Nghiên cứu cải tiến quy trình sản xuất vắc xin sởi bán thành phẩm rubella tại việt nam

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI LUẬN VĂN THẠC SĨ Nghiên cứu cải tiến quy trình sản xuất vắc xin bán thành phẩm Rubella Việt Nam NGUYỄN THỊ NGUYỆT Ngành Công Nghệ Sinh Học Giảng viên hướng dẫn: Viện: PGS TS Nguyễn Thị Xuân Sâm TS Nguyễn Thuý Hường Viện công nghệ sinh học công nghệ thực phẩm HÀ NỘI, 2021 TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI LUẬN VĂN THẠC SĨ Nghiên cứu cải tiến quy trình sản xuất vắc xin bán thành phẩm Rubella Việt Nam NGUYỄN THỊ NGUYỆT Ngành Công Nghệ Sinh Học Giảng viên hướng dẫn: PGS.TS Nguyễn Thị Xuân Sâm Chữ ký GVHD TS Nguyễn Thuý Hường Chữ ký GVHD Viện: Viện công nghệ sinh học công nghệ thực phẩm HÀ NỘI, 2021 CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc lập – Tự – Hạnh phúc BẢN XÁC NHẬN CHỈNH SỬA LUẬN VĂN THẠC SĨ Tác giả luận văn: Nguyễn Thị Nguyệt Tên đề tài: Nghiên cứu cải tiến quy trình sản xuất vắc xin bán thành phẩm rubella việt nam Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số SV: CA190011 Tác giả, Người hướng dẫn Hội đồng chấm luận văn xác nhận tác giả sửa chữa, bổ sung luận văn theo Biên họp Hội đồng ngày 26/05/2021 với nội dung sau: - Phần Tổng quan tài liệu: chỉnh sửa số lỗi tả bổ sung chữ viết tắt CPE vào Danh mục chữ viết tắt - Phần Vật liệu phương pháp nghiên cứu: bổ sung mẫu chuẩn, nguồn gốc hóa chất vào mục 2.1.1 2.1.2 mô tả chi tiết thực nghiệm mục 2.2.1.2 - Phần Kết bình luận: chuyển đoạn “để đảm bảo ……thừa loại bỏ’’ từ mục 3.1.1 sang mục 2.2.1.1 Đã bổ sung thêm lập luận, giải thích cho việc lựa chọn kết phù hợp (mục 3.1.1) Dẫn bổ sung thuyết minh chi tiết qui trình đề xuất (mục 3.1.3.2) Sửa lại mốc nhiệt đơng băng bảo quản vắc xin xác ≤ - 650C (mục 3.1.2 bảng 3.2) - Phần Kết luận: sửa lại cho thống với mục tiêu nội dung nghiên cứu luận văn Ngày Giáo viên hướng dẫn tháng năm 2021 Tác giả luận văn CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG LỜI CAM ĐOAN Tơi xin cam đoan, cơng trình nghiên cứu khoa học cộng thuộc phòng sản xuất vắc xin Bán thành phẩm phòng Kiểm định vắc xin hướng dẫn PGS.TS Nguyễn Thị Xuân Sâm TS Nguyễn Thuý Hường Các số liệu, kết luận văn trung thực chưa công bố cơng trình khác Học viên Nguyễn Thị Nguyệt Xác nhận quan (Trung tâm Nghiên cứu, sản xuất Vắc xin Sinh phẩm Y tế) LỜI CẢM ƠN Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn chân thành tới: PGS.TS Nguyễn Thị Xuân Sâm - Giảng viên Viện công nghệ sinh học công nghệ thực phẩm - Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội TS Nguyễn Thuý Hường – Phó giám đốc Trung tâm nghiên cứu, sản xuất Vắc xin sinh phẩm Y tế trực tiếp giảng dạy hướng dẫn thực đề tài Trong thời gian học tập nghiên cứu vừa qua, nhận giúp đỡ tạo điều kiện thầy cô Viện công nghệ sinh học công nghệ thực phẩm thầy Phịng Đào tạo - Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội Tôi xin chân thành cảm ơn giúp đỡ q báu Tồn nội dung nghiên cứu khóa luận thực hồn thành phịng sản xuất vắc xin Bán thành phẩm phòng Kiểm định vắc xin, Trung tâm Nghiên cứu, sản xuất vắc xin sinh phẩm y tế (POLYVAC) Tôi xin chân thành cảm ơn giúp đỡ quý báu tập thể cán hai đơn vị tạo điều kiện nhiệt tình giúp đỡ thời gian thực đề tài Nhân xin gửi lời cảm ơn chân thành tới Ban lãnh đạo Trung tâm Nghiên cứu, sản xuất vắc xin sinh phẩm y tế (POLYVAC) Cử nhân Nguyễn Xuân Hòa - Trưởng phòng Sản xuất vắc xin Sởi bán thành phẩm, nơi công tác, tạo điều kiện thuận lợi cho suốt thời gian học tập nghiên cứu Cuối xin chân thành cảm ơn bạn bè đồng nghiệp gia đình ln quan tâm giúp đỡ động viên tơi suốt thời gian học tập hồn thành khóa luận Hà Nội, Ngày tháng năm 2021 Học viên Nguyễn Thị Nguyệt MỤC LỤC DANH MỤC CÁC HÌNH