Phát hiện bệnh khảm lá mía bằng kỹ thuật elisa

Phát hiện bệnh khảm lá mía bằng kỹ thuật elisa và bước đầu nghiên cứu phát hiện bệnh cằn mía gốc bằng kỹ thuật pcr

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ….  …

NGUYỄN ANH KHOA

PHÁT HIỆN BỆNH KHẢM LÁ MÍA BẰNG KỸ THUẬT ELISA VÀ BƯỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU

PHÁT HIỆN BỆNH CẰN MÍA GỐC BẰNG KỸ THUẬT PCR

Luận văn kỹ sư

Chuyên ngành: Công nghệ sinh học

Tp HCM, 8/2006

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ….  …

PHÁT HIỆN BỆNH KHẢM LÁ MÍA BẰNG KỸ THUẬT ELISA VÀ BƯỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU

PHÁT HIỆN BỆNHCẰN MÍA GỐC BẰNG KỸ THUẬT PCR

PGS TS BÙI CÁCH TUYẾN

MINISTRY OF EDUCATION AND TRAINING NONG LAM UNIVERSITY, HCMC FACULTY OF BIOTECHNOLOGY

SURVEYING SUGARCANE MOSAIC DISEASE BY ELISA AND THE FIRST STEP TO RESEARCH

AND DETECT RATOON STUNTING DISEASE BY PCR

Graduation thesis Major: Biotechnology

HCMC, 9/2006 Professor

BUI CACH TUYEN

Student

NGUYEN ANH KHOA Term: 2002- 2006

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC….  …

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

Sinh viên thực hiện: NGUYỄN ANH KHOA

Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9 / 2006

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC….  …

PHÁT HIỆN BỆNH KHẢM LÁ MÍA BẰNG KỸ THUẬT ELISA VÀ BƯỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU PHÁT HIỆN BỆNH

CẰN MÍA GỐC BẰNG KỸ THUẬT PCR

Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9 / 2006

Sinh viên thực hiện: NGUYỄN ANH KHOA Giáo viên hướng dẫn:

PGS TS BÙI CÁCH TUYẾN

LỜI CẢM ƠN

 Tôi xin chân thành bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến:

 PGS TS Bùi Cách Tuyến đã tận tình hướng dẫn và tạo mọi điều kiện thuận lợi giúp tôi hoàn tất khóa luận tốt nghiệp này

 TS Bùi Minh Trí đã chỉ bảo cho tôi nhiều kiến thức trong thời gian thực hiện đề tài

 ThS Nguyễn Văn Cường cùng các anh chị trong Trung tâm Phân tích Thí nghiệm Hóa Sinh – trường Đại học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh đã tận tình giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực tập tốt nghiệp

 ThS Hà Đình Tuấn, Trung tâm nghiên cứu mía đường Bến Cát đã giúp đỡ tôi trong quá trình thu mẫu tại đây

 Xin chân thành cảm ơn đến quí Thầy Cô bộ môn Công Nghệ Sinh Học đã nhiệt tình chỉ dạy cũng như đóng góp ý kiến chân thành cho tôi trong suốt thời gian làm khóa luận này

 Xin gửi lời cảm ơn đến tập thể lớp Công Nghệ Sinh Học 28 đã luôn ủng hộ, động viên và giúp đỡ tôi hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này

Sinh viên thực hiện

Nguyễn Anh Khoa

TÓM TẮT

NGUYỄN ANH KHOA, Đại học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh Tháng 8 năm 2006 “PHÁT HIỆN BỆNH KHẢM LÁ MÍA BẰNG KĨ THUẬT ELISA VÀ BƯỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU PHÁT HIỆN BỆNH CẰN MÍA GỐC BẰNG KĨ THUẬT PCR”

