Ảnh hưởng của 2-hydroxyestradiol và 4-hydroxyestradiol đến tổng hợp cyclic adenosine monophosphate trong tế bào Leydig chuột dưới tác động của equine Chorionic Gonadotropin (eCG)

Trong nghiên cứu này, sự ảnh hưởng của hai chất ức chế adenylyl cyclase 2-hydroxyestradiol và 4-hydroxyestradiol đến biểu hiện của cAMP trong tế bào Leydig chuột mLTC-1 được kích hoạt bởi equine Chorionic Gonadotropin (eCG) được kiểm tra. Kết quả cho thấy, chất ức chế trực tiếp hoạt động của enzyme adenylyl cyclase, 2-hydroxyestradiol; 4-hydroxyestradiol, đã làm giảm tín hiệu cAMP nội bào và năng lượng ATP trong tế bào mLTC-1 nhưng không làm ảnh hưởng đến tỷ lệ sống của tế bào.

N.T.C.Hiếu, N.B.Nghị, Đ.T.Hà, N.T.M.Điệp / Tạp chí Khoa học Công nghệ Đại học Duy Tân 5(48) (2021) 57-62 57 5(48) (2021) 57-62 Ảnh hưởng 2-hydroxyestradiol 4-hydroxyestradiol đến tổng hợp cyclic adenosine monophosphate tế bào Leydig chuột tác động equine Chorionic Gonadotropin (eCG) Effects of 2-hydroxyestradiol and 4-hydroxyestradiol on eCG-stimulated cyclic adenosine monophosphate synthesis in mouse leydig cells Nguyễn Thị Chí Hiếua, Nguyễn Bá Nghịa, Đỗ Thu Hàb,c, Nguyễn Thị Mộng Điệpd* Nguyen Thi Chi Hieua, Nguyen Ba Nghia, Do Thu Hab,c, Nguyen Thi Mong Diepd* Khoa Sinh học ứng dụng, Trường Đại học Quang Trung, Việt Nam a Faculty of Applied Biology, Quang Trung University, Vietnam b Trung tâm Sinh học phân tử, Trường Y Dược, Đại học Duy Tân, Đà Nẵng, Việt Nam b Center for Molecular Biology, College of Medicine and Pharmacy, Duy Tan University, Da Nang, 550000, Vietnam c Khoa Dược, Trường Y Dược, Đại học Duy Tân, Đà Nẵng, Việt Nam c Department of Medicine, College of Medicine and Pharmacy, Duy Tan University, 550000, Da Nang, Vietnam d Khoa Khoa học Tự nhiên, Trường Đại học Quy Nhơn, Việt Nam d Faculty of Natural Sciences, Quy Nhon University, Vietnam a (Ngày nhận bài: 27/5/2021, ngày phản biện xong: 08/6/2021, ngày chấp nhận đăng: 13/10/2021) Tóm tắt Cyclic adenosine monophosphate (cAMP, AMP vòng) chất truyền tin thứ hai quan trọng nhiều trình sinh học, dẫn xuất adenosine triphosphate (ATP) sử dụng để truyền tín hiệu nội bào nhiều sinh vật khác nhau, truyền tin theo đường phụ thuộc vào cAMP Trong nghiên cứu này, ảnh hưởng hai chất ức chế adenylyl cyclase 2-hydroxyestradiol 4-hydroxyestradiol đến biểu cAMP tế bào Leydig chuột mLTC-1 kích hoạt equine Chorionic Gonadotropin (eCG) kiểm tra Kết cho thấy, chất ức chế trực tiếp hoạt động enzyme adenylyl cyclase, 2-hydroxyestradiol; 4-hydroxyestradiol, làm giảm tín hiệu cAMP nội bào lượng ATP tế bào mLTC-1 không làm ảnh hưởng đến tỷ lệ sống tế bào Từ khóa: mLTC-1, cAMP, Adenylyl cyclase, 2-hydroxyestradiol; 4-hydroxyestradiol Abstract Cyclic adenosine monophosphate (cAMP, cyclic AMP) is an important second messenger in many biological processes It is a derivative of adenosine triphosphate (ATP) and is used to transmit intracellular signals in many different organisms, which depends on cAMP signaling pathway In this study, the effect of 2-hydroxyestradiol