Phát hiện nấm Fusarium spp. gây bệnh thối xương rồng

Phát hiện nấm Fusarium spp. gây bệnh thối xương rồng (Cactaceae) bằng kỹ thuật PCR (polymerase chain reaction)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

PHÁT HIỆN LOÀI Fusarium spp GÂY BỆNH THỐI XƯƠNG RỒNG (Cactaceae) BẰNG PHƯƠNG PHÁP

POLYMERASE CHAIN REACTION (PCR)

Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Niên khóa : 2003 – 2007

Sinh viên thực hiện : PHẠM THỊ HẰNG

Thành phố Hồ Chí Minh - Tháng 9/2007

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

****0O0****

PHÁT HIỆN LOÀI NẤM Fusarium spp GÂY BỆNH THỐI

XƯƠNG RỒNG (Cactaceae) BẰNG KỸ THUẬT PCR (Polymerase Chain Reaction)

Giáo viên hướng dẫn Sinh viên thực hiện

TS LÊ ĐÌNH DÔN

Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 09/2007

Thầy Lê Đình Đôn và thầy Dương Thành Lam đã hết lòng giúp đỡ, hướng dẫn tôi trong suốt quá trình thực tập tốt nghiệp

Anh Nguyễn Văn Lẫm, các Anh Chị làm việc tại phòng thí nghiệm 105 Bộ Môn Bảo Vệ Thực Vật khoa Nông Học cùng các Anh Chị làm việc tại Viện nghiên cứu Công nghệ Sinh học và Công nghệ Môi trường Trường Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh đã nhiệt tình giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện khóa luận

Các Bạn sinh viên lớp công nghệ sinh học 29 đã động viên, giúp đỡ tôi trong suốt thời gian học tập và làm đề tài tốt nghiệp

Tp Hồ Chí Minh tháng 9 năm 2007 Phạm Thị Hằng

TÓM TẮT

PHẠM THỊ HẰNG, Đại Học Nông Lâm Tp Hồ Chí Minh, tháng 9-2007

“PHÁT HIỆN LOÀI NẤM Fusarium spp GÂY BỆNH THỐI XƯƠNG RỒNG (Cactaceae) BẰNG KỸ THUẬT PCR (Polymerase Chain Reaction)” tại phòng Bảo

Vệ Thực Vật, Khoa Nông Học trường Đại học Nông Lâm và Viện nghiên cứu Công nghệ Sinh học và Công nghệ Môi trường – phòng Công nghệ Sinh học Thực vật Trường Đại học Nông Lâm – TP.HCM

Thời gian thực hiện đề tài: 20/3/2007 đến 30/7/2007 Giáo viên hường dẫn: KS Dương Thành Lam

TS Lê Đình Đôn

 Nội dung nghiên cứu

 Điều tra tình hình bệnh hại xương rồng trên địa bàn Tp Hồ Chí Minh

 Thu thập xương rồng bị bệnh từ các vườn điều tra Từ đó phân lập, nhân và thu sinh khối các dòng nấm đã phân lập được

 Ly trích thu DNA Thực hiện quy trình phản ứng PCR khuếch đại trình tự

nằm trong vùng tef bằng primer ef1 và ef2 của các dòng nấm phân lập được

 Phân lập được 12 dòng nấm từ các mẫu xương rồng bị bệnh với 2 hình thái có màu khuẩn lạc đặc trưng:

Khuẩn lạc nấm màu trắng, tròn, tơ mịn Khuẩn lạc nấm màu tím, tròn, tơ mịn

 Ly trích được DNA tổng số của 12 dòng nấm phân lập được Khuếch đại

được đoạn DNA có kích thước 700 bp nằm trong vùng tef của các dòng nấm (dựa

vào thang ladder)

 Giải trình tự vùng tef của 3 dòng nấm thuộc Fusarium spp gồm: FC07 – 3, FC07 – 7, FC07 – 10 Xác định dòng FC07 – 3 và FC07 – 10 là nấm Fusarium

solani Còn dòng FC07 – 7 đang được tiếp tục nghiên cứu

 Chủng bệnh nấm trên xương rồng khỏe: 7 dòng nấm có khả năng gây bệnh nặng sau 4 ngày chủng bênh (ở nhiệt độ phòng)

1.3 Giới hạn của đề tài 2

Chương 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

2.1 Một số đặc tính để phát triển kiểng xương rồng 3

2.2 Phân loại thực vật và giới thiệu về cây xương rồng (Cactaceae) 4

2.2.1 Phân loại thực vật 4

2.2.2 Giới thiệu về cây xương rồng và các cây cùng họ 4

2.2.3 Tình hình sản xuất và phát triển xương rồng ở Tp Hồ Chí Minh và trên thế giới 5

2.2.5 Bệnh hại trên cây xương rồng 11

2.3.4 Đặc điểm phát sinh phát triển của nấm Fusarium 14

2.4 Khả năng gây hại của nấm Fusarium spp gây ra và biện pháp phòng trừ 14 2.4.1 Khả năng gây hại 14

2.4.2 Một số biện pháp chủ yếu để phòng trị nấm Fusarium spp 16

2.4.2.1 Sử dụng cây giống kháng bệnh 16

2.4.2.2 Biện pháp canh tác 16

2.4.2.3 Biện pháp hóa học 17

2.5 Tổng quan về vùng tef trên genome của nấm Fusarium 17

2.6 Ứng dụng kỹ thuật PCR trong phát hiện nấm 18

2.6.1 Khái niệm 18

2.6.2 Nguyên tắc 19

2.6.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến kết quả phản ứng PCR 20

2.6.4 Ứng dụng của PCR 22

2.7 Giới thiệu sơ lược về kỹ thuật DNA sequencing 22

2.8 Một số nghiên cứu trong và ngoài nước về bệnh do nấm Fusarium spp 22

2.8.1 Trên thế giới 22

2.8.2 Tại Việt Nam 25

2.9 Danh mục một số loài Fusarium được tìm thấy ở Việt nam 26

Chương 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 27

3.1 Vật liệu thí nghiệm 27

3.1.1 Thời gian – địa điểm nghiên cứu 27

3.1.2 Vật liệu 27

3.2 Phương pháp nghiên cứu 29

3.2.1 Điều tra tình hình bệnh chết trên cây xương rồng tại TP Hồ Chí Minh 29

3.2.2 Phân lập mẫu nấm 29

3.2.3 Tăng sinh khối nấm trên môi trường nhân sinh khối 31

3.2.4 Ly trích DNA tổng số của nấm 32

Quy trình này được thực hiện dựa trên quy trình của Lee và Taylor 32

3.2.5 Điện di xem DNA tổng số 32

3.2.6 Thực hiện phản ứng PCR khuếch đại vùng tef các dòng nấm Fusarium spp 33

3.2.7 Đọc trình tự sản phẩm PCR 35

3.2.8 Chủng nấm lên cây xương rồng 36

3.2.8.1 Tiến hành chủng bệnh trên xương rồng 36

3.2.8.2 Đánh giá kết quả 36

Chương 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 37

4.1 Tình hình bệnh hại xương rồng tại Tp Hồ Chí Minh 37

4.2 Các triệu chứng bệnh trên xương rồng 37

4.2.1 Tỷ lệ nhiễm bệnh do vi khuẩn, nấm, virus gây ra qua các vườn điều tra (số liệu điều tra tháng 04 năm 2007) 39

4.3 Phân lập mẫu nấm 40

4.4 Kết quả ly trích thu DNA tổng số từ các loài nấm Fusarium spp 41

4.5 Kết quả phản ứng PCR khuếch đại vùng tef 43

4.6 Kết quả giải trình tự vùng tef 43

4.7 Chủng bệnh trên xương rồng 50

Chương 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 52

5.1 Kết luận 52

5.2 Đề nghị 53

TÀI LIỆU THAM KHẢO 54 PHỤ LỤC 58

RFLP : Restriction Fragment Length Polymorphism

TEF : Translation elongation factor

NCBI : National Center for Biotechnology Informatic

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Hình 2.1 Hình thái bào tử nấm Fusarium spp 13

Hình 2.2 Vùng gen tef trên nấm Fusarium sử dụng trong FUSARIUM-ID 17

Hình 4.1 Xương rồng với triệu chứng thối gốc 38

Hình 4.2 Xương rồng với triệu chứng thối vàng và đen ở gốc 39

Hình 4.3 Xương rồng với triệu chứng thối thân 39

Hình 4.4 Xương rồng cắt dọc với triệu chứng thối từ lõi ra ngoài 39

Hình 4.5 Nấm phân lập từ xương rồng bệnh trên môi trường PGA 42

Hình 4.6 Sản phẩm ly trích DNA tổng số của nấm 43

Hình 4.7 Sản phẩm PCR khi khuếch đại bằng cặp primer ef1 và ef2 44

Hình 4.8 Xương rồng khỏe mạnh trước khi chủng bệnh 51

Hình 4.9 Xương rồng với triệu chứng thối sau khi chủng 51

Hình 4.10 Nấm phân lập từ xương rồng bị bệnh sau khi chủng nấm 4 ngày trên môi trường PGA 52