Giáo viên hướng dẫn: PGS TS Bùi Cách Tuyến

Đề tài khảo sát sự nhiễm bệnh khảm lá mía (Sugarcane Mosaic) và cằn mía gốc (Ratoon stunting disease) được thực hiện tại Trung tâm nghiên cứu mía đường (TTNCMĐ) tỉnh Bình Dương và nông trường Thọ Vực tỉnh Đồng Nai Đây là nghiên cứu nhằm góp phần thống kê tình hình nhiễm bệnh khảm lá mía và cằn mía gốc trên một số giống mía sản xuất và nhập nội tại 2 vùng trồng mía này Đặc biệt đề tài là

bước đi đầu tiên trong nghiên cứu, phát hiện bệnh cằn mía gốc do vi khuẩn Leifsonia

xyli subsp xyli (Lxx) gây ra trên cây mía ở nước ta bằng kỹ thuật PCR Nghiên cứu

góp phần quan trọng trong công tác tuyển chọn giống sạch bệnh cũng như công tác phòng chống và kiểm soát dịch bệnh trên cây có mía hiệu quả hơn

Kết quả đạt được

- Các giống mía sản xuất và nhập nội được khảo sát đều không bị nhiễm bệnh

khảm lá mía thông qua kết quả chẩn đoán bằng ELISA

- Phát hiện được bệnh cằn mía gốc bằng phương pháp quan sát dưới kính hiển vi

và nhuộm mô mẫu Kết quả: tỉ lệ mô khoẻ mạnh trên các giống mía khảo sát tại TTNCMĐ là 70,5%, tại nông trường Thọ vực là 75,18%

- Xác định sơ bộ các nhân tố ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy vi khuẩn Lxx - Đề xuất phương pháp nuôi cấy vi khuẩn Lxx và hoàn thiện quy trình phát hiện

vi khuẩn Lxx bằng kỹ thuật PCR

SUMMARY

This is Nguyen Anh Khoa studying at Nong Lam University and finishing the

thesis on 9th 2006 The thesis entiled “Surveying sugarcane mosaic disease by ELISA and the first step to research and detect ratoon stunting disease by PCR ”

Surveying sugarcane mosaic disease and ratoon stunting disease (RSD) on some sugarcane species produced and imported at sugarcane researching center at Binh Duong and at Tho Vuc farm at Dong Nai That is basic to contribute statistics to situation of sugarcane mosaic disease at the areas Specially, the thesis is the first step

to research and detect RSD caused by bacteria Leifsonia xyli subsp xyli (Lxx) on

sugarcane in our country The researching is an important contribution to select pathogenic free species, to prevent and to control epidemic diseases on sugarcane effectively

The results of this research are as follows:

- DAS-ELISA result data show that all investigatived sugarcane species produced and imported at sugarcane researching center at Binh Duong, is not found SCMV

- Detecting Lxx by microscopy and STM stainning Results: 70,5% of phloem vessel do not infected by Lxx on sugarcane species at Binh Duong provine and 75,18% phloem of vessel do not infected by Lxx on sugarcane at Tho Vuc farm - Preliminary defining factors effecting the Lxx bacteria culturing process