iv DANH MỤC CÁC BẢNG v MỞ ĐẦU CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Đặc điểm sinh học, miễn dịch virus rubella 1.1.1 Hình thái cấu trúc 1.1.2 Sức đề kháng 1.1.3 Phân bố kiểu gen virus rubella 1.1.4 Đặc điểm trình phát triển virus 1.1.5 Tính cảm nhiễm miễn dịch [3] 1.2 Quá trình nghiên cứu phát triển vắc xin rubella 1.2.1 Tình hình nghiên cứu sản xuất vắc xin rubella giới 1.2.2 Tình hình sản xuất vắc xin rubella Việt Nam 1.2.3 Quá trình sản xuất vắc xin Rubella trung tâm POLYVAC CHƯƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 10 2.1 VẬT LIỆU, HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ 10 2.1.1 Vật liệu 10 2.1.2 Hóa chất thiết bị 10 2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 11 2.2.1 Cải tiến quy trình sản xuất vắc xin bán thành phẩm 11 2.2.2 Phương pháp nghiên cứu sản xuất bán thành phẩm rubella gặt lần liên tiếp 13 2.2.3 Phương pháp đánh giá chất lượng vắc xin Rubella bán thành phẩm sau nghiên cứu cải tiến quy trình 16 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 23 3.1 Nghiên cứu cải tiến quy trình sản xuất vắc xin bán thành phẩm 23 3.1.1 Xác định nồng độ tế bào nuôi thời điểm gặt hỗn dịch virus sản xuất vắc xin rubella bán thành phẩm 23 3.1.2 Nghiên cứu tối ưu quy trình đơng tan chia tank bảo quản vắc xin 30 i 3.1.3 Xây dựng quy trình sản xuất virus rubella cách gặt lần gặt liên tiếp 33 3.2 Kết sản xuất và đánh giá chất lượng vắc xin Rubella bán thành phẩm theo quy trình cải tiến 40 3.2.1 Kết sản xuất lô vắc xin rubella bán thành phẩm 40 3.2.2 Kết kiểm định chai tế bào đối chứng 40 3.2.3 Kết kiểm định mẫu rubella bán thành phẩm trước lọc 42 3.2.4 Kết kiểm định mẫu bán thành phẩm sau lọc 43 KẾT LUẬN 46 KIẾN NGHỊ 46 ii CÁC CHỮ VIẾT TẮT CGI CPE CRS FBS FL GMP HI IgA IgG IgM KDSV LM MEM MMR MOI MR MS MVVAC NBCS POLYVAC Rb RbSH-1 RbSH-2 RbBM RNA SCD SPF TCMR TGC TRYPSIN-EDTA Vero WHO WS Cell Growth Index (chỉ số phát triển tế bào) Cytopathic effect (Chỉ số hủy hoại tế bào) Congenital Rubella Syndrome (Hội chứng rubella bẩm sinh) Fetal Bovine Serum (huyết bê bào thai) Tế bào ung thư màng ối người Good Manufacturing Practice (thực hành sản xuất tốt) Haemagglutination Inhibition (Ức chế ngưng kết hồng cầu) Imunoglobulin A Imunoglobulin G Imunoglobulin M (Kitasato Daiichi Sankyo Vaccine- Công ty vắc xin Kitasato Daiichi Sankyo, Nhật Bản Công ty Daiichi Sankyo biotechnology viết tắt DSBT) Liquid Medium (môi trường lỏng) Minimum Essential Medium (môi trường cần thiết tối thiểu) vắc xin phối hợp Sởi (Measles), Quai bị (Mumps) Rubella Multiplicity Of Infection (Liều gây nhiễm) Measles-Rubella (Vắc xin phối hợp sởi – rubella) Master Seed (chủng gốc) Tên thương mại vắc xin sởi POLYVAC sản xuất Newborn caft serum (huyết bê sinh) Trung tâm Nghiên cứu, sản xuất Vắc xin Sinh phẩm Y tế Rubella Rubella single harvest-1 (mẻ gặt đơn rubella trước lọc trước bảo quản âm sâu ≤-650C) Rubella single harvest-2 (mẻ gặt đơn rubella trước lọc sau bảo quản âm sâu ≤-650C) Rubella bulk material (vắc xin Rubella bán thành phẩm sau lọc) Axit ribonucleic Soybean Casein Digest Specific Pathogen Free (không chứa tác nhân gây bệnh đặc trưng) Tiêm chủng mở rộng Thioglycolate Trypsin-Ethylen Diamine Tetra Acetic acid Tế bào thận khỉ xanh châu phi (dòng tế bào thường trực) World Health Organization (Tổ chức y tế giới) Working Seed (chủng sản xuất) iii DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1-1 Cấu trúc virus rubella [55] Hình 1-2 Sự sâm nhập nhân lên virus [22] Hình 2-1 Hình ảnh tế bào đối chứng kính hiển vi điện tử 17 Hình 2-2 Hình ảnh plaque giếng 19 Hình 2-3 Sơ đồ Kiểm tra Mycopalasma phương pháp màng lọc .20 Hình 2-4 Kết Mycoplasma phương pháp màng lọc 21 Hình 3-1 Hiệu giá nhóm theo thời gian