DANH SÁCH CÁC BẢNG VÀ ĐỒ THỊ

Bảng 2.1 Một số loài Fusarium được tìm thấy

ở Việt Nam (Đỗ Tấn Dũng, 1996) 26 Bảng3.1 Primer dùng trong phản ứng PCR 33 Bảng 3.2 Thành phần phản ứng PCR và lượng

cần dùng đủ cho một phản ứng 34 Bảng 4.1 Tỷ lệ nhiễm bệnh do vi khuẩn, nấm,

virus gây ra qua các vườn điều tra 40 Bảng 4.2 So sánh phần trăm (%) độ tương đồng

giữa dòng FC07 – 3, FC07 – 7 và FC07-10 46 Bảng 4.3 So sánh phần trăm độ tương đồng (%) giữa 3 dòng

FC07 – 3, FC07 – 7, FC07 – 10 với các dòng trên genbank 49

Chương 1 MỞ ĐẦU

1.1 Đặt vấn đề

Ngày nay, do nhu cầu đời sống của con người được nâng cao nên vấn đề thư giãn tinh thần ngày càng được coi trọng Hiện nay vấn đề chơi cây cảnh trên địa bàn Tp Hồ Chí Minh (Tp: thành phố) ngày càng phát triển trong đó có xương rồng Xương rồng đang dần được khẳng định trên địa bàn Tp Hồ Chí Minh vì chúng tương đối dễ trồng, giá cả phải chăng, ai cũng có thể chơi và chăm sóc Xương rồng dù sống trên sa mạc khô cằn vẫn nở hoa sặc sở, thể hiện một sức sống mãnh liệt Do nhu cầu của người sử dụng thích những loại xương rồng lạ nên nhà vườn thường lai tạo ra các loại cây ghép với sự đa dạng về chủng loại từ đó làm cho bệnh hại xương rồng cũng phát triển theo Xương rồng cũng bị rất nhiều mầm bệnh tấn công và hậu quả của nó là làm cho nhiều loại quí hiếm của người sưu tầm giống bị hư hại dẫn đến giảm phẩm chất, bệnh nặng và có thể chết hàng loạt gây thiệt hại cho nhà vườn và người sử dụng Các bệnh thường gặp trên xương rồng: bệnh thối gốc, bệnh đốm

than… và một trong những bệnh phổ biến nhất là bệnh thối do nấm Fusarium spp.,

bệnh này gây nguy hiểm cho tất cả các loại xương rồng

Vì vậy, vấn đề đặt ra là làm sao xác định chính xác tác nhân gây bệnh để từ đó có những định hướng đúng đắn trong việc phòng trừ bệnh, nhằm làm giảm thiệt hại và mang lại hiệu quả cho người sản xuất

Được sự chấp thuận của bộ Môn Công nghệ Sinh học Trường Đại học Nông Lâm Tp Hồ Chí Minh, dưới sự hướng dẫn của KS Dương Thành Lam và TS

Lê Đình Đôn, chúng tôi tiến hành đề tài: “Phát hiện nấm Fusarium spp gây bệnh thối xương rồng (Cactaceae) bằng kỹ thuật PCR (polymerase chain reaction)”

1.2 Mục đích - yêu cầu 1.2.1 Mục đích

Xác định tên loài Fusarium spp gây bệnh thối xương rồng nhằm tìm ra quy

trình phòng trừ hữu hiệu cho xương rồng

 Giải trình tự sản phẩm PCR

 Chủng bệnh trên xương rồng khỏe

1.3 Giới hạn của đề tài

 Đề tài được thực hiện từ 20/03/2007 đến 30/07/2007  Chỉ thực hiện được trên một số mẫu

Chương 2

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Một số đặc tính để phát triển xương rồng (theo Huỳnh Văn Thới, 2004)

Trước đây không chỉ ở nước ta mà nhiều nước trên thế giới cũng vậy, số người thích chơi kiểng xương rồng rất ít Người nào thích “sưu tập” thì số lượng cũng không nhiều

Nhưng, càng về sau, số nghệ nhân đến với kiểng xương rồng càng ngày càng nhiều, khi họ nhận ra một điều loại kiểng trụi lá này được các nhà thực vật học không ngừng lai tạo thêm nhiều cây có hình dáng lạ, và màu sắc cũng khác lạ

Xương rồng có đủ loại: cây cao có mà cây thấp cũng có, cây to cây nhỏ cũng nhiều

Theo thói quen, hễ nói đến cây kiểng, ai cũng nghĩ là trồng ở trong vườn, ngoài sân, trước hàng ba, lan can… nơi có nhiều nắng gió thông thoáng, chứ không ai nghĩ kiểng lại đem chưng bày trong nhà, nơi thiếu ánh nắng và không khí lúc nào cũng hầm hập

Với xương rồng là loại cây kì diệu, có thể sống tươi tốt trong nhà một vài tuần, thậm chí cả tháng, trong điều kiện thiếu hẳn ánh nắng, thiếu bón tươi… chính sự kì diệu này đã đưa kiểng xương rồng đến với mọi người, mọi nhà, trong đó có đông đủ cư dân thành thị

Được biết, tại nhiều nước Âu Mỹ, mãi đến những năm đầu thế kỷ XX, người ta mới khám phá ra được điều này Bởi vì trong giai đoạn này các thành phố của họ mật độ thị dân tăng cao đột ngột Từ đó, đường sá được mở rộng thêm, nhà cửa được cao tầng hơn, đất thổ cư trong thành phố còn lại bao nhiêu điều được trưng dụng vào việc cất thêm nhà cửa… Như vậy, không ai còn một khoảng đất thừa nào để trồng cây cảnh như trước đây nữa!

Vì vậy, muốn trực tiếp được sống gần gũi với thiên nhiên, muốn có cây cảnh để giải trí, giảm stress, các thị dân mới nghĩ đến… kiểng xương rồng, và đổ xô tìm mua về trồng Ai cũng biết, chỉ có xương rồng mới có khả năng sống lâu được trong nhà, lúc nào khí hậu cũng nóng và khô Mặt khác, kiểng xương rồng dùng chưng trong nhà, thấp, choáng mặt bằng không nhiều nên dùng làm vật trang trí rất thích hợp và đẹp

Xương rồng thường được trồng trong loại chậu kiểng bằng gốm sứ với nhiều kiểu dáng khác nhau So với nhiều giống cây kiểng khác, kiểng xương rồng có giá cả thường thấp hơn Vị trí đặt chậu xương rồng trong nhà cũng không cần phải cân nhắc quá kỹ Nó có thể dùng móc kẽm cột vào chậu rồi treo lên như cách treo lan…

Còn ở nước ta trong thời gian gần đây dân từ các vùng quê cũng rủ nhau lên thành phố để tìm kế sinh nhai Từ đó đẩy mật độ dân ở các thành thị tăng cao, có nơi tăng gấp hai ba lần! Việc đó dẫn đến phố phường chật hẹp người đông đúc, nhà nào còn thửa đất nhỏ để trồng cây?