and 4hydroxyestradiol on eCG-stimulated cyclic adenosine monophosphate synthesis in mouse leydig cells is tested Results showed that the direct inhibitor of the adenylyl cyclase enzyme, 2-hydroxyestradiol and 4-hydroxyestradiol, reduced intracellular cAMP signal and ATP level in mLTC-1 cells but not cell viability Keywords: mLTC-1, cAMP, Adenylyl cyclase, 2-hydroxyestradiol, 4-hydroxyestradiol * Corresponding Author: Nguyen Thi Mong Diep; Faculty of Natural Sciences, Quy Nhon University, Vietnam Email: nguyenthimongdiep@qnu.edu.vn 58 N.T.C.Hiếu, N.B.Nghị, Đ.T.Hà, N.T.M.Điệp / Tạp chí Khoa học Cơng nghệ Đại học Duy Tân 5(48) (2021) 57-62 Đặt vấn đề Adenylate cyclase (EC 4.6.1.1) hay gọi enzyme adenylyl cyclase (hoặc adenyl cyclase, AC) enzyme đóng vai trị quan trọng chuỗi truyền tín hiệu từ bên ngồi tế bào vào tế bào chất Khi nhận tín hiệu truyền từ protein G (protein G nhận tín hiệu từ thụ thể), adenylyl cyclase thực chức xúc tác q trình chuyển hóa adenosine triphosphate (ATP) thành adenosine monophosphate mạch vòng (AMP vòng, cAMP) pyrophosphate (PPi) Sản phẩm adenylyl cyclase, AMP vòng, mắt xích quan trọng q trình truyền tín hiệu nội bào, xem chất truyền tín hiệu thứ hai tế bào [1] Ở động vật có vú, hoạt động AC liên quan đến màng mã hóa họ adenylyl cyclase xuyên màng (tmACs), làm trung gian cho phản ứng tế bào với kích thích ngoại bào Chín gen tmAC riêng biệt khác kiểu biểu đặc tính điều hòa chúng xác định Các tmACs nghiên cứu rộng rãi nhiều phịng thí nghiệm Một dạng AC thứ hai động vật có vú mơ tả vào năm 1975 [2] dự đoán khác biệt mặt phân tử với tmACs [3,4] Hoạt động cho phụ thuộc vào Calcium không nhạy với Gprotein [5] forskolin [6] Hoạt động giống adenylyl cyclase hòa tan (sAC) liên kết với màng bị kích thích natri bicarbonat [7-10] Tuy nhiên, chất phân tử, quy định sinh hóa chức sinh lý sAC cịn khơng rõ ràng enzyme sAC tinh chế nhân vào năm 1999 [11] Các lĩnh vực xúc tác sAC có liên quan đến AC cảm nhận bicarbonat từ vi khuẩn lam [11,12] cho thấy bảo tồn chức cyclase cảm biến bicarbonat suốt q trình tiến hóa Dòng tế bào mLTC-1 từ chuột thiết lập từ nhiều năm trước [13] nhiều nhà nghiên cứu quan tâm nghiên cứu liên kết hCG với thụ thể LHR [14,15] sản sinh steroids hormone kiểm soát hormone điều hòa tuyến sinh dục thùy trước tuyến yên tiết [16] Chúng ta biết tế bào tinh hồn Leydig có lượng thụ thể thấp [17,18], số cao nhiều chắn ảnh hưởng đến phương thức kích hoạt đường cAMP hormone có hoạt động LH khác phương phức điều khiển đường khác Do vậy, chọn sử dụng tế bào cho nghiên cứu 2-hydroxy Estradiol (2-CE) 4Hydroxyestradiol (4-CE) chất catechol estrogen dạng chuyển hóa estrogen 2CE 4-CE hình thành từ estrogen đồng dạng cytochrome P450 2-CE 4-CE xác định chất ức chế hoạt động enzyme adenylate cyclase [19] Nghiên cứu gần nhất, thiết lập thành cơng mơ hình tế bào cách chuyển nạp vector pGlosensor-TM-22F cyclic AMP plasmid đáp ứng luciferase vào dòng tế bào Leydig mLTC-1 Các tế bào mLTC-1 chuyển nạp 24 trước sử dụng có biểu cAMP đáp ứng