lần thử nghiệm (lô 1) 27 Hình 3-2 Hiệu giá nhóm theo thời gian lần thử nghiệm (lô 2) 28 Hình 3-3 Hiệu giá nhóm theo thời gian lần thử nghiệm (lô 3) 29 Hình 3-4 Kết hiệu giá nhóm lơ 01 34 Hình 3-5 Kết hiệu giá nhóm lơ 02 35 Hình 3-6 Kết hiệu giá nhóm lơ 03 35 Hình 3-7 Sự biến đổi tế bào đối chứng thử nghiệm lần gặt 38 iv DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2-1 Quy trình thực thời điểm lấy mẫu thử nghiệm lần gặt 15 Bảng 3-1 Kết so sánh nhóm ni với nồng độ tế bào khác 24 Bảng 3-2 Kết so sánh nhóm thử nghiệm 30 Bảng 3-3 So sánh quy trình cải tiến so với quy trình chuyển giao cơng nghệ 32 Bảng 3-4 Kết hiệu giá lô nghiên cứu thực gặt lần 33 Bảng 3-5 Kết quan sát tế bào nhóm chai đối chứng bổ sung FBS nồng độ khác 36 Bảng 3-6 Kết sản xuất lô vắc xin rubella bán thành phẩm 40 Bảng 3-7 Kết kiểm tra chất lượng tế bào đối chứng 41 Bảng 3-8 Kết kiểm định mẫu bán thành phẩm trước lọc 42 Bảng 3-9 Kết kiểm định mẫu bán thành phẩm sau lọc 43 v Lô 03 ngày sau gây nhiễm) Hấp phụ hồng cầu (HPHC) CGI thời điểm kết thúc thử nghiệm (13 ngày sau gây nhiễm) Hấp phụ hồng cầu (HPHC) Không có tượng HPHC Không có tượng HPHC Không có tượng HPHC Tế bào kết dính, CGI 60%, mơi trường có xác tế bào rơi rụng Các đám tế bào co cụm, phủ kín bề mặt chai khoảng 85% Các tế bào mịn, đẹp, phủ kín 90% Khơng có tượng HPHC Không có tượng HPHC Không có tượng HPHC Kết bảng 3-5 cho thấy tất chai đối chứng thử nghiệm hấp phụ hồng cầu khơng có tượng hấp phụ hồng cầu, chai không bổ sung huyết bê bào thai (FBS) tế bào kém, chết co lại Đối với nhóm cịn lại bổ sung FBS tế bào bám tốt, số lượng chết đặc biệt nhóm 5% FBS cho kết tốt hình ảnh tế bào mịn, đẹp phủ kín 90% bề mặt chai Tế bào chai đối chứng 0%FBS (vào ngày gây nhiễm) Tế bào chai đối chứng 0%FBS – Ngày gặt lần 37 Tế bào đối chứng (2%FBS) – Ngày gặt Tế bào đối chứng (5%FBS) – Ngày gặt lần lần Hình 3-7 Sự biến đổi tế bào đối chứng thử nghiệm lần gặt Qua biểu đồ phân tích kết thu phương pháp T-test đánh giá kết hiệu giá thu nhóm nghiên cứu cho thấy: lô nghiên cứu cho kết nghiên cứu nhóm lô tương đương thời gian gặt lần thực theo nhóm hay nhóm đạt Như thực tế có thể áp dụng gặt lần liên tiếp sau gặt lần ngày ngày, vào lịch sản xuất thực tế để lựa chọn ngày gặt lần cho phù hợp, tránh chồng chéo lô sản xuất Đối với chai tế bào đối chứng lần gặt bổ sung thêm 5%FBS giúp cho tế bào trì phát triển tốt Qua kết thu nêu đề xuất áp dụng sản xuất vắc xin bán thành phẩm rubella sau : Các chai nuôi rửa Hank/PR(-) bổ sung môi trường M199(-) nuôi tiếp 300C Sau ngày ni thực thu hoạch tồn dịch nuôi (gặt lần 1) bổ sung chất ổn định theo tỉ lệ thể tích hỗn dịch virus : thể tích chất ổn đinh Bổ sung tiếp vào chai ni 120ml M199(-) ni 4÷5 ngày, nhiệt độ ni 300C Thu hoạch tồn hỗn dịch virus (gặt lần 2), bổ sung chất ổn định, chia vắc xin tank 10L, đông nhanh bảo quản nhiệt độ ≤ -650C Vắc xin hai lần gặt làm tan, hộn chung lại chia tank chứa theo thể tích tính tốn, sau đó đông nhanh bảo quản nhiệt độ ≤ -650C 38 Sản xuất tế bào (13 104 tế bào/ml) Gây nhiễm Rửa Hank/PR(-) Bổ sung M199(-) Gặt lần 1, Hộn Bổ sung tiếp môi trường M199/PR(-) vào chai nuôi Gặt lần 2, Hộn Chia tank 10L Đông nhanh, Bảo quản ≤ -650C Làm tan đá tank inox chứa vắc xin Hộn chung, Lọc Chia tank 10L Đông nhanh, Bảo quản vắc xin BTP ≤ -650C 39 3.2 Kết sản xuất và đánh giá chất lượng vắc xin Rubella bán thành phẩm theo quy trình cải tiến lô vắc xin bán thành phẩm sản xuất theo quy trình cải tiến đề xuất (không bao gồm công đoạn lần gặt liên tiếp) để đánh giá chất lượng sản phẩm ổn định sản xuất quy trình 3.2.1 Kết sản xuất lô vắc xin rubella bán thành phẩm Bảng 3-6 Kết sản xuất lô vắc xin rubella bán thành phẩm Nội dung Số chai/lô CGI trung bình ngày gây nhiễm CGI