Trước tình trạng đó, chắc chắn dân thành thị cũng chỉ còn cách trồng kiểng… trên bao lơn, trên sân thượng và chưng… kiểng xương rồng trong nhà mà thôi! Như vậy, ngành nghề trồng kiểng xương rồng tại nước ta sẽ có cơ hội tốt để phát triển mạnh, do đó thị trường rộng hơn

2.2 Phân loại thực vật và giới thiệu về cây xương rồng (Cactaceae) 2.2.1 Phân loại thực vật

2.2.2 Giới thiệu về cây xương rồng và các cây cùng họ

Trích theo (nguồn: http:// en.wikipedia.org/wiki/cactaceae)

Cây xương rồng thường là loại cây mọng nước thuộc họ Cactaceae (có cây ra hoa hai lá mầm) Họ Cactaceae có từ 24 đến 220 chi, tùy theo nguồn (90 chi phổ

biến nhất), trong đó có từ 1.500 đến 1.800 loài Những cây xương rồng được biết đến như là có nguồn gốc từ Châu Mỹ, nhất là ở những vùng sa mạc Cũng có một số loại biểu sinh trong rừng nhiệt đới, những loại đó mọc trên những cành cây, vì ở đó mưa rơi xuống đất nhanh, cho nên ở đó thường xuyên bị khô

 Loài cây quen thuộc có chung họ xương rồng

Quỳnh (Epiphyllum oxypetallum): Đây là loại hoa kiểng rất được nhiều

người yêu chuộng vì đặc tính hoa đẹp Hiện nay, người ta đã lai tạo được loại hoa Nhật quỳnh, loại hoa quỳnh nở cả ngày

Thanh long (Hylocereus undatus): Đây là một loại cây ăn trái Trái có mùi vị

đặc trưng, hơi chua, ngọt Vỏ trái màu từ đỏ hồng đến đỏ tía

2.2.3 Tình hình sản xuất và phát triển xương rồng ở Tp Hồ Chí Minh và trên thế giới

2.2.3.1 Tại Tp Hồ Chí Minh

Theo Trương Duy Lam (2006), từ những năm 60 của thế kỷ trước, các loại cây xương rồng đã được du nhập vào Việt Nam như Bolivia, Eriocacfus warasii… Và cho đến ngày nay, chúng là loại cây không thể thiếu trong bộ sưu tập của những người chơi xương rồng Đất Tp Hồ Chí Minh vẫn còn nổi tiếng với một bậc lão thành chuyên về các giống xương rồng đó là Bác Năm Trường ở Thủ Đức Ông đã lai tạo, nhân giống liên tục để đến hôm nay trên thị trường Việt Nam nói chung và thị trường Tp Hồ Chí Minh nói riêng có rất nhiều giống xương rồng có màu sắc hoa rất lạ và đẹp Trên địa bàn Tp Hồ Chí Minh hiện nay phần lớn xương rồng nhập từ Trung Quốc trong đó đặc biệt là các cây dùng để ghép Thực tế cho thấy càng ngày trên địa bàn Tp Hồ Chí Minh càng có nhiều hộ dân kinh doanh về xương rồng Cụ thể là theo điều tra thì cách đây hơn 10 năm số hộ trồng xương rồng để kinh doanh chỉ đếm trên đầu ngón tay nhưng ngày nay con số đó đã lên đến hàng chục hộ Phần lớn các hộ trồng xương rồng ở Tp Hồ Chí Minh không xuất khẩu vì không đủ tiêu thụ trong nước Hiện nay các hộ trồng xương rồng ở Tp Hồ Chí

Minh đa số phân phối cho các tỉnh trong nước đặc biệt là các tỉnh miền trung và nhiều nhất là vào các dịp lễ tết

Trung tâm Sinh học thực nghiệm (Viện ứng dụng công nghệ) đã nhân giống thành công cây xương rồng Nopal có nguồn gốc từ Châu Mỹ, sinh trưởng nhanh và rất thích hợp với điều kiện của vùng đất khô hạn

2.2.3.2 Trên thế giới

Theo Minh Sơn (2004), hiện nay Mỹ là một trong những nước sản xuất và có thị trường xương rồng lớn nhất thế giới Phần lớn người trồng cũng như thu hoạch tập trung ở vùng Tây Nam của quốc gia này Ba thị trường chính tiêu thụ xương rồng được sản xuất tại Mỹ là vườn ươm, siêu thị và các nhà sưu tập tư nhân Các quốc gia tiêu thụ nhiều xương rồng nhất từ sa mạc Chihuahua là Mỹ, Anh, Đức, Thụy Điển, Tây Ban Nha, Mexico, Italia và Canada Christopher Robbins cho biết: ''Ở một số vùng của sa mạc Chihuahua, thu hoạch thực vật hoang dã là hoạt động mang lại hàng triệu USD mỗi năm Một trong những động lực thúc đẩy hoạt động thu hoạch xương rồng hoang dã này, cả hợp pháp và bất hợp pháp, bắt nguồn từ nhu cầu tạo cảnh quan tại các thành phố sa mạc" Trong những năm gần đây, Châu Âu và Nhật Bản là những điểm đến phổ biến của cây, hạt và quả xương rồng hiếm, có giá trị cao Các loại xương rồng hiếm, đặc biệt là loại được tìm thấy ở vùng sa mạc thuộc chủ quyền của Mexico, có thể mang lại hàng nghìn USD Hạt xương rồng hiếm được bán với giá 7,5 USD/hạt tại Châu Âu Hiện nay số lượng xương rồng quý hiếm ở các sa mạc đã cạn kiệt do sự thiếu kiến thức của người dân và bọn buôn lậu đã nhổ cây từ các sa mạc lớn

2.2.4 Đặc tính thực vật và điều kiện sinh thái của xương rồng (theo Huỳnh Văn Thới, 2004)

2.2.4.1 Đặc tính thực vật

Xương rồng không đẹp mã bằng nhiều giống cây kiểng khác, vì chúng chỉ có một đoạn thân cây mập mạp, trơ trụi và giản dị tưởng chừng như đời sống của nó

không có gì đáng để cho mọi người quan tâm chú ý đến Thật ra, xương rồng vẫn hội đủ những đặt tính thực vật đáng để được tìm hiểu cặn kẽ

rào (chỉ có ba khía), nhưng cũng có giống 25 khía như giống Ferocactus wedzenii

Có giống khía rất cạn, nhưng cũng có giống khía sâu Giống không khía thì có múi Múi là những nốt sần lớn từa tựa như vỏ trái thơm (dứa) mà đa số các giống xương rồng hình cầu đều có dạng này

 Lông

Đa số giống xương rồng có thân trơn láng, nhưng cũng có một số giống thân

có lớp lông mịn phủ đầy, như Cephalocerus Có giống trên ngọn được phủ chụp lớp lông dài trắng xóa, gọi là giống Borzicactus

 Gai

Đa số xương rồng đều có gai nhọn và là gai chùm, cái nào cũng nhọn hoắt Nhiều giống xương rồng có nhiều gai cứng mọc tua tủa, nhưng cũng có giống gai nhỏ và mềm dịu Được biết, mới đây một chuyên viên ngành hoa kiểng ở California là ông Luther Burbank đã lai tạo ra được giống xương rồng mới không gai Gai xương rồng thường màu đen, nhưng cũng có giống gai màu vàng Gai xương rồng là biến thể của lá kèm mà thành, đây là đặc tính của đa số giống cây mọc ở vùng sa mạc quanh năm nóng cháy Và nhờ vào tiết diện gai quá nhỏ đó nên xương rồng không bị thoát nước nhanh như các giống cây kiểng có nhiều lá khác Tiêu biểu dạng gai, ví dụ:

- Xương rồng Ephorbia có nhiều gai, vừa dài vừa to, lại nhọn và cứng

- Xương rồng Echinocactus Grusonii thân có nhiều gai chằng chịt cơ hồ bao kín

mít khắp thân cây

- Xương rồng Cephalocerus có lông rất cứng nhưng ít và nhỏ, lông giấu mình

trong những nùi lông tơ trắng  Lá xương rồng

Khi nói đến xương rồng ai cũng nghĩ đến thân nó trơ trụi, không lá Thế nhưng thực tế cũng có một ít giống xương rồng có lá Có giống lá nhỏ có giống lá to, nhưng đa số lá đều có giống cuống ngắn và bản dày vì bên trong mọng nước

- Xương rồng Aeonium Holochrysum xuất xứ ở vùng Bắc Phi có nhiều lớp lá xếp

Xin đơn cử một số giống xương rồng với sắc hoa đặc trưng của nó:

- Hoa màu trắng với nhiều chấm đỏ tía điểm xuyết, có giống Turbicarpus,

xuất xứ tại Mexico

- Hoa màu bang và đỏ sậm có các giống Thelocactus (xuất xứ tại Mexico), và giống xương rồng ở vùng Texas là Homalocephala

Về vị trí hoa trổ ra trên cây Tùy giống mà có sự khác nhau Thông thường hoa mọc ra từ kẽ múi, nếu thân có dạng múi Ngược lại, nếu thân dạng khía thìhoa mọc ra ở cạnh gai (gai mọc ở mép khía) Ngay chồi con cũng vậy, thân dạng múi chồi con nẩy ra từ kẻ múi, còn thân dạng khía thì chồi con nẩy ra ở dạng gai

Cũng có giống xương rồng hoa mọc thành từng cụm ở nách lá, như các giống

EuphorbiaMilii, Euphorbia ligularia… Có giống hoa mọc trên sẹo của lá như

xương rồng Euphorbia Antiquorum

 Trái xương rồng

Xương rồng có trái hình cầu bên trong không chia thành ngăn hoặc múi và chứa nhiều hột Từ lúc xương rồng trổ hoa cho đến ngày trái chín Tùy giống, ngắn là một tháng, dài là vài ba tháng