- Proposing the method to culture Lxx bacteria and to perfect Lxx bacteria

detecting process by PCR

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN iii

1.1 Cơ sở tiến hành và ý nghĩa của nghiên cứu 1

1.2 Mục tiêu nghiên cứu 2

1.3 Giới hạn đề tài 2

Phần 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

2.1 Sơ lược về cây mía 3

2.3.4 Các chủng virus gây bệnh khảm lá mía 9

2.3.5 Qui luật phát sinh phát triển bệnh 9

2.3.6 Tầm quan trọng kinh tế 9

2.3.7 Phòng trừ 10

2.3.8 Các phương pháp xác định bệnh khảm lá mía 10

2.3.8.1 Dựa vào trạng thái dấu vết bệnh 10

2.3.8.2 Phương pháp chẩn đoán dùng kính hiển vi 10

2.3.8.3 Phương pháp ELISA (Enzym-link immunosorbent assay) 10

2.3.8.4 Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction) 12

2.4 Bệnh cằn mía gốc 14

2.4.1 Nguồn gốc và phân bố 14

2.4.2 Triệu chứng 14

2.4.2.1 Triệu chứng bên ngoài 14

2.4.2.2 Triệu chứng bên trong cây 15

2.4.3 Tác nhân gây bệnh 16

2.4.4 Quy luật phát sinh phát triển bệnh 16

2.4.5 Tầm quan trọng kinh tế 17

2.4.6 Kiểm soát bệnh 17

2.4.7 Các phương pháp chẩn đoán bệnh cằn mía gốc trên cây mía 17

2.4.7.1 Phương pháp chẩn đoán trực tiếp bằng kính hiển vi 17

2.4.7.2 Phương pháp huyết thanh học 17

2.4.7.3 Phương pháp nhuộm STM (dựa vào đáp ứng của kí chủ) 19

2.4.7.4 Phương pháp chẩn đoán dựa vào kỹ thuật sinh học phân tử 19

2.5 Tình hình nghiên cứu về bệnh khảm lá mía và bệnh cằn mía gốc 19

2.5.1 Trên thế giới 19

2.5.2 Trong nước 20

Phần 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22

3.1 Nội dung nghiên cứu 22

3.2 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 22

3.3 Vật liệu nghiên cứu 22

3.3.1 Các giống mía nghiên cứu 22

3.4.2 Phương pháp phát hiện SCMV bằng kỹ thuật ELISA 24

3.4.3.1 Phương pháp chuẩn bị mẫu và bố trí thí nghiệm 24

3.4.3.2 Phát hiện bệnh khảm lá mía bằng kỹ thuật ELISA 26

3.4.3 Phương pháp nhận dạng bệnh cằn mía gốc trên đồng ruộng 27

3.4.4 Phương pháp phát hiện vi khuẩn Lxx bằng kính hiển vi và bằng phương pháp nhuộm STM 27

3.4.5 Phương pháp nuôi cấy và nhận dạng khuẩn lạc vi khuẩn Lxx 28

3.4.6 Phương pháp PCR phát hiện vi khuẩn Lxx 29

Phần 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 31

4.1 Phát hiện bệnh khảm lá mía bằng kỹ thuật ELISA 31

4.2 Nghiên cứu phát hiện bệnh cằn mía gốc bằng kỹ thuật PCR 32

4.2.1 Điều tra sự nhiễm bệnh cằn mía gốc dựa vào triệu chứng Phát hiện vi khuẩn Lxx bằng phương pháp quan sát dưới kính hiển vi và phương pháp nhuộm STM 32

4.2.2 Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy vi khuẩn Lxx và nhận dạng khuẩn lạc của nó trên môi trường nuôi cấy 36

DANH SÁCH CÁC BẢNG VÀ SƠ ĐỒ

Bảng 1.1 Thống kê về nhóm tác nhân gây bệnh và số lượng bệnh 6

Bảng 3.1 Thành phần các chất trong phản ứng PCR và chu kỳ nhiệt 30

Bảng 4.1 Kết quả chẩn đoán bệnh cằn mía gốc bằng phương pháp quan sát dưới kính hiển vi 34

Bảng 4.2 Kết quả chẩn đoán bệnh cằn mía gốc trên các giống sản xuất tại TTNCMĐ và nông trường Thọ Vực bằng phương pháp nhuộm STM 35

Bảng 4.3 So sánh kết quả chẩn đoán của hai phương pháp: dùng kính hiển vi và nhuộm STM 36

Sơ đồ 2.1 Tiến trình thực hiện ELISA Sandwich trực tiếp 11

Sơ đồ 2.2 Sơ đồ tổng quát của kỹ thuật RT - PCR 13

Sơ đồ 3.1 Sơ đồ điều tra 24

Sơ đồ 3.2 Sơ đồ tách chiết mẫu lá cho ELISA 25

Sơ đồ 3.3 Sơ đồ bố trí giếng trên đĩa ELISA 25

Hình 2.4 Sugarcane mosaic virus 8

Hình 2.5 Cơ chế phản ứng đổi màu trong DAS- ELISA 12

Hình 2.6 Lxx gây những vết chuyển màu ở thân mía 15

Hình 2.7 Vi khuẩn Leifsonia xyli subsp xyli dưới kính hiển vi điện tử (x30.000 lần) (K E Damann, 2002) 16