trung bình ngày thay mơi trường CGI trung bình ngày gặt Thể tích vắc xin bán thành phẩm Hiệu giá RbSH-1 Số tank inox chia nhỏ Đơn vị Lô sản xuất Lô 01 Lô 02 Lô 03 Chai 140 140 140 % 80,9 83,2 81,5 % 92,6 80,9 82,6 % 80,9 74,1 80,6 Lít 34,84 34,94 34,15 lgPFU/0,5ml 5,66 5,6 5,62 tank 9 Từ kết bảng 3-6 cho thấy kết thực lô tương đối đồng tỉ lệ CGI, hiệu giá số tank chia nhỏ, chứng tỏ quy trình sản xuất ổn định Hiệu giá lô 01 thu 5,66 lgPFU/0,5ml Theo bảng 3-3 hiệu giá nằm khoảng 5,64÷5,67 lgPFU/0,5ml chia nhỏ 10 tank vắc xin Tuy nhiên lô sản xuất đầu tiên, để đảm bảo việc chia tank vắc xin bán thành phẩm không ảnh hưởng tới hiệu giá vắc xin thành phẩm sau nên chia nhỏ tank vắc xin 3.2.2 Kết kiểm định chai tế bào đối chứng Kết kiểm tra chất lượng tế bào đối chứng lô thể bảng 3-7 40 Bảng 3-7 Kết kiểm tra chất lượng tế bào đối chứng Tên thử nghiệm Kết Tiêu chuẩn Lô 01 Lô 02 Lô 03 Đạt Đạt Đạt (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) - Không nhiễm tác nhân ngoại lai (không quan sát thấy CPE) Quan sát tế bào đối chứng - Không 20% tế bào bị loại bỏ không nguyên nhân đặc hiệu vào cuối thời điểm theo dõi Thử nghiệm virus hấp phụ hồng cầu - Không phát thấy virus ngoại lai gây hấp phụ hồng cầu chuột lang - Không quan sát thấy CPE Tác nhân ngoại lai FL - Không 20% tế bào bị loại bỏ không nguyên nhân đặc hiệu vào cuối thời điểm theo dõi - Không quan sát thấy CPE Tác nhân ngoại lai Vero - Không 20% tế bào bị loại bỏ không nguyên nhân đặc hiệu vào cuối thời điểm theo dõi - Không quan sát thấy CPE Tác nhân ngoại lai PRK Thử nghiệm Nosema cuniculi - Không 20% tế bào bị loại bỏ không nguyên nhân đặc hiệu không có tượng hấp phụ hồng cầu vào cuối thời điểm theo dõi - Không cuniculi nhiễm Nosema Mycoplasma Không có phát triển Mycoplasma (-) (-) (-) Thử nghiệm vô trùng Không có phát triển vi khuẩn nấm (-) (-) (-) 41 Ghi : (-) âm tính Từ kết cho thấy tất thử nghiệm chai tế bào đối chứng nước tế bào đối chứng đạt theo tiêu chuẩn WHO, Nhật Bản tiêu chuẩn sở nhà sản xuất Theo quy định WHO 5% tổng số chai tế bào hay 500ml tế bào sử dụng cho trình sản xuất vắc xin rubella dùng làm đối chứng [WHO Technical Report Series, No 840, annex3] Thử nghiệm sử dụng 07 chai tế bào làm chứng so với tổng khoảng 130 chai gây nhiễm virus rubella lô sản xuất Các chai tế bào đối chứng trải qua tất cơng đoạn q trình sản xuất không gây nhiễm virus Quan sát chai tế bào đối chứng trước thời điểm gây nhiễm, thay mơi trường, thu hoạch hỗn dịch virus nhằm kiểm sốt chất lượng tế bào công đoạn sản xuất Vào ngày thu hoạch, chai tế bào đối chứng kiểm tra có mặt virus gây hấp phụ hồng cầu, nước lấy để kiểm tra thử nghiệm phát tác nhân ngoại lai loại tế bào FL, Vero, PRK có mặt Encephalitozoon cuniculi – tác nhân phổ biến gây bệnh thỏ nguồn nguyên liệu sử dụng cho sản xuất vắc xin Kết kiểm tra chất lượng tế bào đối chứng lô sản xuất theo quy trình cải tiến đạt 3.2.3 Kết kiểm định mẫu rubella bán thành phẩm trước lọc Kết kiểm định mẫu bán thành phẩm rubella trước lọc thể bảng 3-8 đây: Bảng 3-8 Kết kiểm định mẫu bán thành phẩm trước lọc Lô 01 Kết Lô 02 Lô 03 Tác nhân ngoại Không nhiễm tác nhân ngoại lai lai FL (không có CPE) (-) (-) (-) Tác nhân ngoại Không nhiễm tác nhân ngoại lai lai Vero (không có CPE) (-) (-) (-) Tác nhân ngoại Không nhiễm tác nhân ngoại lai lai PRK (không có CPE) (-) (-) (-) Không có phát triển Mycoplasma (-) (-) (-) Thử nghiệm vô Không có phát triển vi trùng khuẩn nấm (-) (-) (-) Tên thử nghiệm Mycoplasma Tiêu chuẩn 42 Tên thử nghiệm Thử nghiệm tiêm thỏ Hiệu giá Lô 01 Kết Lô 02 Lơ 03 Sau thử nghiệm 80% động vật sống, khoẻ mạnh, tăng trọng phát triển bình thường khơng có dấu hiệu nhiễm virus ngoại lai Đạt Đạt Đạt ≥ 4,0lgPFU/0,5ml 5,66 5,6 5,62 Tiêu chuẩn