 Hột xương rồng

Trái xương rồng chứa rất nhiều hột Cây còn nhỏ thường cho trái nhỏ, những cây trưởng thành ra trái to hơn Trong trái nhỏ chứa chừng vài chục hột, còn trái lớn chứa từ 500 hột trở lên Kích thước hột rất nhỏ, như hột é, nhỏ hơn hột mè (vừng) Tùy giống, khi chín trái già tự động tách vỏ ra để hột bên trong bắn hết ra ngoài Nhưng cũng có giống khi chín, trái cứ đeo dính trên cây, nếu không được hái thì chờ đến lúc vỏ trái bị mục hột mới phân tán ra ngoài Hột vừa chín có thể đem gieo ngay, và tỷ lệ nảy mầm rất cao

2.2.4.2 Điều kiện sinh thái

Xương rồng có nguồn gốc nguyên thủy ở vùng sa mạc, nơi có thời tiết vô cùng khắt nghiệt, ngày rất nóng và đêm rất lạnh, đất đai lại cằn cỗi

Vì vậy, xương rồng không kén đất trồng, thích nghi được với các nước vùng nhiệt đới, quanh năm có khí hậu nóng ẩm Tại nước ta, vùng nào cũng có thể trồng

được kiểng xương rồng nhưng, thích hợp nhất là các tỉnh Nam Bộ trong đó có Tp Hồ Chí Minh, nơi có khí hậu khô, nóng và lượng mưa trong năm không nhiều

Xương rồng vẫn chịu đựng được với vùng có khí hậu lạnh khoảng 100C, nhưng chúng sinh trưởng yếu và phát triển chậm Còn ở những vùng có khí hậu nóng ẩm thì sự sinh trưởng và phát triển của chúng bình thường Trong điều kiện khô hạn, xương rồng có thể chịu đựng được vài ba tháng liền mà sức khỏe của cây không bị suy giảm Đó là ưu điểm của nó khi đem trồng trong nhà

 Lượng mưa

Những vùng nào có lượng mưa ít trong năm đều thích hợp cho việc trồng xương rồng, nghĩa là nó chỉ cần lượng mưa từ 1.000 mm trở xuống mới tốt Vùng nào mưa nhiều, nhất là mùa mưa thường kéo dài thì nên trồng xương rồng trong nhà kính hoặc dưới giàn che Có thể nói trồng xương rồng trong vùng ít mưa vẫn tốt, miễn là thỉnh thoảng được tưới để đất trồng đủ độ ẩm cần thiết là được

Xương rồng không thích hợp với mưa to gió lớn Do bộ rễ quá yếu nên cây dễ ngã đổ hoặc nghiêng ngã khi gặp ngọn gió to Vì vậy, với giống xương rồng có

thân cao to như các giống Euphorbia, Ercobaria, hoặc các giống Opuntia Dillenii

Opuntia ficus Undia, khi cây trưởng thành nên làm trụ chống đỡ cho khỏi đổ ngã

Ngay các giống xương rồng có thân dài leo cao như Rhodcactus Scuelata và

Rhodcactus grandifolius cũng có cây chống đỡ mới mọc thẳng lên được Xương

rồng chịu được ánh sáng trực xạ Trồng vào nơi có nắng nhiều cây càng sinh trưởng tốt, kích thích sự ra hoa nhiều hơn và màu sắc hoa được tươi tắn hơn Do xương rồng là giống cây có nguồn gốc vùng sa mạc, quanh năm có thời tiết khắc nghiệt nhất, nên dù có gặp mùa nắng hạn vùng nhiệt đới kéo dài, cây vẫn đủ sức chống chọi Nên tưới nước để giữ được độ ẩm cần thiết giúp cây sinh trưởng tốt hơn

 Nhiệt độ

Xương rồng chịu đựng được nhiệt độ cao, vì vậy trồng xương rồng trong nhà nhiều ngày liền, lúc nào nhiệt độ cũng khô, nóng nhưng chúng vẫn sống tươi tốt Với vùng nhiệt độ thấp, xương rồng vẫn chịu đựng được, mặc dầu sự sinh trưởng có phần chậm lại

Nguyên nhân gây bệnh thối gốc xương rồng là do nấm lưỡi liềm (Fusarium

oxysporum Schlecht) thuộc lớp nấm bào tử sợi gây ra Bào tử không màu hình lưỡi

liềm có 3 – 4 vách ngăn, kích thước 19 – 50 x 2,5 – 5 µm Nhiệt độ thích hợp cho nấm sinh trưởng là 25 – 30°C (Trần Văn Mão, Nguyễn Thế Nhã, 2002)

Theo Ik Hwa Hyun, Sang Dok Lee và ctv (1998), một loài Fusarium được

phân lập từ xương rồng có triệu chứng thối rửa ở tỉnh Koyang, Kyonggi năm 1997

Mầm bệnh này được xác định là Fusarium oxysporum dựa trên đặc điểm nấm học

Triệu chứng thối xuất hiện dưới đất và vòng thương tổn chiếm khoảng 1 – 3 cm đường kính, xuất hiện trên gốc xương rồng Hình dạng nấm bệnh có cả dạng tiểu bào tử và đại bào tử Dạng tiểu bào tử chiếm nhiều hơn cả, từ dạng oval đến dạng bầu dục Đại bào tử có hình lưỡi liềm, có 3 – 5 vách ngăn Màu sắc khuẩn lạc trên môi trường PGA là màu trắng, màu đào hoặc màu tía Mầm bệnh có thể là nguyên nhân gây nên triệu chứng thối trên gốc xương rồng ghép cũng như xương rồng không ghép

2.2.5.2 Bệnh đốm than

Bệnh đốm than (bệnh thán thư) trên xương rồng phát sinh khá phổ biến, bệnh nặng có thể làm cây chết khô Cây bị bệnh thường có đốm nhiều nước màu nâu nhạt Đốm bệnh dần dần lõm xuống lúc ẩm ướt trên đốm bệnh xuất hiện các chấm

đen nhỏ lồi lên đó là thể quả nấm Bệnh do nấm đĩa gai (Colletotrichum sp) thuộc

lớp bào tử xoang, bộ bào tử đĩa đen gây ra Đĩa bào tử nhỏ, có lông cứng mọc rãi rác, bào tử đơn bào không màu hình bầu dục dài, kích thước 10,8 – 14,4 x 3,5 – 4,3 µm Bệnh này thường gặp vào đầu mùa hạ và đầu mùa đông Những loại xương rồng cầu màu vàng rất nhạy cảm với bệnh này (Trần Văn Mão, Nguyễn Thế Nhã, 2002).

2.2.5.3 Tuyến trùng hại xương rồng

Theo Trần Văn Mão, Nguyễn Thế Nhã (2002), bệnh tuyến trùng hại xương rồng chủ yếu trên xương rồng 6 cạnh Ngoài ra còn phát sinh trên hải đường, mào gà, hướng dương, hoa hồng Trên rễ chính và rễ bên hình thành nhiều u bướu nhỏ, lúc đầu nhỏ về sau thô dần, cắt u thấy có nhiều hạt nhỏ màu trắng đó là tuyến trùng cái Bệnh có thể làm cho cây chết khô Bệnh tuyến trùng hại xương rồng do

Meloidogyne incognita chitwood Nhiệt độ thích hợp cho sinh trưởng phát triển là

20 – 250C Đất ẩm có lợi cho sự di chuyển của tuyến trùng đi tìm thức ăn và xâm nhập vào rễ cây Nước mưa, nước mương dẫn, hoạt động con người có thể mang tuyến trùng lây lan

2.2.5.4 Rệp sáp hại xương rồng

Rệp sáp hại xương rồng (Diaspis echinocacti Bouche) thuộc bộ cánh đều họ

rệp sáp hình thuẫn Chúng dùng miệng chích hút để hút nhựa cây xương rồng ảnh hưởng đến sinh trưởng của cây Mỗi năm phát sinh 2 – 3 lứa, tháng 5 – 7 và tháng 10 năm sau đều có rệp gây hại.(Trần Văn Mão, Nguyễn Thế Nhã, 2002)

2.3 Sự phân loại, phân bố, phạm vi kí chủ, đặc điểm phát sinh phát triển và

khả năng gây bệnh của nấm Fusarium

2.3.1 Sự phân loại

Bộ (Order) Hypocreales

(Nguồn:http:// en.wikipedia.org/wiki/Fusarium)

Hình 2.1 Hình thái bào tử nấm Fusarium spp

a Nấm có dạng hình lưỡi liềm b Vách ngăn

(Nguồn:http://www.botany.utoronto.ca/ResearchLabs/MallochLab/Malloch/Moulds/Illustrations/Fusarium_drawing.jpg)