Hình 4.1 Kết quả chẩn đoán SCMV qua quan sát sự đổi màu trên đĩa ELISA 32

Hình 4.2 Vi khuẩn Lxx dưới kính hiển vi (độ phóng đại 1000 lần) 34

Hình 4.3 Mẫu thân nhuộm safranin dưới kính hiển vi (x 40 lần (A) và x 100 lần (B)) 35

Hình 4.4 Khuẩn lạc nhỏ tương tự như khuẩn lạc Lxx trên môi trường sau 2 ngày nuôi cấy (A); và khuẩn lạc của nó sau khi phân lập (B) 36

Hình PL1 Nhận dạng triệu chứng và thu mẫu xvi

Hình PL2 Lá mía có triệu chứng khảm xvi

Hình PL3 Kết quả âm tính trong phân tích ELISA xvi

Hình PL4 Bệnh đốm vòng thường xuất hiện trên các cây khảo sát xvi

Hình PL5 Quá trình điều tra và thu mẫu xvi

Hình PL6 Gốc mía bị cằn xvi

Hình PL7 Đốt thân mía bị nhiễm Lxx nên ngắn lại xvii

Hình PL8 Thân mía bị bệnh có đường kính nhỏ hơn thân bình thường xvii

Hình PL9,10 Vết đổi màu bên trong thân xvii

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT ELISA: enzym linked immunosorbent assay

DAS-ELISA: double antibody sandwich-enzyme linked immunosorbent assay TTNCMĐ: Trung tâm nghiên cứu mía đường

RT-PCR: Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction

cDNA: Complementary Deoxyribonucleotide acid ctv: Cộng tác viên

NCM: Màng nitrocellulose

ddNTP: Dideoxyribonucleoside triphosphate DEPC: Diethyl pyrocarbonate

dNTP: Deoxyribonucleoside triphosphate p-NPP: p - nitrophenol phosphate

PVP: Polyvinylpyrrolidone

BSA: Bovine serum albumin

PBS: Dung dịch chứa PVP, BSA, Tween–20 và sodium azide

RNA: Ribonucleic acid

TTPT: Trung tâm phân tích

Taq: Thermus aquaticus.

Phần 1 MỞ ĐẦU

1.1 Cơ sở tiến hành và ý nghĩa của nghiên cứu

Hiện nay cây mía (Saccharum spp.) đang là một trong những loại cây công nghiệp

cho hiệu quả kinh tế cao ở nước ta cũng như nhiều nước trên thế giới như Cuba, Ấn Độ, Australia,.v.v vì vậy diện tích trồng mía cũng như sự ra đời của nhiều giống mới không ngừng gia tăng trong những năm gần đây Tuy nhiên mía là cây trồng một lần nhưng lại có khả năng cho thu hoạch nhiều vụ, nên đây cũng là một trong những điều kiện thuận lợi cho nhiều loại sâu bệnh gây hại tồn tại và phát triển (Nguyễn Huy Ước,

1994) Hơn nữa khi cơ cấu giống mía phong phú hơn, thời tiết khí hậu có nhiều biến

đổi cũng góp phần làm cho dịch bệnh đa dạng hơn Các bệnh quan trọng ảnh hưởng đến năng suất mía hiện nay có rất nhiều, trong đó phải kể đến bệnh khảm lá mía và bệnh cằn mía gốc

Bệnh khảm lá mía do virus Sugarcane Mosaic gây ra là bệnh rất phổ biến và có ảnh hưởng lớn đến ngành sản xuất mía đường của nhiều nước trên thế giới Thiệt hại

nghiêm trọng về năng suất đã được ghi nhận tại các vùng trồng mía lớn thuộc châu Mỹ, châu Úc; mức thiệt hại có thể lên đến 50% đối với các giống mẫn cảm (Lê Lương