Hỗn dịch virus thu hoạch vào ngày thứ sau gây nhiễm Sau hộn hỗn dịch virus từ tất chai gây nhiễm virus, mẫu lấy để kiểm tra vô trùng, mycoplasma, hiệu giá, tác nhân ngoại lai tế bào đặc biệt mẫu giai đoạn theo yêu cầu WHO cần kiểm tra tác nhân ngoại lai thỏ Thử nghiệm nhằm phát tác nhân hay gây bệnh thỏ virus Herpes, virus Pox thông qua quan sát biểu bên sau 30 ngày tiêm mẫu Từ kết thu cho thấy hiệu giá lô vắc xin bán thành phẩm trước lọc tương đối ổn định, dao động từ 5,6÷5,66 lgPFU/0,5ml Các thử nghiệm kiểm tra vô trùng tác nhân ngoại lai cho kết âm tính 3.2.4 Kết kiểm định mẫu bán thành phẩm sau lọc Kết kiểm định mẫu bán thành phẩm sau lọc thể bảng 3-9: Bảng 3-9 Kết kiểm định mẫu bán thành phẩm sau lọc Tên thử nghiệm Tiêu chuẩn Kết Lô 01 Lô 02 Lô 03 Không có phát triển Mycoplasma (-) (-) (-) Thử nghiệm vô Không có phát triển vi trùng khuẩn nấm (-) (-) (-) Mycoplasma Hiệu giá ≥ 4,0lgPFU/0,5ml 5,67 5,51 5,61 Thử nghiệm xác nhận loại bỏ tế bào Khơng cịn tế bào mẫu sau lọc Đạt Đạt Đạt Thử nghiệm Marker Sau 35 ngày thử nghiệm 80% động cịn sống, khoẻ Đạt Đạt Đạt 43 mạnh, tăng trọng phát triển bình thường không nhận thấy tồn kháng thể Rubella huyết Albumin huyết tồn dư < 50ng/ liều Đo pH 6,5-8,5 14 14,17 11,76 7,32 7,38 7,18 Nhằm loại bỏ xác tế bào, hỗn dịch virus lọc qua màng lọc 0,65µm Mẫu bán thành phẩm sau lọc quan sát kính hiển vi khơng cịn mảnh vụn tế bào Mặt khác virus rubella- chủng Takahashi sử dụng cho sản xuất vắc xin hiệu giá khơng thay đổi sau lọc mức 5,51÷5,67 lgPFU/0,5ml so với bán thành phẩm trước lọc lô Điều đó cho thấy việc sử dụng màng lọc quy trình lọc hoàn toàn phù hợp So với tiêu chuẩn WHO sản xuất vắc xin bán thành phẩm rubella, tiêu chuẩn Nhật có số điểm khác biệt Trong tiêu chuẩn thành phẩm sinh học Nhật Bản quy định việc thực kiểm tra vô trùng mycoplasma mẫu nước chai tế bào đối chứng, nhiên lại không thực thử nghiệm phát Encephalitozoon cuniculi Với mẫu bán thành phẩm sau lọc, Nhật Bản không yêu cầu kiểm tra Mycoplasma giống với tiêu chuẩn WHO Sở dĩ có khác biệt số nghiên cứu cho thấy cholesterol cần thiết cho sinh trưởng phát triển mycoplasma Mycoplasma sử dụng cholesterol từ huyết động vật nuôi cấy tế bào đồng thời sinh trưởng tốt môi trường nuôi cấy có vật chủ tế bào Chính mycoplasma cần kiểm soát đến giai đoạn bán thành phẩm trước lọc mà khơng cần kiểm sốt với mẫu bán thành phẩm sau lọc – giai đoạn loại bỏ tế bào môi trường nuôi cấy không chứa huyết động vật Một điểm khác biệt đáng lưu ý khác đó thử nghiệm Marker quy định bắt buộc thực tiêu chuẩn thành phẩm sinh học Nhật Bản Việc sản xuất vắc xin bán thành phẩm rubella sử dụng chủng Takahashi chủng virus sống giảm độc lực nên việc kiểm soát độc lực hay nói cách khác kiểm sốt quay trở lại độc lực q trình sản xuất hay khơng quan trọng, nó đảm bảo tính an tồn sản phẩm tạo Chủng giảm độc lực Takahashi phát triển nhiệt độ cao (390C) so với chủng độc tiêm chủng Takahashi vào chuột lang có 44 thân nhiệt cao virus khơng thể phát triển tạo kháng thể chống lại virus Lợi dụng điểm thử nghiệm marker phát triển để kiểm soát độc lực virus Kết thu cho thấy hiệu giá bán thành phẩm sau lọc lơ tương đối ổn định dao động từ 5,51÷5,67 lgPFU/0,5ml Các thử nghiệm kiểm tra vô trùng, mycoplasma, xác nhận loại bỏ tế bào, BSA, pH thử nghiệm marker đạt tiêu chuẩn cho phép Đồng thời thử nghiệm thực tham khảo theo tài liệu tiêu chuẩn dược điển Việt Nam V, WHO TRS840 tiêu chuẩn thành phẩm sinh học Nhật Bản Kết kiểm định chất lượng bán thành phẩm rubella giai đoạn đáp ứng tiêu chuẩn 45 KẾT LUẬN - Việc bổ sung công đoạn đông băng ≤-650 C, làm tan chia tank bảo quản hỗn dịch virus vào quy trình sản xuất vắc xin giúp chủ động sản xuất, tăng số liều vắc xin cho lô sản xuất (tăng trung