chuyển vòng ngày Tiêu chuẩn mong muốn là với số lượng 420 - 450 trứng tỷ lệ trứng hỏng phải 10%, và tỷ lệ trứng khơng có phơi là 15% Số trứng sau nhận bảo quản sơ thời gian không ngày nhiệt độ 12-160C Ấp trứng nhiệt độ 37,7±10C và độ ẩm 50-70% thời gian ngày Trong thời gian ấp trứng đảo trứng lần Qui trình M2: Ni cấy tế bào phôi gà Sau ấp, ngâm trứng vào dung dịch Benzalkonium chloride 0,1% thời gian 3-5 phút, sau lau khăn tẩm dung dịch sát trùng Iodine 3% Ethanol và sát trùng thêm lần khăn lau tẩm dung dịch sát trùng cồn Ethanol 70% Thực thao tác vô trùng cắt vỏ trứng vùng túi khí và lấy phôi Cắt bỏ phần đầu phôi gà, sau hộn phơi bình thường với và cho vào bình hình trụ trịn Số lượng phơi gà tập hợp vào bình hình trụ khoảng 160200 phơi/bình × bình, với bình thực bước sau: - Sau tập hợp khoảng 160-200 phơi/bình, cho thêm 500 ml dung dịch rửa phôi, lắc nhẹ bình sau để lắng hút loại bỏ dung dịch rửa Thực thao tác lần Sau dùng lọc để giữ lại phơi rửa, loại bỏ dung dịch rửa Cho phôi rửa vào xi lanh nghiền, nghiền phơi thành mảnh có diện tích khoảng 5mm2 Cho phơi nghiền nhỏ vào bình trypsin hố tích 1L Cho thêm 500ml dung dịch enzyme tách tế bào, và phôi bão hoà dung dịch tách tế bào, khuấy lần thời gian phút nhiệt độ 37±10C mô phôi tạo thành dịch treo Để tiếp phút cho phôi bão hoà dung dịch tách tế bào và tổng thời gian là 10 phút - Lần trypsin hóa thứ 1: thực khuấy bình tryppsin hóa để tách tế bào phơi thời gian phút, tốc độ khuấy 200-300 vòng/ phút với nam châm có kích thước 13-15mm x 50mm Để lắng mảnh mơ xuống đáy bình thời gian phút, sau đó, nhẹ nhàng giữ lại phần cặn mơ thu lấy phần nước qua lưới lọc có kích thước 100 m vào chai 10 L có chứa L mơi trường LH và giữ hỗn dịch tế bào nhiệt độ 5-100C phiến đá Ice pack 51 - Lần trypsin hóa thứ 2: Cho thêm 500 ml dung dịch enzyme tách tế bào vào cặn mơ phơi cịn lại, và tiến hành khuấy tách tế bào thời gian phút, tốc độ khuấy 200- 300 vòng/ phút với nam châm có kích thước 13-15mm x 50mm Để lắng mảnh mơ xuống đáy bình thời gian phút, sau nhẹ nhàng giữ lại phần cặn mơ thu lấy phần nước qua lưới lọc có kích thước 100 m vào chai 10L và giữ nhiệt độ 5-100C - Lần trypsin hóa thứ 3: Cho thêm 400mL dung dịch enzyme tách tế bào vào cặn mơ phơi cịn lại, và tiến hành khuấy tách tế bào thời gian phút, tốc độ khuấy 200- 300 vịng/phút với nam châm có kích thước 13-15mm x 50mm Để lắng mảnh mơ xuống đáy bình thời gian phút, sau nhẹ nhàng giữ lại phần cặn mô thu lấy phần nước qua lới lọc có kích thước 100 m vào chai 10L giữ nhiệt