Tề và Vũ Triệu Mân, 1999) Bệnh thường gây hại ở các vùng ôn đới và ít hơn tại các vùng nhiệt đới Cụ thể theo kết quả điều tra của Đỗ Ngọc Diệp và ctv (1987), bệnh khảm lá mía đã xuất hiện nhưng rải rác, thiệt hại gây ra chưa ở mức đáng quan tâm Chính vì vậy mà hiện nay ở nước ta bệnh khảm lá mía chưa được quan tâm đúng mức trên cả phương diện thống kê giống – vùng bị bệnh và các phương pháp chẩn đoán bệnh hiệu quả Do vậy việc điều tra phát hiện bệnh khảm lá trên các giống mía nhập nội và sản xuất tại TTNCMĐ tỉnh Bình Dương nhằm thống kê lại tình hình nhiễm bệnh khảm lá mía trên các giống khảo sát, kiểm định giống mới nhập nhằm nâng cao hiệu quả chọn lọc giống và kiểm soát bệnh

Bệnh cằn mía gốc (RSD) gây ra bởi vi khuẩn Leifsonia xyli subsp xyli (Lxx) đây là

một loại vi khuẩn gram dương nhỏ chỉ gây bệnh trên mía Bệnh có thể gây tổn thất lên

đến 50% tổng sản lượng mía thu được (Davis, 1980) Việc chẩn đoán phát hiện Lxx rất

khó vì nó ít gây ra các triệu chứng lâm sàng đặc trưng có thể phát hiện được trên đồng

ruộng Nhìn chung cây bị nhiễm Lxx sẽ phát triển chậm hơn so với các cây khác cùng

độ tuổi Do vậy người sản xuất thường lầm tưởng hay lẫn lộn nguyên nhân của sự chậm lớn trên là do vùng đất trồng kém dinh dưỡng, độ ẩm không thích hợp hay cây bị

thiếu chất Các phương pháp phát hiện Lxx như là nhìn dưới kính hiển vi, phát hiện

bằng phương pháp miễn dịch học,.v.v cũng được phát triển nhưng độ chính xác và độ nhạy chưa cao Do vậy, việc ứng dụng các kỹ thuật sinh học phân tử trong chẩn đoán nhanh và chính xác bệnh là một yêu cầu cần thiết, có ý nghĩa rất quan trọng, phục vụ

cho công tác chọn giống, kiểm định giống từ đó đề ra các khuyến cáo nhằm kiểm soát

và quản lí bệnh có hiệu quả

Trước tình hình trên, được sự hướng dẫn của PGS TS Bùi Cách Tuyến và sự hỗ

trợ từ TTNCMĐ tỉnh Bình Dương chúng tôi đã thực hiện đề tài “Phát hiện bệnh khảm lá mía bằng kỹ thuật ELISA và bước đầu nghiên cứu phát hiện bệnh cằn

mía gốc bằng kỹ thuật PCR” Đề tài được thực hiện trên một số giống mía nhập nội

và sản xuất tại tỉnh Bình Dương (Trung tâm nghiên cứu mía đường) và Đồng Nai

(Nông trường Thọ Vực)” 1.2 Mục tiêu nghiên cứu

- Đánh giá tình hình nhiễm bệnh khảm lá mía và bệnh cằn mía gốc trên một số

giống mía sản xuất tại TTNCMĐ tỉnh Bình Dương và nông trường Thọ Vực tỉnh Đồng Nai

- Kiểm định các giống mía mới nhập nội năm 2005

- Phát hiện bệnh cằn mía gốc bằng phương pháp quan sát vi khuẩn Lxx dưới kính

hiển vi và phương pháp nhuộm STM (Stainning transpiration)

- Nuôi cấy phân lập vi khuẩn Lxx

- Phát hiện trực tiếp vi khuẩn Lxx trong dịch chiết nước mía bằng kỹ thuật PCR

1.3 Giới hạn đề tài

- Thời gian thực hiện đề tài có hạn vì vậy không thể tiến hành điều tra khảo sát và

theo dõi diễn biến bệnh trên các giai đoạn tăng trưởng được

- Nghiên cứu phân lập vi khuẩn Lxx cần thời gian dài vì đây là loại vi khuẩn khó

nuôi cấy trên môi trường

Phần 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Sơ lược về cây mía 2.1.1 Lịch sử phát hiện