Nấm Fusarium thuộc lớp nấm bất toàn (Deuteromycetes), giai đoạn sinh sản hữu tính là gibberella thuộc lớp nấm nang (Ascomycetes) Có tế bào sinh bào tử trần Fusarium đặc trưng bởi hệ sợi nấm ngăn vách màu trắng hoặc có một số màu khác nhưng thường có màu trắng Nấm Fusarium có cành bào tử phân sinh, giá trần

bào tử đơn độc hoặc tụ họp trong các đệm giá (Sporodochia) hoặc thành đệm cho giá nhầy (Pionnetes) đơn hoặc phân nhánh, các tế bào sinh bào tử trần là các thể bình đơn độc hoặc thành cụm trên đỉnh giá bào tử trần, đỉnh các nhánh của giá hoặc trực tiếp trên thân giá, trên các sợi nấm không phân hóa hình thái Bào tử trần thường ẩm ướt tụ họp thành khối cầu ở đỉnh thể bình hoặc hình chuối Nấm có 2 dạng bào tử: bào tử trần lớn (Macroconidia) và bào tử trần nhỏ (Microconidia) Bào tử trần lớn có một đến nhiều vách ngăn, hình lưỡi liềm có hoặc không có gót ở ngăn gốc Bào tử trần nhỏ không có hoặc có 1 – 2 vách ngăn, hình elip, hình trứng, hình trụ, hình gần cầu, thường không màu hoặc màu trắng nhạt

2.3.2 Sự phân bố

Theo Bùi Xuân Đồng (1986), nấm bệnh phân bố rất rộng trên khắp thế giới,

nấm Fusarium gây thiệt hại trên các loại cây trồng và gây ảnh hưởng rất lớn đến

kinh tế, đặc biệt ở vùng Châu Phi, Châu Mỹ và các nước như: Australia, Panama, Hawaii, Philippines, Taiwan và các nước Đông Nam Á

Bệnh do nấm Fusarium được phát hiện vào năm 1809 do nhà bác học Link,

H.F Sau đó vào năm 1821 được nhà bác học Fries, E bổ sung thêm

2.3.3 Phạm vi kí chủ

Theo Bùi Xuân Đồng (1986), nấm Fusarium có rất nhiều dòng khác nhau

nên khả năng ký chủ rất rộng trên nhiều loại cây trồng như: cây ăn trái, cây rau màu và một số cây hoa cảnh, có thể sống trong các điều kiện khác nhau và có thể tồn tại trong đất một thời gian dài, trong các xác bã thực vật dưới nhiều dạng khác nhau, bào tử nấm có thể tồn tại trong các điều kiện khắc nghiệt một thời gian dài sau đó gặp điều kiện thuận lợi sẽ phát triển và lây lan

Nấm gây hại nặng trên một số cây trồng đặc biệt là trên cây ăn trái như: chuối, xoài, nhãn, nho, ổi, cam quýt, đu đủ, bơ… Ngoài ra, có một số dòng nấm

Fusarium gây bệnh cho người và động vật như: gây ung thư họng ở người và ung

thư bán cầu đại não trên ngựa và chuột (Thiel, P.G và ctv, 1991)

2.3.4 Đặc điểm phát sinh phát triển của nấm Fusarium

Theo Bugnicourt F (1939), nấm Fusarium có phổ kí chủ rất rộng trong các

điều kiện khác nhau và có khả năng phát triển trong khoảng nhiệt độ 5ºC– 400C

2.4 Khả năng gây hại của nấm Fusarium spp và biện pháp phòng trừ

2.4.1 Khả năng gây hại

Lester W Burgess và ctv, (1988), đại học Sydney (Australila) xác định 13 nhóm, 20 loài gây hại trên một số cây trồng sau:

Loài F latertium: được phân lập trên cây dâu bị bệnh khô đen nhánh,

trên cây Celosia bị bệnh thối thân Một vài phân lập được ghi nhận chúng hiện diện trên cây cà phê ở Papua, New Guinea

Loài F decemcellulare: loài này thường hiện diện ở vùng nhiệt đới và á

nhiệt đới Chúng được phân lập từ những cây bị bệnh loét, khô cành Từ các cây ca cao bị bướu ở Nam Mỹ

Loài F moniliforme: loài này thường xuất hiện ở vùng khí hậu ấm Chúng

thường được phân lập từ những cây có triệu chứng bệnh thối thân, thối bắp, thối rễ cây Sorghum (Burgess, 1986), thối ngọn ở cây mía, gây hư hỏng hạt lúa Loài này có khả năng nhiễm vào hạt giống của một vài cây kí chủ như: ngô, lúa… Chúng có khả năng tạo ra độc tố moniliformin (Vesonder và Hesseltine, 1981)

Loài F solani: là loài có khả năng sống trong đất, phân bố trên phạm vi toàn

thế giới, xuất hiện ở các vùng mưa nhiều và đất thoát nước kém Là loài phổ biến nhất ở các vùng nhiệt đới và á nhiệt đới Chúng gây thối rễ, cổ rễ của nhiều loại cây trồng: đậu, cà chua Gây thối củ, gây bệnh loét, chết khô của nhiều loại cây trồng ( Nelson, 1981)

Loài F oxysporum: loài này phổ biến trong đất canh tác ở vùng ôn đới và

nhiệt đới Loài này gồm nhiều dòng khác nhau và gây bệnh nghiêm trọng: gây héo mạch dẫn (Beckman, 1987), gây thối rạp cây con ( Nelson, 1981), gây thối rễ và cổ rễ (Jarvis và Shoemmaker, 1978) Loài này có hơn 100 dòng khác nhau và bệnh héo là một vấn đề quan trọng

Loài F sambucinum: loài này thường được phân lập từ rễ cây thông và nhiều

cây khác bị bệnh rễ

Loài F semitectum: loài này rất phổ biến trong đất nông nghiệp, ở các vùng

nhiệt đới và ôn đới Chúng được phân lập từ các bộ phận dưới đất: thân, rễ, củ và các bộ phận trên mặt đất

Theo Booth (1973), phân lập và nghiên cứu loài Fusarium Một số loài được

trích dẫn dưới đây:

Loài F solani: loài này được phân lập từ các cây bị vết thương hoặc từ các cây bị nhiễm các loài nấm Phythium, Phytophthora, Rhizoctolani và các loài

Fusarium khác Loài này cũng gây hư hại nhiều loại thực phẩm

Loài F solani f sp batatas: gây hại trên cây khoai lang Loài F solani f sp cucuritae: gây hại trên cây mía Loài F solani f sp phaceoli: gây hại trên cây đậu hà lan

Loài F decemcecllulare: loài này được phân lập trên nhiều loại cây trồng ở

nhiều nước khác nhau: Trung Quốc, Ấn Độ, Malaysia, Indonesia…

Loài F semitectum: loài này rất phổ biến ở các vùng nhiệt đới và á nhiệt đới

Được phân lập trên cây cà chua, ngô, chuối, đậu phộng…

Loài F moniliforme: loài này gây thối cây con, gây mốc hạt gạo, gây thối rễ

cây bông vải, gây thối các cơ quan cây ngô, thối ngọn mía, xâm nhập vào hoa, quả cây chuối Loài này có hơn 110 dòng khác nhau và có tính độc khác nhau Một số dòng có tính độc được phân lập từ cây ngô ở Mỹ, khả năng gây bệnh phụ thuộc vào chu kỳ sống của nấm và điều kiện ngoại cảnh Chúng có khả năng tạo ra gibberellia kích thích sự phát triển cây trồng

2.4.2 Một số biện pháp chủ yếu để phòng trị nấm Fusarium spp

2.4.2.1 Sử dụng cây giống kháng bệnh

Theo Bùi Xuân Đồng (1986), khi trồng phải xem xét điều kiện sinh thái đất đai mà chọn các giống thích hợp cho từng điều kiện của vùng và cần xem xét thường xuyên về những thay đổi tính chống chịu của giống

2.4.2.2 Biện pháp canh tác

Theo Bùi Xuân Đồng (1986), biện pháp này rất quan trọng để phòng trừ nấm

Fusarium Trước khi trồng phải làm đất kỹ, xử lý đất, bón phân hợp lý, luôn vệ sinh

vườn sạch, thoáng mát Nếu phát hiện bệnh phải thu gom các bộ phận bị bệnh đi tiêu hủy tránh sự lây lan trong vườn, chăm sóc kỹ cho từng giai đoạn sinh trưởng của cây Cần ngăn chặn di chuyển những cây bị bệnh từ vùng này sang vùng khác

tránh được mầm bệnh ban đầu Khi cây bị bệnh có thể đào bỏ, xử lý đất bằng vôi hay một số loại thuốc trừ nấm khác