độ 5-100C - Từ lần trypsin hóa thứ đến lần thứ 6: Cho thêm 300mL dung dịch enzyme tách tế bào vào cặn mơ phơi cịn lại, tiến hành khuấy tách tế bào tương tự lần trước và lượng hỗn dịch thu khoảng 2,9-3,3 L - Kiểm tra mắt thường qui trình tách tế bào cách xác nhận lượng hỗn dịch tế bào thu từ -6 lần khuấy có mầu đục chứng tỏ tế bào tách khỏi nhu mơ và cặn cịn lại bình là phần xương - Sau khuấy, chia hỗn dịch tế bào thành lượng khoảng 400  500 gam vào chai ly tâm 500 mL, ly tâm thời gian 5-7 phút nhiệt độ 100C và lực ly tâm (RCF) là 186 gravity Loại bỏ nước Giữ lại cặn tế bào và đánh tan cặn tế bào 4,5L môi trường bảo quản tế bào - Thực tương tự với bình trụ chứa 160 – 200 phơi cịn lại Lượng cặn tế bào thu sau ly tâm tiếp tục thu hồi vào 4,5L môi trường bảo quản tế bào, khuấy tạo hỗn dịch đồng Pha loãng hỗn dịch tế bào mơi trường ni cấy tế bào (LH) để có nồng độ cuối là 20-30 × 104 tế bào/ mL Cho 39L hỗn dịch tế bào pha loãng đến nồng độ cuối vào chai 50L × 2chai, khuấy từ phút, tốc độ 250-350 vòng/ phút với nam châm có kích thước 13mm × 75mm Chia lượng 170 mL hỗn dịch tế bào vào khoảng 430 chai Roux ni cấy tế bào có kích thước 225cm2 Nuôi chai roux tế bào thời gian ngày trạng thái tĩnh buồng ẩm, nhiệt độ 37,5±10C Điều quan trọng là chai nuôi tế bào phải giữ yên tạo điều kiện tốt cho tế bào bám vào mặt chai Qui trình M3: Gây nhiễm và nuôi cấy virus Chủng virus dùng sản xuất khơng cấy chuyển q lần có nồng độ ≥ 5,2 lg PFU/ 0,5 mL giải đông nước cất pha tiêm nhiệt độ < 290C 52 Dùng chai 20L chứa 8,5L dung dịch pha loãng virus để điều chỉnh nồng độ virus đến nồng độ gây nhiễm thích hợp (MOI) là 0,003; sau đó, khuấy tiếp phút, tốc độ 50-100 vòng/ phút với nam châm có kích thước 13 x 75mm đến chủng virus pha thành hỗn dịch đồng Theo yêu cầu kiểm tra, chai nuôi tế bào qui trình M2 phải có mức độ bám bề mặt chai là ≥ 50% Sau kiểm tra tế bào, loại bỏ nước nuôi tế bào Gây nhiễm 20mL dung dịch virus pha loãng vào chai tế bào, để hấp phụ virus thời gian 12,5 nhiệt độ 32±10C Cứ 20 phút láng nhẹ chai tế bào gây nhiễm lần để tránh cho bề mặt tế bào bị khô Sau hấp phụ, cho thêm 150 mL môi trường M199(+) vào chai nuôi cấy và nuôi trạng thái tĩnh thời gian ngày điều kiện nhiệt độ ổn định là 32±10C Tránh di chuyển chai nuôi cấy giai đoạn này (ảnh hưởng đến độ bám tế bào) Theo yêu cầu kiểm tra, chai nuôi cấy phải không bị nhiễm vi khuẩn hay nấm gây nhiễm và ni cấy virus Qui trình M4: Thay môi trường và nuôi cấy Quan sát tế bào gây nhiễm chủng virus chai nuôi cấy Sau quan