Cây mía (Saccharum spp.) đã được biết từ rất lâu (cách nay

khoảng 2200 năm), khi quân đội của Alexander chinh phục Ấn Độ vào năm 326 trước Công Nguyên họ đã thấy được cây mía (Hình 2.1) Cây mía đến Persia vào thế kỉ thứ 6 và người Ả Rập đã mang cây mía đến Ai Cập vào năm 641 sau Công Nguyên trong quá trình chinh phục các miền đất của họ Cây mía cũng được mở rộng phân bố bằng cách này đến Syria, Cyprus, Crete, và đến Tây Ban Nha vào khoảng những năm 714 sau công nguyên Vào những năm 1150 ngành công nghiệp mía đường ở Tây Ban Nha rất phát triển với khoảng 30000 ha mía được

trồng Vào khoảng năm 1420 người Bồ Đào Nha đã đưa cây mía đến Madeira nơi mà

chúng ngay lập tức lan rộng sang các quần đảo Canary, Azores Nhà máy xử lí mía

hoạt động đầu tiên vào năm 1516 ở nước cộng hòa Dominica Sản phẩm đường được đưa đến Cuba, Jamaica, Puerto Rico vào những năm cuối của thế kỷ 15

Cây mía được cho là có nguồn gốc từ vùng nam Thái Bình Dương

 S spontaneum xuất hiện trong quần thể hoang dại ở phía đông và nam Châu

Phi, từ suốt vùng trung đông đến Ấn Độ, Trung Quốc, Triều Tiên và Malaysia,

và từ suốt vùng Thái Bình Dương đến New Guinea

Hình 2.1 Cây mía

(Nguồn: Philipe Rott, 2000)

 Trung tâm xuất xứ của cây mía có thể là ở miền nam Ấn Độ nơi đã xuất hiện

giống S robustum có số lượng NST nhỏ nhất dọc theo bờ sông ở New Guinea và một ít ở các đảo liền kề và đã trở thành cây bản xứ của khu vực này

 S officinarum còn gọi là “noble cane” giống với các cây mía nguồn gốc ở

New Guinea Loại mía này chỉ phù hợp với vùng nhiệt đới với điều kiện đất đai và khí hậu thuận lợi

 S barberi có thể có nguồn gốc ở Ấn Độ

 S sinense có xuất xứ một phần ở Ấn Độ, Indonesia, Trung Quốc, nam Trung

Quốc và Triều Tiên

 S edule là loại không thể sản xuất mùa màng như S robustum và chỉ tìm thấy

được ở New Guinea và các đảo kế cận

Cây mía hiện tại là cây trồng chính tại nhiều nước vùng nhiệt đới Vĩ độ cao nhất mà cây mía được trồng là tại Natal, Argentina và tại cực nam của Australia (khoảng 30 độ S), và khoảng 34 độ N phía tây nam Pakistan, và 37 độ N ở nam Tây Ban Nha

2.1.4 Nhân giống

Để nhân giống mía người ta thường trồng bằng thân mía cắt từ cây mía chưa trưởng thành có thời gian trồng từ 6 - 8 tháng tuổi Những đoạn thân này được gọi là "setts", "seed", "seed - cane" hay "seed - pieces" “Sett” được cho là tốt nhất nếu được lấy từ đốt thứ ba từ dưới lên của cây mía vì chồi ở đốt này còn non và ít bị khô “Sett” có thể được trồng xiên theo một góc 45OC hay cũng có thể đặt nằm ngang luôn lên trên luống Ước tính cần 12.500 - 20.000 “sett” để trồng hết 1 hecta Mía là cây trồng quanh năm với thời gian từ 3 - 6 năm trước khi được đốn bỏ và trồng lại Vụ đầu tiên được gọi là mía tơ và thường mất khoảng 9 - 24 tháng để cây trưởng thành, nó phụ thuộc vào vùng địa lý Các vụ mía gốc mất khoảng 1 năm để trưởng thành và thường thì sau khoảng hai vụ mía gốc là người ta đã thay bằng các ruộng mía mới, điều này phụ thuộc vào năng suất và sự chậm suy tàn của giống