bình 1.800.000 liều/lơ hiệu giá 5,65 lgPFU/0,5ml) - Đã xây dựng quy trình sản xuất vắc xin bán thành phẩm Rubella gặt lần liên tiếp với nồng độ tế bào ni thích hợp 13x104 tế bào/ml, thời điểm gặt lần ngày thứ tư sau rửa Hanks(-), gặt lần tiếp sau gặt lần ngày ngày, vào lịch sản xuất thực tế để lựa chọn ngày gặt lần cho phù hợp, tránh chồng chéo lô sản xuất Hiệu quy trình cải tiến tăng gấp 1,63 lần so với quy trình - Chất lượng lơ vắc xin Rubella bán thành phẩm sau nghiên cứu cải tiến quy trình (khơng bao gồm cơng đoạn gặt lần) đạt tiêu chuẩn quy định, Các số định lượng thu lô sản xuất tương đối đồng nhau, chứng tỏ quy trình sản xuất vắc xin bán thành phẩm ổn định KIẾN NGHỊ - Nghiên cứu sản xuất vắc xin rubella bán thành phẩm chai nhựa nhiều tầng giúp nâng cao sản lượng sản xuất, giảm thời gian sức lao động, mang lại hiệu kinh tế cao - Đọc trình tự gen virus mẫu vắc xin gặt lần gặt lần So sánh đánh giá khác biệt, biến đổi trình tự gen theo thời gian ni cấy Từ đó có đánh giá đầy đủ thay đổi chất lượng vắc xin qua lần gặt Trên sở kết thu thực đề xuất quản lý thay đổi xin cấp phép để ứng dụng quy trình gặt lần liên tiếp vào thực tế sản xuất 46 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Đặng Thị Thanh Huyền, Dương Thị Hồng, Nguyễn Thành Trung, Nguyễn Công Luật (2015), “Đặc điểm dịch tễ học bệnh Rubella Việt Nam năm 2008-2012”, Tạp chí y học dự phịng số (168)2015 Số đặc biệt, tr 216 - 225 Đặng Tiến Trường, Lê Thị Kim Dung, Nguyễn Duy Bắc (2014), "Nghiên cứu xác định genotype số chủng vi rút rubella phân lập số tỉnh miền Bắc Việt Nam", Tạp chí Y học Việt Nam, tập 424, số đặc biệt, tr.159164 Dương Đình Thiện (2006), "Bệnh rubella", Dịch tễ học bệnh truyền nhiễm, Nhà xuất y học, Hà Nội, tr.147-149 Học viện Quân y (2016), "Bệnh rubella", Bệnh học truyền nhiễm, Nhà xuất Quân đội nhân dân, Hà Nội, tr.480-489 Học viện Quân y (2011), "Virus rubella", Vi sinh y học, Nhà xuất Quân đội nhân dân, Hà Nội, tr.345-347 Ngô Thu Hường, Phạm Anh Thư, Phạm Thị Phương Thảo, Phạm Thành Trường, Nguyễn Đăng Hiền “Đánh giá chất lượng vắc xin bán thành phẩm rubella sản xuất polyvac”, Tạp chí y học thực hành số (1045) 2017, tr 114 – 117 Nguyễn Quảng Bắc (2012), Nghiên cứu tình trạng nhiễm rubella phụ nữ mang thai có nguy hội chứng rubella bẩm sinh Bệnh viện Phụ sản Trung ương, Luận án tiến sĩ y học, Trường Đại học Y Hà Nội, Hà Nội Nhà xuất y học (2018), Dược điển Việt Nam, lần tái thứ 5, tập 2, tr PL394 -395 Trần Như Dương, Vũ Hải Hà, Phạm Quang Thái, Phạm Văn Khang, Nguyễn Thị Thu Hương , Lê Hải Đăng “ Một số đặc điểm dịch tễ hội chứng rubella bẩm sinh giám sát bệnh viện Nhi trung ương, 2011-2016”, Tạp chí y học dự phịng số 10 (183)2016 Số đặc biệt, tr 35 - 43 10 Triệu Thị Thanh Vân, Phạm Thị Thu Hằng, Nguyễn Thị Mai Duyên, Đỗ Phương Loan “Dịch tễ sinh học phân tử virus Rubella Việt Nam, 2008-2013”, Tạp chí y học dự phòng số 10 (183)2016 Số đặc biệt, tr 27 - 35 47 Tiếng Anh 11 Akira shishido and misao ohtawara (1976), “Development of attenuated rubella virus vaccine in Japan” Japan Med Sci Biol., 29, 227-253, 1976 12 Akingbade D, Cohen BJ, Brown DW (2003), “Detection of Low-Avidity Immunoglobulin G in Oral Fluid Samples: New Approach for Rubella Diagnosis and Surveillance”, Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology, Vol 10, No 1, pp 189- 190 13 Almeida JD, Griffith AH (1980), “Viral infections and rheumatic factor”, Lancet, (8208–8209), pp 1361–13622 14 Amy Johnson and Brenda Ross (2007), “Perinatal infections”, John Hopkins Manual of Gynecology and Obstetrics, pp 136- 149 15 Bashayer Aseeri, Reem Abahussain, Safiah Al-mushawah, Norah Al-samih, Nadia Alruji (2016) “Rubella virus (German measles)” Kingdom of Saudi Arabia King Saud