sát, loại bỏ môi trường M199(+) Cho thêm 170 mL môi trường M199(+) vào chai nuôi cấy và nuôi trạng thái tĩnh thời gian ngày điều kiện nhiệt độ ổn định là 32±10C Qui trình M5: Rửa tế bào gây nhiễm và nuôi cấy Tiến hành quan sát chai nuôi cấy Theo yêu cầu kiểm tra, chai nuôi cấy phải có số bám tế bào bề mặt chai là ≥ 50% Sau quan sát, loại bỏ môi trường M199(+) Cho thêm 100 mL dung dịch rửa tế bào vào chai nuôi cấy qua kiểm tra, rửa bề mặt tế bào, sau hút bỏ môi trường rửa Làm tổng cộng lần để rửa tế bào Cho thêm 190 mL môi trường trì M199(-) vào chai ni cấy rửa, và nuôi cấy trạng thái tĩnh thời gian 3-4 ngày điều kiện nhiệt độ 32±10C Theo yêu cầu kiểm tra, chai nuôi cấy phải không bị nhiễm vi khuẩn hay nấm sau rửa và ni cấy Qui trình M6: Gặt và Bảo quản hỗn dịch virus Kiểm tra kính hiển vi xác nhận tế bào chai nuôi cấy bị huỷ hoại (CPE >50%) và tổng số chai gặt đạt >90%, sau kiểm tra mắt thường đèn huỳnh quang để đảm bảo loại bỏ chai không bị nhiễm khuẩn, khơng vẩn đục, hay có vết rạn nứt, kiểm tra xem nút chai có bị lỏng Sau cất nhiệt độ 5±30C thời gian < 32 53 Qui trình M7: Hộn hỗn dịch virus Tạo hỗn dịch virus từ chai nuôi cấy qua kiểm tra từ giai đoạn trước Sau hộn khoảng 80L, cho thêm 40L chất ổn định đặc lần, bật cánh khuấy tank chứa với tốc độ 108 ÷ 135 vịng/phút suốt thời gian bổ sung chất ổn định Lượng virus hộn lại khoảng 80L, sau cho thêm chất bảo quản, tổng thể tích hỗn dịch virus khoảng 120L Qui trình M8: Lọc hỗn dịch virus Trước lọc, làm ướt hệ thống lọc 3L môi trường rửa lọc áp lực 0,0130,025 MPa, cho 0,5L hỗn dịch virus có chất bảo quản chạy qua hệ thống lọc Lượng hỗn dich virus lại lọc qua màng lọc PVDF dài 10 inch, cỡ lọc 0,65 m với áp lực 0,013-0,025 MPa So sánh hiệu giá virus trước và sau lọc: Tiêu chuẩn mong muốn là hiệu giá virus giảm ≤ 0,5 lg PFU/ 0,5 mL Qui trình M9: Bảo quản bán thành phẩm Tỷ trọng hỗn dịch virus sau lọc là 1,033 g/ml Chia hỗn dịch virus khoảng 8,0L vào tank thép khơng rỉ có dung tích 11L, làm đông hỗn dịch virus đá khô và Methanol 1-2 giờ, sau bảo quản tủ ≤ -650C Thời hạn bảo quản là năm (tham khảo số liệu Viện Kitasato (nay là KDSV)-Nhật Bản) và số liệu thẩm định POLYVAC 54 Phụ lục Môi trường dùng sản xuất bán thành phẩm Môi trường Lactalbumin Hydrolysate (LH) Áp dụng Nuôi cấy tế bào Thể tích : 1L Thành phần: Sodium chloride (NaCl) 8,00g Potassium chloride (KCl) 0,40g Disodium hydrogen phosphate dodecahydrate (Na2HPO4.12H2O) Thành phần Số lượng 0,12g Monopotassium dihydrogen monophosphate (KH2PO4) 0,06g Magnesium