2.4.2.3 Biện pháp hóa học

Theo Bùi Xuân Đồng (1986), trên một số cây trồng có thể sử dụng một số thuốc hóa học trừ nấm khi cây bị nhiễm bệnh như: Metazeb, Benomyl, Rovral, Ridomil, Copper và một số thuốc khác, liều dùng như khuyến cáo Sử dụng thuốc trên bằng cách phun hoặc tưới vào gốc cây bị bệnh một vài lần cách nhau 7 – 10 ngày

2.5 Tổng quan về vùng tef trên genome của nấm Fusarium

Hình 2.2 Bản đồ vùng gen tef trên nấm Fusarium sử dụng trong FUSARIUM- ID

Theo David M Geiser và cộng sự (2004), gen tef giải mã một số protein thiết

yếu cho bộ máy dịch mã, có tính hữu ích cao trong nghiên cứu sự phát sinh loài vì

nó mang thông tin cao ở mức độ loài của Fusarium Gen này lần đầu tiên được sử

dụng như một marker trong nghiên cứu phát sinh loài để suy ra mối tương quan và mức độ di truyền giữa các loài (Cho và ctv, 1995; Mitchell và ctv, 1997) Primer lần đầu tiên được phát triển trên nấm để khám phá và kiểm tra chuỗi thế hệ của các

dòng Fusarium oxysporum (O` Donnell và ctv., 1998) Primer ef1 và ef2 được thiết kế dựa trên một phần vị trí exons giữa Trichoderma reesei và Histoplasma

capsulatum Các primer này có thể khuếch đại vùng 700 bp của gen tef flanking với

3 intron mà tổng số hơn nữa chiều dài của đơn vị siêu sao chép trong tất cả các loài đã biết (hình 2.2) Gen này xuất hiện phù hợp với số lượng copy đơn trên nấm

Fusariium, và nó thể hiện mức độ cao của các trình tự đa hình giữa các loài có quan

hệ mật thiết, ngay cả trong so sánh các phần của gen giải mã protein như là

calmodulin, beta-tubulin và histon H3 Vì các lý do đó, tef đã trở thành marker chọn lọc như là công cụ xác định single - locus trên nấm Fusarium

Ngoài nấm Fusarium thì trên các loại nấm khác chẳng hạn như nấm

Trichoderma cũng có vùng tef Trên nấm này vùng tef cho kết quả chính xác hơn là

dựa vào vùng rDNA-ITS vì các loài vẫn có sự tương đồng về trình tự trong vùng

rDNA-ITS Tef hữu ích trong việc xác định vùng gen chuyên biệt như vùnggen mã hoá actin, calmodulin, endochitinase, nó còn cho phép phân biệt được giữa các

nhóm với nhau hay giữa loài cùng nhóm Trong phòng thí nghiệm, vùng tef được

quan tâm và khuếch đại đoạn gene có kích thước khoảng 600 bp (Gary J Semuels) (trích dẫn bởi Lại Hà Tố Hoa, 2006)

Một nhóm nghiên cứu gồm Bogale, Mesfin và ctv (2007), đã sử dụng trình

tự gen tef để thiết kế primer chuyên biệt cho các loài Fusarium redolens và trong kỹ thuật PCR- RFLP để phân biệt giữa 3 loài Fusarium oxysporum cùng một tổ tiên chung Gần đây hình thái học và các kỹ thuật chẩn đoán phân tử về nấm Fusarium

redolens và 3 dòng Fusarium oxysporum phát sinh loài từ một tổ tiên chung còn mơ

hồ Do đó trình tự gen tef từ những loài này và các loài có mối quan hệ mật thiết với chúng được sử dụng để thiết kế primer chuyên biệt cho loài F redolens, và để xác định vị trí giới hạn phân biệt giữa 3 loài F oxysporum có chung một tổ tiên

2.6 Ứng dụng kỹ thuật PCR trong phát hiện nấm

Kỹ thuật PCR (polymerase chain reaction) được mô tả bởi Kary Mullis và các cộng sự (1985)

2.6.1 Khái niệm

Đây là phương pháp in vitro để tổng hợp DNA dựa trên khuôn là một trình

tự đích DNA ban đầu, khuếch đại, nhân số lượng bản sao của khuôn này thành hàng triệu bản sao nhờ hoạt động của enzyme polymerase và cặp primer đặc hiệu cho đoạn DNA cần được khuếch đại

Tất cả các DNA polymerase khi hoạt động tổng hợp một mạch DNA mới từ mạch khuôn đều cần sự hiện diện của những primer chuyên biệt

Mạch khuôn thường là một trình tự DNA của bộ gen (gọi là trình tự DNA mục tiêu) đặc trưng cho từng loại vi sinh vật mục tiêu hoặc gen quy định việc tổng hợp một loại độc tố chuyên biệt của vi sinh vật

Primer là những đoạn oligonucleotide có khả năng bắt cặp bổ sung vào đầu 3’ của khuôn, DNA polymerase sẽ nối dài primer để hình thành mạch mới (Bùi Trang Việt, 2002)

2.6.2 Nguyên tắc

Sự khuếch đại được thực hiện nhờ chu trình nhiệt lặp lại

Phản ứng PCR gồm nhiều chu kỳ lặp lại nối tiếp nhau Mỗi chu kỳ gồm 3 giai đoạn:

Giai đoạn 1: (giai đoạn biến tính: tách sợi đơn DNA, denaturation) Ở điều kiện

nhiệt độ cao phân tử DNA từ mạch đôi tách ra thành dạng mạch đơn và nhiệt độ cần thiết để biến tính hoàn toàn DNA thường là 94 – 950C trong 30 – 60 giây

Giai đoạn 2: (giai đoạn bắt cặp giữa primer và khuôn, anealation) Khi nhiệt độ hạ

xuống thấp hơn nhiệt độ nóng chảy Tm của primer, primer sẽ bắt cặp với mạch khuôn tại vị trí có trình tự bổ sung với primer Nhiệt độ cho giai đoạn này là 50 – 640C

Giai đoạn 3: (giai đoạn tổng hợp, kéo dài, elongation) Nhiệt độ tăng lên 720C, ở

nhiệt độ này Taq DNA polymerase hoạt động tối ưu Trong khoảng 30 giây cho đến vài phút tùy theo kích thước cần khuếch đại Khi đó Taq DNA polymerase tổng hợp

mạch DNA mới dựa trên trình tự của mạch khuôn, độ dài đoạn khuếch đại là khoảng cách giữa hai primer đơn đã bắt cặp với 2 DNA khuôn mạch đơn, các nucleotid lần lượt được gắn vào mỗi đầu DNA khuôn sợi đơn, gắn kế tiếp các nucleotid của primer và chiều bổ sung là 5’ ở trên cả 2 DNA sợi đơn Trong phản ứng PCR một chu kỳ gồm 3 giai đoạn như trên sẽ được lặp đi lặp lại nhiều chu kỳ và làm gia tăng số lượng DNA theo cấp số nhân Sự khuếch đại này được tính như sau:

Tổng số DNA khuếch đại= m x 2n

Trong đó:

n là số chu kỳ thực hiện

m là số bản sao của chuỗi trình tự DNA cần nhân ra

Yếu tố quan trọng nhất trong phản ứng PCR là nhiệt độ nóng chảy của primer Tm Trong số 3 giai đoạn trên, giai đoạn 2 quan trọng nhất bởi vì trong giai đoạn này sự lai DNA – DNA giữa primer và khuôn xảy ra Nếu nhiệt độ chọn cho phản ứng quá thấp thì việc lai DNA sẽ bị nhiều lỗi Nếu nhiệt độ chọn cho phản ứng quá cao thì không lai được DNA Vì thế để thiết lập nhiệt độ cho phản ứng PCR người ta xác định nhiệt độ nóng chảy Tm với từng nhóm primer như sau:

Tm= 4 x (G+X) + 2(A+T)0C

2.6.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến kết quả phản ứng PCR  DNA khuôn

DNA khuôn dùng trong phản ứng PCR phải thật tinh sạch nhưng đôi khi kỹ thuật này cũng cho phép khuếch đại DNA thu được trực tiếp từ dịch trích tế bào mà vẫn cho kết quả tốt, thông thường phương pháp này được áp dụng trong chẩn đoán Lượng DNA khuôn dùng trong phản ứng PCR phải thật nhỏ khoảng 1 g Nếu lượng DNA khuôn quá cao có thể tạo ra những sản phẩm phụ không mong muốn hay còn gọi là dương tính giả