University College of Science 16 Ben Saleh A, Zaatour A, Pomery L (2003), “Validation of a modified commercial assay for the detection of rubella-specific IgG in oral fluid for use in population studies”, J Virol Methods, 114, pp 151–158 17 Best JM, Banatvala JE, Morgan-Capner P, et al (1989), “Fetal infection after maternal reinfection with rubella: criteria for defining reinfection”, Br Med J, 299, pp 773–775 18 Best JM, Castillo-Solorzano C, Spika JS, et al (2005), Reducing the global burden of congenital rubella syndrome, Report of the WHO Steering Committee on Research Related to Measles and Rubella vaccine and Vaccination, June, J Infect Dis 2005, 192(11), pp 1890 19 Best JM, O’Shea S, Tipples G, et al (2002), “Interpretation of rubella serology in pregnancy—pitfalls and problems”, Br Med J; 325: pp 47–48 20 Bosma TJ, Corbett KM, O’Shea S, et al (1995), “PCR for detection of rubella virus RNA in clinical samples”, J Clin Microbio, 33, pp 1075–1079 21 Bottiger B, Jensen IP (1997), “Maturation of rubella IgG avidity over time after acute rubella infection”, Clin Diagn Virol, 8(2), pp 105–111 22 Bowden DS, Westaway EG (1984), “Rubella virus: structural and non structural proteins”, J, Gen, Virol, 65, pp 933-943 23 Bowden DS, Westaway EG (1985), “Changes in glycosylation of rubella virus envelope proteins during maturation”, J, Gen, Virol, 66, pp 201-206 48 24 Brookhouser PE, and Bordley JE (1973), “Congenital rubella deafness”, Arch, Otolaryngol, 98, pp 252–257 25 Canadian Council on Animal Care (2002), Guidelines on: antibody production ISBN: 0-919087-37-X 26 CDC (2005), Achievements in public health: elimination of rubella and congenital rubella syndrome—United States 1969–2004, Morb Mortal Wkly Rep, 54, pp 279 27 CDC (2010), Progress toward control of rubella and prevention of congenital rubella syndrome - worldwide, MMWR Morb Mortal Wkly Rep, 15,59 (40), pp 1307-1310 28 Chantler J, Wolinsky JS, Tingle A (2001), Rubella virus, In: Fields Virology (Fields BN, Knipe DM, Howley PM, editors), Philadelphia, Lippincott, Williams and Wilkins, pp 963 29 Cheong Ai Theng, Khoo Ee Ming (2008), “Prevalence of Rubella Susceptibility Among Pregnant Mothers in a Community- Based Antenatal Clinic in Malaysia: A Cross- Section Study”, Asia- Pacific Journal of Public Health, Vol 20, No 4, pp 340- 346 30 Cutts FT, Vynnycky E (1999), “Modelling the incidence of congenital rubella syndrome in developing countries”, Int J Epidemiol, 28, pp 1176 31 Cutts SE, Robertson JL, Diaz-Orterga et al (1997), Control of rubella and congenital rubella syndrome (CRS) in developing countries, part : burden of disease from CRS, WHO Bulletin OMS Vol 75, 1997, pp 55- 68 32 Dinh Nguyen Tran, Ngan Thi Kim Pham et al (2012), "Phylogenetic Analysis of Rubella Viruses in Vietnam During 2009–2010", Journal of Medical Virology, 84, pp.705-710 33 Dominguez G, Wang C-Y, Frey TK (1990) “Sequence of the genome RNA of rubella virus: evidence for genetic rearrangement during togavirus evolution”, Virology, 177, pp 225 34 Dontigny L, Arsenault MY, Martel MJ et al (2008), “Rubella in Pregnancy”, J Obstet Gynecol Can, 30(2), pp 152- 158 35 Frey TK, Abernathy ES, Bosma TJ, et al (1998), “Molecular analysis of rubella virus epidemiology across three continents, North America, Europe and Asia, 1961–1997”, J Infect Dis, 178, pp 642–650 36 Frey TK, Wolinsky JS (1999), Rubella virus (Togaviridae), In: 49 Encyclopedia of Virology (Granoff A, Webster RG, editors), San Diego: Academic Press, pp 1592 37 Frey TK (1994), Molecular biology of rubella virus, Adv, Virus Res, 44, pp 69-160 38 Gilles RG Monif, David AB (2005), “Rubella, Infections diseases in pregnancy”, Obstetrics and Gynecology, pp 