sulfate septahydrate (MgSO4.7H2O) 0,10g Magnesium chloride hexahydrate (MgCl2.6H2O) 0,10g Calcium chloride anhydrous (CaCl2) 0,14g Glucose 1,00g Lactalbumin Hydrolysate 5,00g 0.1% đỏ phenol Nước WFI 10,00 ml Vừa đủ Tổng thể tích - 1L Dung dịch Hanks (khơng có Calcium hay Magnesium) (CMF-Hanks) Áp dụng Rửa mô trước tách tế bào Thể tích: 1L Thành phần: Thành phần Số lượng Sodium chloride(NaCl) 8,00 g Potassium chloride (KCl) 0,40 g Disodium hydrogen phosphate dodecahydrate (Na2HPO4.12H2O) 0,12g Monopotassium dihydrogen monophosphate(KH2PO4) 0,06g Glucose 1,00g 0.1% phenol red Nước WFI Tổng thể tích 10,00mL Vừa đủ 1L 55 - Dung dịch 7.5% Sodium bicarbonate (NaHCO3) Áp dụng Điều chỉnh pH môi trường nuôi cấy Thể tích: 1L Các chất Thành phần Sodium bicarbonate 75.00 g Nước WFI Vừa đủ Tổng thể tích - Số lượng 1L Dung dịch 2.5% Trypsin Áp dụng Thành phần Tách mơ Thể tích: 1L Thành phần: Sodium chloride(NaCl) Potassium chloride(KCl) Disodium hydrogen phosphate dodecahydrate (Na2HPO4.12H2O) Monopotassium dihydrogen monophosphate(KH2PO4) Glucose 0.1％ phenol red Trypsin (1: 250) Nước WFI Tổng thể tích Số lượng 8,00 g 0,40 g 0,12g 0,06g 10,00 g 10,00 mL 25,00 g Vừa đủ 1L - Kháng sinh: Erythronium & kanamycin (EK) Áp dụng Ngăn cản vi khuẩn nhiễm vào mơi trường ni cấy Thể tích: L Thành phần: Số lượng Erythromycin 50,00g Potency Kanamycin sulfate 50,00g Potency Sodium chloride(NaCl) 24,00 g Potassium chloride(KCl) 0,60 g Thành phần Disodium hydrogen phosphate dodecahydrate 8,70 g (Na2HPO4.12H2O) Monopotassium dihydrogen 0,60 g monophosphate(KH2PO4) Nước WFI Vừa đủ Tổng thể tích L 56 - Mơi trường M199/PR(+) ( M199 có đỏ phenol đệm Earle’s ) Áp dụng Nuôi cấy tế bào Thể tích: 1L Thành phần Thành phần: Số lượng M199/PR(+) 9,55 g Nước WFI Vừa đủ Tổng thể tích - 1L Mơi trường M199/PR(-) ( M199 khơng có đỏ phenol đệm Earle) Áp dụng Nuôi cấy tế bào Thể tích: 1L Thành phần Thành phần: Số lượng M199/PR(-) 9,53g Nước WFI Vừa đủ Tổng thể tích - 1L Dung dịch Hanks (khơng có đỏ phenol) Hanks/PR(-) Áp dụng Rửa tế bào Thể tích: 1L Thành phần: Số lượng Sodium chloride(NaCl) 8,00 g Potassium chloride(KCl) 0,40g Disodium hydrogen phosphate dodecahydrate(Na2HPO4.12H2O) 0,12 g Monopotassium dihydrogen Thành phần monophosphate(KH2PO4) 0,06 g Magnesium sulfate septahydrate (MgSO4.7H2O) 0,10g Magnesium chloride hexahydrate (MgCl2.6H2O) 0,10g Calcium chloride anhydrous (CaCl2) 0,14g Glucose 1,00 g Nước WFI Vừa đủ 57 Phụ lục Chuẩn độ hiệu giá virus sởi sống giảm độc lực phương pháp PFU Pha chế môi