2.1.5 Sản lượng

Năng suất cao nhất của mía về chỉ số calories trên đơn vị diện tích là 10 tấn đường (sucrose) trên hecta ở Barbardos Sản lượng cao nhất đạt được ở Hawaii là 22 tấn sucrose trên hecta, nhưng giống mía này cần đến 2 năm hay hơn mới có thể đạt được trạng thái thành thục ở khu vực này Sản lượng mía đã được cải thiện và gia tăng đáng

kể trong suốt 100 năm qua nhờ quá trình cải tiến giống, đặc biệt là nhờ vào việc sử dụng phân bón, kiểm soát được côn trùng và các loại bệnh, cơ giới hóa đồng ruộng và nhà máy, và việc tạo ra nhiều giống mới cho năng suất cao

2.1.6 Chế biến và sử dụng

Trước khi sản phẩm đường được làm ra lần đầu tiên ở Ấn Độ khoảng 1000 năm trước công nguyên, nhờ vào việc đun sôi dịch chiết nước mía thì cây mía ban đầu được trồng chỉ nhằm mục đích làm thực phẩm mà thôi Ngày nay cây mía được nhiều ngành công nghiệp sử dụng và là một trong những sản phẩm được sử dụng rộng rãi và có giá trị của mỗi quốc gia

- Khoảng 1 tấn đường thô có thể thu được khi chế biến 8 - 9 tấn mía Loại đường thô màu nâu này có thể được tinh chế thành đường trắng sạch hơn

- Cây mía được sử dụng trong nhiều mục đích khác hơn nữa chứ không riêng gì việc sản xuất ra đường:

 Mật đường là sản phẩm phụ trong quá trình chế biến đường, nó là chất lắng xuống khi không còn khả năng kết tinh thành đường Gần 2,7% mật đường hình thành khi chiết xuất 1 tấn mía Mật đường được sử dụng cho nhiều mục đích khác nhau: dùng để làm phân bón cho đất trồng mía, được vô trùng và lên men để tạo ra nhiều loại sản phẩm khác nhau như cồn vô trùng, rượu rum, hay ethyl alcohol

 Sản phẩm còn lại sau quá trình ép nước mía đó là bã mía được dùng như là nguồn nhiên liệu chính của các nhà máy đường, nó còn đườc dùng để làm giấy, bìa cứng, bảng và tường bằng giấy ép cứng

2.2 Bệnh trên cây mía

Theo thống kê ở các nước trồng mía hiện nay thì có tất cả 126 bệnh hại mía trên thế giới (Philippe Rott, 2000), trong đó có 73 bệnh hại phổ biến Bệnh hại được gây ra bởi 8 nhóm tác nhân chính cho ở Bảng 1.1

Trong đó bệnh do virus là loại bệnh khó kiểm soát nhất và gây thiệt hại nghiêm trọng như bệnh khảm lá mía (Sugarcane Mosaic), bệnh vàng gân lá (Yellow leaf syndrome), bệnh Fiji (Fiji disease),.v.v

Bệnh do nấm gây ra có số lượng nhiều nhất cũng như là gây thiệt hại nhiều nhất như bệnh đốm vòng (Ring spot), bệnh mốc sương (Downy mildew), bệnh than (Smut)

Bảng 1.1 Thống kê về nhĩm tác nhân gây bệnh và số lƣợng bệnh đang xảy ra trên cây

mía (Hà Đình Tuấn, 2004)

Vi khuẩn gây ra 4 loại bệnh nghiêm trọng là bệnh gơm (Gumming), bệnh cháy lá

(Leaf scald), bệnh cằn mía gốc (Ratoon strunting disease) và bệnh sọc đỏ (Red stripe)