luciferase với hệ số biến thiên 10% [20] Sau đó, sử dụng phát quang oxiluciferin điểm kết thúc cho phép đo thời gian thực việc sản xuất cAMP nội bào Như vậy, với phương pháp thí nghiệm thực nghiên cứu tích lũy cAMP nội bào Trong nghiên cứu xác định ảnh hưởng hai chất ức chế 2hydroxyestradiol 4-hydroxyestradiol đến hoạt động adenylate cyclase thông qua biểu nồng độ cAMP nội bào tác động kích thích eCG tế bào leydig mLTC-1 Vật liệu phương pháp 2.1 Vật liệu Vật liệu: Dòng tế bào mLTC-1 từ chuột Viện nghiên cứu nông nghiệp quốc gia N.T.C.Hiếu, N.B.Nghị, Đ.T.Hà, N.T.M.Điệp / Tạp chí Khoa học Công nghệ Đại học Duy Tân 5(48) (2021) 57-62 59 (INRAe) Pháp cung cấp bảo quản nuôi cấy Học viên Quân Y, Hà Nội Xác định mức lượng ATP tế bào Hóa chất: Tất hóa chất mua từ Sigma-Aldrich (Trung Quốc) trừ có ghi khác Các tế bào mLTC-1 tra vào đĩa nuôi cấy gồm 96 giếng với số lượng khoảng 100.000 tế bào/giếng Sau 48 nuôi cấy nhiệt độ 37°C, môi trường thay mơi trường khơng có huyết có bổ sung 2hydroxyestradiol 4-hydroxyestradiol Đĩa tế bào ủ thêm nhiệt độ 37°C trước thêm 50μl Cell-Titer-Glo 2.0 Assay Promega vào giếng Sau đĩa tế bào lắc với vận tốc nhẹ 10 phút tối ủ thêm phút nhiệt độ phòng trước ghi lại phát quang thuốc thử Cell-Titer-Glo 2.0 Giá trị cường độ phát quang thu tương đương với giá trị nồng độ ATP tế bào sống 2.2 Phương pháp nghiên cứu Phương pháp nuôi cấy tế bào: Tế bào mLTC-1 nuôi cấy mơi trường RPMI 1640 (Gibco, Invitrogen) có bổ sung huyết bò 48 tiếng trước tra vào giếng đĩa nuôi cấy 96 giếng, khoảng 100.000 tế bào/giếng, sau mang ủ 37°C với 5% CO2 vòng 24 tiếng Phương pháp xác định cAMP nội bào: cAMP nội bào tích lũy tác động hormone tế bào mLTC-1 đo phát quang oxiluciferin sản xuất tác dụng luciferase phụ thuộc cAMP Tế bào mLTC-1 sau 24 tiếng nuôi cấy transfected với Glosensor-TM-22F cyclic AMP plasmid, sử dụng chất vận chuyển XtremeGENETM-HP-DNA Plasmid bao gồm trình tự gen mã hóa luciferase đom đóm dung hợp với vùng liên kết cAMP gen mã hóa protein kinase A cho phép kiểm sốt hoạt động enzyme cAMP Sau dịch mơi trường transfection loại bỏ thay môi trường RPMI 1640 khơng có huyết chứa chất luciferase luciferin có bổ sung IBMX Tế bào sau ủ 28°C trước kích thích eCG cách bổ sung vào giếng trước quan sát nồng độ cAMP máy đo quang phổ huỳnh quang Sau đó, hormone nồng độ khác thêm vào giếng (n = liều) đĩa đặt vào đầu đọc Polarstar OPTIMA (BMG labtech) phát phát quang tế bào phát theo thời gian Phương pháp đánh giá khả sống tế bào mLTC-1: Các tế bào mLTC-1 gieo vào đĩa 96 giếng với 100.000 tế bào/giếng Hai ngày sau, môi trường thay mơi trường khơng có huyết bổ sung 20µl CellTiter-Blue Reagent (Promega, Madison, WI, USA) đến giếng Sau ủ 37°C, thay đổi huỳnh quang ghi lại máy đo quang phổ Spectra Gemini (Sunnyvale, CA) bước sóng kích thích 560nm bước sóng phát xạ 640nm Tín hiệu huỳnh quang từ thuốc thử CellTiterBlue tỷ lệ thuận với số lượng tế bào sống Phương pháp xử lý số liệu: Trong thí nghiệm, lần lặp lại thực giá trị trung bình sai số chuẩn giá trị trung bình (SD) xác định Phân tích thống kê thực phần mềm Graphpad Prism Kết thảo luận 3.1 Ảnh hưởng 2-hydroxyestradiol 4-hydroxyestradiol đến nồng độ cAMP nội bào tác động kích thích eCG 60 N.T.C.Hiếu, N.B.Nghị, Đ.T.Hà, N.T.M.