trường trước sử dụng: Mơi trường phủ thạch lần : Hộn MEM 2× (1) {khơng có đỏ trung tính} với Agarose 1% (2) theo tỷ lệ 1:1 Môi trường phủ thạch lần : Hộn MEM 2× (1) {có đỏ trung tính} với Agarose 1% (2) theo tỷ lệ 1:1 (1) Chuẩn bị MEM 2 - Pha MEM 3× : 28,2 g Eagle MEM vừa đủ 1000 mL WFI→chia chai 66,7 mL/chai, sấy tiệt trùng 1210C / 15 phút Để nguội - Sử dụng FBS bất hoạt để pha MEM 2× - Sử dụng nước WFI-U sấy tiệt trùng 1210C / 30 phút để pha MEM 2× (2) Chuẩn bị Agarose 1% - Cân 1g Agarose, cho vừa đủ 100 mL WFI → sấy tiệt trùng 1210C / 15 phút - Agarose 1% pha sử dụng ngày Thành phần hố chất pha mơi trường phủ thạch mô tả chi tiết theo bảng : * Thành phần môi trường phủ thạch lần (khơng đỏ trung tính) Thành phần MEM 3× Số lượng 66,7 ml FBS 7,5% NaHCO3 4,0 ml 4,0 ml Glutamin 200mM 2,0 ml P-S 1,0 ml WFI-U 22,3 ml Agarose (ME) WFI-U 1g 100 ml Tổng cộng 200 ml (1) Sau pha xong, trước hộn với (2), ngâm bể điều nhiệt 10 phút nhiệt độ 44 ~ 480C (2) Sau sấy tiệt trùng, lấy khỏi lò sấy bảo quản nhiệt độ 44 ~ 480C (sử dụng bể điều nhiệt) hộn 58 * Thành phần môi trường phủ thạch lần (có đỏ trung tính) Thành phần MEM 3× Số lượng 66,7 ml FBS 7,5% NaHCO3 4,0 ml 4,0 ml Glutamin 200mM 2,0 ml P-S Đỏ trung tính 0,2% 1,0 ml 10 ml WFI (1) Sau pha xong, trước hộn với (2), ngâm bể điều nhiệt 10 phút nhiệt độ 44 ~ 480C 12,3 ml Agarose (ME) WFI 1g 100 ml Tổng cộng 200 ml (2) Sau sấy tiệt trùng, lấy khỏi lò sấy bảo quản nhiệt độ 44 ~ 480C (sử dụng bể điều nhiệt) hộn * Tế bào sử dụng Tế bào Vero sử dụng để tiến hành chuẩn độ virut vắc xin sởi tương ứng Mỗi mẫu từ 3-5 phiến, mẫu chuẩn phiến Tế bào nuôi phiến giếng với nồng độ 20×104 tế bào / ml × ml / giếng Ni 37 ± 20C, 5%CO2 vòng 3~ ngày, tế bào kín lớp dùng để chuẩn độ phương pháp PFU Tế bào Vero Quy trình chuẩn độ hiệu giá Bước : Chuẩn bị mẫu mẫu chuẩn (1) Chuẩn bị hộp xốp để mẫu có sẵn đá vụn (2) Lấy mẫu mẫu chuẩn từ tủ bảo quản đặt vào hộp xốp đựng mẫu chuẩn bị (1) (3) Vận chuyển hộp chứa mẫu đến nơi thực thử nghiệm Mẫu làm tan trước pha loãng bể điều nhiệt nhiệt độ 20-250C Khi mẫu tan hết đưa mẫu trở lại bảo quản hộp xốp có đá tránh để đông mẫu trở lại Thời gian bảo quản lạnh vòng 120 phút 59 Chú ý : Cho đá vụn vào hộp xốp trước cắm ống mẫu lên trên, tránh đổ đá vụn lên mẫu Bước 2: Kiểm tra tế bào vero: Lấy khay tế bào (phiến giếng) từ tủ 37± 20C, 5%CO2 ra, kiểm tra tình trạng tế bào mắt thường xem dịch ni có đục khơng, tế bào có bị bong khơng, sau dùng kính hiển vi để quan sát hình dạng tế bào có bất thường khơng, có bị biến