252- 265 39 Halliday LC, Artwohl JE, Hanly WC, et al (2000) Physiologic and behavioral assessment of rabbits immunized with Freund’s Complete Adjuvant Contemporary Topics of Laboratory Animal Science 30(7): 8- 13 40 Hobman TC, Lundstrom ML, Mauracher CA, et al (1994), “Assembly of rubella virus structural proteins into virus-like particles in transfected cells”, Virology, 202(2), pp 574–585 41 Ho-Terry L, Cohen A (1982), “Rubella virion polypeptides: characterization by polyacrylamide gel electrophoresis, isoelectric focusing and peptide mapping”, Arch, Virol, 72, pp 47-54 42 Ho-Terry L, Cohen A (1984), “The role of glycosylation on haemagglutination and immunological reactivity of rubella virus”, Arch, Virol, 79, pp 139-146 43 Hudson P, Morgan-Capner P (1996), “Evaluation of 15 commercial enzyme immunoassays for the detection of rubella-specific IgM”, Clin Diagn Virol, 5, pp 21–26 44 Icenogle JP, Frey TK, Abernathy E, et al (2006), “Genetic analysis of rubella viruses found in the United States between 1966 and 2004: evidence that indigenous rubella viruses have been eliminated”, Clin Infect Dis, 43(suppl 3) 45 Jia-Yee-Lee and D, Scott Bowden (2000), “Rubella Virus Replication and links to Teratogenicity”, Clinical Microbiology Reviews, October 2000, Vol 13, No 4, pp 571-587 46 Katow S, Minahara H, Fukushima M, Yamaguchi Y (1997), “Molecular epidemiology of rubella by nucleotide sequences of the rubella virus E1 gene in three East Asian countries”, J Infect Dis, 176, pp 602 47 Koonin EV, Gorbalenya AE, Purdy MA, et al (1992), Computer-assisted assignment of functional domains in the nonstructural polyprotein of hepatitis E virus: delineation of an additional group of positive-strand RNA 50 plant and animal viruses, Proc Natl Acad Sci USA, 89, pp 8259 48 Kuhn RJ, Zhang W, Rossmann MG, et al (2002), Structure of dengue virus: implications for flavivirus organization, maturation, and fusion, Cell, 108, pp 717 49 Law LM, Everitt JC, Beatch MD, et al (2003), “Phosphorylation of rubella virus capsid regulates its RNA binding activity and virus replication”, J Virol, 77, pp 1764 50 Reef SE, Plotkin S et al (2000) “Preparing for elimination of congenital Rubella syndrome (CRS): summary of a workshop on CRS elimination in the United States” Clin Infect Dis.; 31(1): 85-95 51 Sakata M,Komase K, Nakayama T (2009), "Histidine at position 1042 of the p150 region of a KRT live attenuate rubella vaccine strain is responsible for temperature sensitivity", Vaccine, 27, pp.234-240 52 Susan E Reef and Stanley A Plotkin (2017), "Rubella Vaccines", Plotkin's Vaccines, 7th edition, Elsevier, Philadelphia, USA, pp 970-1000 53 WHO (1994), Requyrements for measles, mumps and rubella vaccines and combined vaccine (live), WHO Technical Report Series, No 840, annex3 54 WHO (2013), "Rubella virus nomenclature update: 2013", Weekly epidemiological record, 32, pp.337–348 55 WHO (2018), Manual for the Laboratory-based Surveillance of Measles, Rubella, and Congenital Rubella Syndrome, Vaccines and Biologicals 3rd edition Department of Immunization, WHO, Geneva 51 ... xin bán thành phẩm rubella Việt Nam? ?? Mục tiêu nghiên cứu: − Cải tiến quy trình sản xuất vắc xin bán thành phẩm rubella Việt Nam nhằm nâng cao công suất − Đánh giá chất lượng vắc xin Rubella bán. .. chất lượng vắc xin Rubella bán thành phẩm sau nghiên cứu cải tiến quy trình 16 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 23 3.1 Nghiên cứu cải tiến quy trình sản xuất vắc xin bán thành phẩm 23 3.1.1... Quá trình nghiên cứu phát triển vắc xin rubella 1.2.1 Tình hình nghiên cứu sản xuất vắc xin rubella giới 1.2.2 Tình hình sản xuất vắc xin rubella Việt Nam 1.2.3 Quá trình sản xuất vắc