Điệp / Tạp chí Khoa học Cơng nghệ Đại học Duy Tân 5(48) (2021) 57-62 Trong thí nghiệm chúng tơi thử nghiệm 2-hydroxyestradiol (2-CE) 4hydroxyestradiol (4-CE) hai nồng độ khác 50 100µM ủ với tế bào mLTC-1 60 phút trước bổ sung chất luciferase để đo tín hiệu huỳnh quang phát từ cAMP; thời gian đo tín hiệu cAMP nội bào kéo dài 60 phút (đây thời gian kích thích tế bào eCG) Kết trình bày hình 3.1 Hình 3.1 Ảnh hưởng 2-hydroxyestradiol 4-hydroxyestradiol đến nồng độ cAMP nội bào tác động kích thích eCG Lượng hormone eCG tra vào giếng đĩa 96 giếng giống 10µl, nồng độ lặp lại lần Số liệu trình bày biểu đồ giá trị trung bình cường độ tín hiệu biểu cAMP lần Các estrogens catechol chất chuyển hóa steroid tạo phản ứng sinh lý thông qua việc liên kết với nhiều loại mục tiêu tế bào Estrogen catechol biết đến chất ức chế trực tiếp adenylyl cyclase hòa tan adenylyl cyclase xuyên màng dồi [21] 2-hydroxyestradiol 4-hydroxyestradiol hai chất ức chế trực tiếp adenylyl cyclase hòa tan nằm nhóm estrogens catechol [21] Kết chúng tơi hình 3.1 cho thấy có khác biệt biểu cAMP ủ tế bào mLTC-1 với 2-CE 4-CE Cường độ tín hiệu cAMP nội bào kích thích eCG bị giảm tác động ức chế 2-CE 4-CE phụ thuộc vào nồng độ Tại nồng độ 100µM 4CE, tín hiệu cAMP bị ức chế hoàn toàn Kết nghiên cứu trước nhóm tác giả Regigborn cs (2005) cho kết luận 2CE 4-CE ức chế trực tiếp hoạt động enzyme adenylyl cyclase hòa tan adenylyl cyclase xuyên màng [21] 2-CE 4CE ngăn chặn tích tụ cAMP tế bào 4-4 chuyển nạp ổn định sAC Đây tế bào thận phơi người (HEK293) truyền plasmid có chứa sAC tcDNA [22] đặt áp lực chọn lọc với gentamicin [19] Như kết cho thấy suy giảm nồng độ cAMP tế bào leydig mLTC-1 gây 2-CE 4-CE có liên quan đến ức chế hoạt động enzyme adenylyl cyclase 3.2 Ảnh hưởng 2-hydroxyestradiol 4hydroxyestradiol đến nồng độ ATP tế bào mLTC-1 Vì adenylyl cyclase có số liên kết chất ATP, việc giảm lượng ATP tế bào phần chế hoạt động chất ức chế adenylyl cyclase tiềm hợp chất để nghiên cứu kết sinh lý việc ức chế adenylyl cyclase bị cản trở nghiêm trọng điều Trong nghiên cứu này, tiếp tục đánh giá tác động hai chất ức chế 2-CE 4-CE lượng ATP tế bào Kết thể hình 3.2 N.T.C.Hiếu, N.B.Nghị, Đ.T.Hà, N.T.M.Điệp / Tạp chí Khoa học Công nghệ Đại học Duy Tân 5(48) (2021) 57-62 61 3.3 Đánh giá tỷ lệ sống tế bào mLTC-1 giếng sau ủ với 2hydroxyestradiol 4-hydroxyestradiol Hình 3.2 Ảnh hưởng 2-hydroxyestradiol 4hydroxyestradiol đến nồng độ ATP tế bào mLTC1 Số liệu trình bày biểu đồ giá trị trung bình cường độ tín hiệu ATP lần thí nghiệm độc lập Những chữ số khác thể khác có ý nghĩ thống kê đối chứng (Ctrol, không bổ sung 2CE, 4CE) chất thí nghiệm 2-CE, 4-CE Kết thí nghiệm cho thấy 2-CE 4-CE làm suy giảm nồng độ lượng ATP tế bào so với đối chứng không bổ sung 2-CE 4-CE Sự suy giảm có ý nghĩa thống kê với P