tính khơng có phủ kín khơng Bước : Ra mơi trường, pha lỗng mẫu, gây nhiễm nuôi Bước này thực điều kiện vô trùng, Clean bench (1) Căn vào số mẫu số nồng độ pha loãng xếp đủ số lượng tuýp theo thứ tự giá cắm tuýp - Hút 1,8 mL MEM 5%FBS cho tuýp pha loãng bậc 10 (1 lg) ; - Hút 1,1 mL MEM 5%FBS cho tuýp pha loãng bậc (0,5 lg) - Đối với mẫu vắc xin sởi bán thành phẩm cuối (trước Filling) - MFB phải tiến hành pha loãng 2,5 lần (0,5mL MFB + 0,75 mL MEM 5%FBS) trước pha loãng bậc 10 bậc (2) Pha loãng mẫu bậc 10: cho 0,2 mL mẫu vào tuýp có sẵn 1,8 mL MEM5%FBS → trộn đều, mẫu pha loãng 10-1 tuýp Chuyển 0,2 mL mẫu nồng độ 10-1 vào tuýp chứa 1,8 mL MEM5%FBS → trộn đều, mẫu pha loãng 10-2 Tiếp tục làm đến hết nồng độ cần pha loãng Pha loãng mẫu bậc : cho 0,5 mL mẫu pha loãng 10-1 sang tuýp chứa 1,1 mL MEM5%FBS → trộn đều, mẫu pha loãng 10-1,5 Pha loãng 10-2,5 từ tuýp pha loãng 10-2 Tiếp tục hết nồng độ pha loãng (3) Loại bỏ nước ni tế bào có phiến Úp ngược phiến lên khăn không sinh bụi thấm cồn chuẩn bị sẵn bàn để thấm hết mơi trường cịn sót lại giếng tế bào Dán nhãn phía bên phải phiến với thông tin: tên mẫu, số mẫu (4) nồng độ pha loãng cuối gây nhiễm, gây nhiễm 0,1 mL / giếng × giếng / nồng độ Gây nhiễm từ phải sang trái tương ứng với nồng độ pha loãng cao đến nồng độ pha lỗng thấp Ví dụ: 10-2 10-2,5 10-3,0 60 Thực tương tự từ (2) – (4) với mẫu mẫu chuẩn lại hết (5) Sau gây nhiễm láng phiến sang trái, phải để lượng mẫu gây nhiễm phủ kín bề mặt tế bào, xếp phiến vào khay hấp phụ điều kiện 37 ± 20C, 5%CO2 60 phút (6) Kết thúc thời gian hấp phụ, lấy khay tế bào đặt vào Clean bench, lấy MEM 2× Agarose 1% chuẩn bị sẵn từ bể điều nhiệt Đổ chai MEM 2× vào chai Agarose (tỷ lệ 1:1) lắc Dùng pipet thuỷ tinh vô trùng 10 ml để phủ thạch, phủ ml / giếng Phủ xong phiến lắc xoay trịn nhẹ để mơi trường gây nhiễm và môi trường phủ thạch hoà vào (7) Để nguyên toàn số phiến vừa phủ thạch chỗ đơng hoàn tồn (20 ~ 30 phút), nuôi điều kiện 37 ± 20C, 5%CO2 ngày (8) Sau nuôi cấy ngày 37 ± 20C 5%CO2 tiến hành phủ thạch lần có đỏ trung tính, ml/giếng Tiếp tục ni ngày 37 ± 20C, 5%CO2 Bước : Đọc kết Đọc kết hàng ngày Tính kết vào ngày đọc cuối (1) Đếm số PFU (Plaque Forming Unit): số điểm mầu trắng mầu đỏ hình (2) Tính kết Các đám tế bào hủy hoại khơng bắt màu đỏ trung tính * Điều kiện tính kết : 1- Nồng độ gây nhiễm có số đếm PFU khoảng  10 và ≤ 100 PFU giếng gây nhiễm 2- Cùng nồng độ gây nhiễm có số đếm PFU chênh < 3,16 lần (tương ứng 0,5 lgPFU/ 0,5mL) 3- Một mẫu có 2/3 số nồng độ gây nhiễm