 Enzyme

DNA polymerase dùng trong phản ứng PCR phải là enzyme chịu nhiệt cao:

Taq polymerase được tách chiết từ vi khuẩn Thermus aquaticus (vi khuẩn suối nước

nóng) Taq polymerase quá cao sẽ thấy hiện tượng tổng hợp DNA do phản ứng giả

của primer trên dây đơn, đây là những kết quả không chuyên tính sẽ làm sai lệch kết

quả, còn nếu nồng độ Taq polymerase quá thấp sẽ không có đủ số lượng enzyme để

xúc tác tạo ra sản phẩm PCR theo ý muốn

 Primer và nhiệt độ lai

Primer có vai trò rất quan trọng trong tiến trình khuếch đại của phản ứng PCR Việc thiết kế và chọn primer phải đáp ứng đủ các yêu cầu sau:

 Trình tự primer được chọn sao cho không có sự bắt cặp bổ sung giữa primer “xuôi” và primer “ngược”, không có những cấu trúc “primer dimer” do sự bắt cặp bổ sung giữa các thành phần khác nhau của một primer

 Nhiệt độ nóng chảy Tm của primer xuôi và primer ngược không được cách biệt quá xa Thành phần nucleotide của các primer phải cân bằng tránh lặp đi lặp lại nhiều lần

 Các primer phải đặt trưng cho trình tự DNA cần khuếch đại, không trùng với trình tự lặp lại trên gen

 Các thành phần khác trong phản ứng PCR

Bốn loại nucleotide (dNTP) thường được sử dụng ở nồng độ là 200 nM/mỗi loại nucleotide Nếu nồng độ cao hơn dễ dẫn đến sản phẩm khuếch đại dương tính giả hay tạp nhiễm Sự mất cân bằng trong thành phần các nucleotide lại làm tăng các lỗi sao chép của polymerase

Nồng độ Mg2+ cao hay thấp đều tạo ra các ảnh hưởng rất khác nhau trong phản ứng PCR

 Số lượng chu kỳ phản ứng

Số chu kỳ trong phản ứng thông thường không được vượt quá 40 chu kỳ Do phản ứng PCR diễn tiến qua hai giai đoạn Giai đoạn đầu số lượng bản sao tăng theo cấp số nhân tỉ lệ với lượng mẫu ban đầu, sau đó hiệu quả khuếch đại giảm hẳn vì những nguyên nhân sau: sự phân huỷ và cạn kiệt các thành phần của phản ứng, sự xuất hiện các sản phẩm phụ làm ức chế phản ứng khuếch đại, các bản sao vừa được tổng hợp không bắt cặp với mồi mà chúng tự bắt cặp với nhau Số chu kỳ cho một phản ứng còn phụ thuộc vào số lượng mẫu ban đầu

2.6.4 Ứng dụng của PCR

Hiện nay thành tựu của PCR mở ra nhiều triển vọng cho sinh học phân tử với nhiều ứng dụng trong sinh học, y khoa, nông nghiệp, kiểm nghiệm vi sinh vật gây bệnh: thực phẩm, bệnh phẩm, mỹ phẩm, nước, phát hiện pháp y, điều tra tội phạm Ứng dụng PCR để sản xuất những mẫu dò dùng trong phương pháp lai phân tử, xác định các trình tự acid nucleic, tạo các đột biến điểm định hướng

Hơn thế nữa PCR còn được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực khác như:

 Trong nghiên cứu genome học

Nhân bản vô tính với PCR Recombinant PCR

Kỹ thuật footprinting DnaseI Multiplex PCR

HLA DNA (các kháng nguyên bạch cầu người)

2.7 Giới thiệu sơ lược về kỹ thuật DNA sequencing

Kỹ thuật DNA sequencing là công trình được công bố bởi Maxam và Gilbert (1977) Tuy nhiên hơn 20 năm qua kỹ thuật này được cải tiến rất nhiều Đặc biệt với sự trợ giúp của computer, kỹ thuật huỳnh quang, tiến bộ của phương pháp PCR và kỹ thuật điện di, kỹ thuật DNA sequencing trở thành công cụ rất có giá trị, làm nền tảng cho phân tích genome

Khái niệm: Kỹ thuật DNA sequencing là kỹ thuật xác định tất cả những hợp phần do nucleotid hình thành nên phân tử DNA (Alphey, 1997)

2.8 Một số nghiên cứu trong và ngoài nước về bệnh do nấm Fusarium spp

2.8.1 Trên thế giới

Tuy hiện nay các kỹ thuật công nghệ sinh học rất phát triển nhưng dường như việc ứng dụng các kỹ thuật này để định danh hay chẩn đoán bệnh do nấm

Fusarium spp gây hại trên xương rồng rất ít Và theo chúng tôi tìm hiểu thì chưa

thấy có tài liệu nào nói về kỹ thuật sinh học phân tử trong việc chẩn đoán, phát hiện

nấm Fusarium spp gây bệnh trên xương rồng Chỉ có chẩn đoán và phát hiện nấm

Fusarium spp bằng biện pháp sinh học phân tử trong một số lĩnh vực như là:

Ralph A Wang, Yi-Hong và cộng sự, (2002) đã sử dụng phương pháp PCR

để phát hiện genotype kháng Fusarium gây bệnh héo trên cây trồng Nghiên cứu

này nhằm mục đích phát hiện genotype của cây họ bầu bí kháng hay mẫn cảm với

sự nhiễm Fusarium Các nhà nghiên cứu này đã sử dụng phương pháp PCR để

khuếch đại DNA mẫu, sử dụng cặp mồi AM hoặc FM Sản phẩm PCR từ các cặp mồi khác nhau về kích cở, phụ thuộc vào DNA mẫu thu được từ cây mẫn cảm hay

kháng nấm Fusarium, nghiên cứu đã xác định nhanh và chính xác kiểu gen của cây

trồng

Hirano, Yasushi và ctv (2006), đã sử dụng phương pháp PCR để phân biệt

Fusarium oxysporum f sp lycopersici và radicis-lycopersici và loài F oxysporum

f sp lycopersici gây bệnh trên cây cà chua Bằng cách so sánh một phần trình tự

của gen mã hóa enzyme endopolygalacturonase (pg1) và enzyme

exopolygalacturonase (pgx4) phân lập từ F oxysporum f sp lycopersici (FOL) và

radicis-lycopersici (FORL) ở Nhật Bản và thiết kế các primer chuyên biệt (uni,

sp13, sp23, and sprl) trên các nucleotide khác nhau của các loài gây bệnh PCR với primer uni khuếch đại đoạn gen dài 670 - 672 bp từ FOL và FORL Với primer sp13, chỉ thu được từ loài FOL 1 và 3 Với primer sp23, đoạn gen 518 bp thu được từ loài FOL 2 và 3 được khuếch đại Primer sprl cho sản phẩm khuếch đại dài 947 bp, từ loài FORL , nhưng không cho sản phẩm ở loài FOL

Yli - Mattila T., Paavenen S và ctv (1996), đã sử dụng phương pháp

Isozyme và RAPD-PCR trong phân tích sự đa hình các dòng Fusarium avenceum ở

Phần Lan Kỹ thuật izozyme và RAPD - PCR được so sánh trong nghiên cứu đa

hình giữa 33 dòng Fusarium avenaceum sử dụng phương pháp điện di trên gel

polyacrylamide và điện di trên gel agarose Kỹ thuật isozyme đã phát hiện được 5 sự đa hình và độ tương đồng là 70%, còn phương pháp RAPD - PCR cho phép phân

tích tất cả các dòng của F avenaceum Kết quả phenotype từ phân tích

RAPD - PCR được chia thành 5 nhóm chính bằng phân tích trung bình cộng và độ tương đồng là 55%

Chiocchetti Annalisa và ctv, (1999) đã sử dụng phương pháp PCR để phát

hiện Fusarium oxysporum f sp basilici trên cây húng Bằng cách sử dụng 69 trình tự DNA được khuếch đại, tạo ra từ sự phân lập các dòng Fusarium oxysporum f sp

basilici khác nhau, F oxysporum f sp basilici được kiểm tra bằng phương pháp dot

blot Một trình tự dài 1038 bp được lai DNA từ tất cả các dòng F oxysporum f sp

basilici nhưng không thu được đoạn DNA từ các dòng F oxysporum phân lập từ

các cây húng không mang bệnh hoặc các dạng đặc biệt khác điển hình của

F oxysporum, hoặc từ sự phân lập các loài F redolens, F tabacinum, Rhizoctonia

solani, Sclerotinia sclerotiorum, S minor, và Pythium ultimum thu được từ các cây

húng bị bệnh Trình tự này được tạo dòng và đọc trình tự, 3 cặp mồi chuyên biệt của