thoả mãn điều kiện 2.1 2.2 4- Có 3/5 lọ mẫu loại mẫu thoả mãn điều kiện 2.1 ; 2.2 ; 2.3 61 Sử dụng quy tắc làm trịn số tốn học sau :4,45 ~ 4,49 → 4,5 4,41 ~ 4,44 → 4,4 * Cách tính kết : - Tính hiệu giá nồng độ pha lỗng, tính giá trị trung bình nồng độ pha lỗng → hiệu giá trung bình phiến cho mẫu - Tính giá trị trung bình tất phiến cho mẫu → giá trị trung bình mẫu → chuyển đổi đơn vị tính hiệu giá : lgPFU/ 0,5 mL Cụ thể : - Tính giá trị trung bình số đếm đám PFU giếng nồng độ gây - nhiễm (M) Tính hiệu giá nồng độ gây nhiễm = lgM + giá trị nồng độ gây nhiễm tương ứng + 0,7 (0,7 chuyển đổi đơn vị tính cho liều (0,5ml), nghĩa là chuyển đổi thể tích gây nhiễm giếng (0,1 mL) → liều (0,5mL)) - Tính hiệu giá phiến = trung bình hiệu giá nồng độ gây nhiễm cho phiến - Tính hiệu giá mẫu : trung bình hiệu giá phiến mẫu Ví dụ : xem cách tính hiệu giá phiến 10-2 10-2,5 10-3 Tại nồng độ gây nhiễm 10-2 M = (55 + 52) /2 = 53,5 Hiệu giá = lg 53,5+ + 0,7=1,73 + + 0,7 = 4,43 (1) Tại nồng độ gây nhiễm 10-2,5 M = (26 + 21)/2 = 23,5 Hiệu giá = lg23,5 + 2.5 + 0,7= 1,37 + 2,5 + 0,7 = 4,57 (2) Tại nồng độ gây nhiễm 10-3, số PFU không thỏa mãn điều kiện 2.1 >10, khơng tính Tính hiệu giá mẫu Hiệu giá mẫu = {(1) + (2)} / = (4,43 + 4,57) /2 = 4,5 PFU / 0,5 mL - Cuối cùng, lấy giá trị trung bình phiến lấy giá trị làm tròn chữ số thập phân thứ làm kết Tương tự để tính tốn với mẫu chuẩn nội bộ, lấy giá trị trung bình phiến lấy giá trị làm tròn chữ số thập phân thứ làm kết 62 Đánh giá kết * Mẫu thử đạt tiêu chuẩn (Theo tiêu chuẩn WHO, TRS840 annex 3) 1) Mẫu vắc xin Sởi bán thành phẩm :  5,6 lg PFU / 0,5 mL 2) Mẫu vắc xin sởi bán thành phẩm cuối cùng: 4,8-5,2 lg PFU/0,5 ml 3) Mẫu vắc xin Sởi thành phẩm :  3,0 lg PFU/ 0,5 mL Kết thử nghiệm đánh giá : - Hiệu giá mẫu chuẩn quốc gia đạt tiêu chuẩn : MCQG.SOI.01 : 4,47 ± 0,27 lg PFU / 0,5 mL - Chênh lệch hiệu giá phiến mẫu lần thử nghiệm ≤ 0,5 lg PFU / 0,5 mL 63 ... trình sản xuất vắc xin Sởi bán thành phẩm để xác định thông số tối ưu nuôi chai nhựa sau: 19 2.3.1 Các quy trình sản xuất vắc xin bán thành phẩm dùng thử nghiệm Hình 2.1 Thiết kế nghiên cứu quy. .. POLYVAC là đơn vị đầu tiên, sản xuất vắc xin sởi Việt Nam [19], [20], [30], [31], [32] 1.4 Sản xuất vắc xin sởi POLYVAC 1.4.1 Chủng sản xuất Vắc xin sởi POLYVAC sản xuất từ chủng AIK-C Năm 1974,... Đánh giá hiệu sản xuất Đánh giá hiệu sản xuất hiệu giá, thể tích vắc xin bán thành phẩm số liều thu 22 2.4 Phương pháp nghiên cứu 2.4.1 Xác định số thông số sản xuất vắc xin bán thành phẩm chai