F oxysporum f sp basilici được thiết kế, lần lượt cho sản phẩm khuếch đại là

943, 382, và 330 bp Kỹ thuật nested PCR cho phép phát hiện F oxysporum f sp

basilici từ hạt bị bệnh và hạt bị nhiễm bẩn do tự nhiên hoặc nhân tạo

R N Crowhurst và cộng sự (1991), đã phân biệt sự khác nhau giữa nấm

Fusarium solani f sp cucurbitae loài 1 và 2 bằng kỹ thuật RAPD Phương pháp

này sử dụng để đánh giá sự đa dạng về genome giữa 21 dòng F solani f sp

cucurbitae loài 1 và loài 2 7 sản phẩm đa hình nhờ RAPD đã sử dụng probe trong

lai Southern genomic DNA trong đó 6 của 7 probe trong lai phân tử được sao chép trong giải trình tự đơn và 5 của 7 probe biểu hiện một sự lai chuyên biệt

Một nhóm nghiên cứu người Pháp (2000), đã sử dụng probe rDNA

oligonucleotide và phương pháp PCR để phát hiện nấm Fusarium oxysporum Kỹ

thuật PCR và lai phân tử được phát triển để phát hiện Fusarium oxysporum Các dữ

liệu trên trình tự từ rRNA 28S, 2 primer (PFO2 và PFO3) và probe 20 – mer được

thiết kế Những oligonucleotide này được kiểm tra trên 16 dòng F oxysporum và 80 dòng của 23 loài Fusarium khác hoặc của 8 loài từ giống nấm khác Phương pháp PCR để khuếch đại đoạn DNA chuyên biệt từ các dòng F oxysporum sử dụng các

primer PFO2 và PFO3 Khi ở dưới điều kiện cho phép, không thu được sản phẩm

PCR từ các primer này trên 80 dòng nấm khác Probe oligonucleotide HFO1 được đánh dấu bằng phương pháp phóng xạ tự ghi và đánh giá sự khác biệt trong các thử nghiệm lai dot blot với rRNA khuếch đại bởi PCR Dưới điều kiện khách quan, lai

probe với DNA từ các dòng F oxysporum cho kết quả tốt

John Paul Jone và Pat Crill (1974), nghiên cứu tính kháng bệnh héo do

Fusarium gây ra trên cây cà chua nhận thấy rằng giống M.A.160 và một số dòng

khác mang gen I có khả năng kháng loài F oxysporum f sp lycopersici Một số

dòng khác không mang gen này sẽ bị nhiễm bệnh

Nhóm nghiên cứu của Matias Pasquali, Alberto Acquadro và ctv (2004), đã nghiên cứu đề tài: Sự phát triển primer để tiến hành PCR phát hiện một loài

Fusarium oxysporum mới gây bệnh trên cây cúc Pari Cặp primer Mg5/Mg6 có thể

xác định một cách chuyên biệt 9 dòng Fusarium oxysporum được kiểm tra từ

A.frutescens, khi DNA genome của nấm được sử dụng như mẫu để kiểm tra Ngoài ra, cặp primer Mg5/Mg6 cho phép phát hiện thành công các mô gốc và rễ mang bệnh từ cây không mang triệu chứng bệnh bên ngoài

Một nhóm nghiên cứu gồm Zhenggang Zhang và cộng sự (2005),đã sử dụng

phương pháp phân tử để phát hiện Fusarium oxysporum f sp niveum và

Mycosphaerella melonis nhiễm trong mẫu thực vật và đất Với việc phát triển 2 loại

PCR chuyên biệt để phát hiện nhanh và chính xác nấm gây bệnh Fusarium

oxysporum f sp niveum và Mycosphaerella melonis trên mẫu thực vật và mẫu đất

2 cặp primer chuyên biệt, 2 và Mn-1/Mn-2 được tổng hợp Primer

Fn-1/Fn-2 single PCR khuếch đại chỉ cho band khoảng 3Fn-1/Fn-20 bp từ F oxysporum f sp.niveum, và primer Mn-1/Mn-2 cho sản phẩm PCR khoảng 420 bp từ M melonis

2.8.2 Tại Việt Nam

Theo chúng tôi tìm hiểu thì tại Việt Nam hiện nay chưa thấy có tài liệu nào nói về việc ứng dụng các kỹ thuật sinh học phân tử trong việc chẩn đoán, phát hiện

nấm Fusarium spp gây hại trên xương rồng

2.9 Danh mục một số loài Fusarium được tìm thấy ở Việt nam

Bảng 2.1 Một số loài Fusarium được tìm thấy ở Việt Nam (Đỗ Tấn Dũng, 1996)

1 Héo vàng cây khoai lang Fusarium batatas

2 Mốc hồng ngô F.moniliform f.sp maydis

3 Lở gốc đậu tương F.oxysporum f.sp glysines

4 Héo vàng cây dưa chuột F.solani f.sp.cucumerium

5 Héo vàng cây gừng F.oxysporum f.sp.zinggeberi

6 Vết xám trên cỏ lồng vực Fusarium sp

7 Héo vàng cây hoa loa kèn F.oxysporum f.sp.lini

8 Vết xám trên cành chanh F.semitectum Berk

9 Thối củ chuối F.oxysporum f.sp.cubense

10 Héo vàng cây đinh lăng F.oxysporum f.sp.medicagins

11 Thối nhũn cây xương rồng Fusarium oxysporum

Chương 3

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Vật liệu thí nghiệm

3.1.1 Thời gian – địa điểm nghiên cứu

 Thời gian: Đề tài được tiến hành từ 20/03/2007 đến 30/07/2007  Địa điểm nghiên cứu

Bộ Môn Bảo Vệ Thực Vật, khoa Nông học trường Đại học Nông Lâm Tp Hồ Chí Minh

- Viện nghiên cứu công nghệ sinh học và công nghệ môi trường trường Đại Học Nông Lâm Tp Hồ Chí Minh

3.1.2 Vật liệu

 Chủng vi sinh vật

Các dòng nấm Fusarium spp gây hại xương rồng

 Môi trường Môi trường WA

Agar 15 g H2O 1.000 ml

Môi trường PGA

Môi trường nhân sinh khối

Glucose 20 g Yeast extract 5 g MgSO4.7H2O 0,5 g KH2PO4 0,5 g

K2HPO4 0,5 g CaCl2 1ít

 Các thiết bị, dụng cụ thường sử dụng  Các thiết bị

Máy điện di (Bio-Rad) Bộ chày cối để nghiền mẫu Máy Vortex

Máy li tâm (Sigma)

 Dụng cụ

Ống nghiệm

Micropipette các loại Đầu típ các loại Eppendorf các loại

 Các hóa chất sử dụng

 Các hóa chất để li trích DNA sợi nấm

TE 1X

Nitơ lỏng (nghiền mẫu nấm)

Phenol/ Chlorform/ Isoamyl alcohol (25: 24: 1) Lysis Buffer

Chloroform/ Isoamyl alcohol (24: 1) Isopropanol lạnh

Ethanol 70%

 Hóa chất sử dụng trong điện di

Gel agarose dùng để phân tích DNA qua điện di thường dùng có nồng độ 1% agarose

Dung dịch đệm TAE 0,5X dùng để pha gel và chạy điện di với các thành phần sau:

+ Na 2 EDTA 0,5M (pH 8,0) 2 ml + Glacial acetic acid 1,14 ml + Nước cất vừa đủ 1l ít

Dung dịch nhuộm trên gel: 1% ethidium bromide  Hóa chất để thực hiện phản ứng PCR

– Buffer 5X – MgCl2 25mM – dNTP 25mM

– Primer ef1 10pmol/ l và primer ef2 1mpmol/ l

– H2O cất khử ion

3.2 Phương pháp nghiên cứu

3.2.1 Điều tra tình hình bệnh chết trên cây xương rồng tại Tp Hồ Chí Minh

Tiến hành điều tra tình hình bệnh hại trên cây xương rồng tại một số hộ trồng xương rồng trên địa bàn Tp Hồ Chí Minh từ đó xác định được tỷ lệ nhiễm bệnh do vi khuẩn, virus, nấm gây ra

Hình thức điều tra: phỏng vấn, trao đổi trực tiếp với từng hộ sản xuất 3.2.2 Phân lập mẫu nấm

Mẫu bệnh được thu thập tại các vườn xương rồng bệnh ở Tp.Hồ Chí Minh Tiến hành phân lập mẫu trên môi trường WA và PGA