Hình 2.2 Bệnh hại phổ biến trên mía cây mía (Philippe Rott, 2000)

Chú thích: A: Bệnh khảm lá mía; B: Bệnh vàng gân lá (YLSD); C: Bệnh thối đỏ; D: Bệnh than (Smut); E: Bệnh gơm (Gumming disease); F: Bệnh cằn mía gốc

2.3 Bệnh khảm lá mía

2.3.1 Nguồn gốc và phân bố

Bệnh khảm được công nhận đầu tiên vào năm 1892, được xem như là một đặc tính bất thường trên mía bởi Musschenbrock ở Java Ông đã đặt tên cho nó là bệnh đốm sọc vàng “gelestrepenziekte”

Nguồn gốc của bệnh khảm trên mía thì không được biết rõ, nhưng qua các lần quan sát, theo dõi thì Brandes đã kết luận rằng kí chủ là virus có cùng một điểm phát sinh Nên theo ông virus này phải xuất phát từ New Guinea, nơi mà mía là một loài địa phương Người ta phỏng đoán rằng bệnh có từ thời kì tiền sử và lan đến các vùng khác cùng với sự di chuyển của cây mía từ New Guinea

2.3.2 Triệu chứng

Theo Lê Lương Tề và Vũ Triệu Mân (1999), triệu chứng đặc trưng của bệnh là các vết khảm xanh nhợt hoặc vàng trên lá Vết bệnh sau đó sẽ chuyển thành vết chết hoại, hiện tượng này đôi khi còn thấy trên thân Sự biểu hiện triệu chứng còn phụ thuộc vào chủng virus, cây kí chủ và điều kiện môi trường, đặc biệt là yếu tố nhiệt độ

Bênh khảm virus được xác định chủ yếu trên lá, mức độ khác nhau tùy vào dòng

mía, điều kiện sinh trưởng, nhiệt độ và chủng virus có liên quan Triệu chứng thông

thường là vết đốm đặc trưng màu xạnh nhạt mờ ảo, tương phản trên phiến lá, hoặc những vùng màu xanh nhạt hay biến vàng là kết quả phân bố của các mức độ hàm lượng diệp lục tố khác nhau (Hình 2.3)

Hình 2.3 Triệu chứng của bệnh khảm lá mía (Bailey, 1998)

Chú thích: A: Cây còi cọc và vàng lá; B: Vết khảm màu xanh nhợt trên lá; C: Vết khảm vàng trên lá non

Những vùng biến vàng thông thường thấy rõ nhất ở lá non, lá đang sinh trưởng mạnh Sự phân bố của những vùng biến vàng cũng khác nhau, đôi khi chỉ xuất hiện những vết sọc rất nhạt trên mặt lá, nhưng phổ biến hơn là các vùng biến vàng chiếm phần lớn trên nền lá màu xanh bình thường, và phân bố đều hơn trên mặt lá Bệnh đôi khi gây những vùng hoại tử kéo dài bên trong mô tế bào thân Ở phần mắt lóng của thân nhiễm bệnh có màu hồng đến hơi nâu

Sau khi cây bị nhiễm bệnh, virus có thể lan đến toàn bộ các bộ phận của cây, nhưng triệu chứng khảm chỉ xuất hiện trên lá non, đang phát triển, và không xuất hiện ở chổ khác đã phát triển đầy đủ trước đó

Ở lá bị bệnh, tế bào của vùng biến vàng có thể bị kìm hãm nên tại đó sự sinh

trưởng giảm, có ít hoặc không có sự khác biệt về cấu trúc mô về tế bào so với lá bình thường Lục lạp ở những vùng biến vàng thì nhỏ, ít về số lượng và phần lá biến vàng

mỏng hơn so với vùng màu xanh của lá bình thường

2.3.3 Tác nhân gây bệnh

Sugarcane mosaic virus là tác nhân gây ra bệnh khảm lá mía, thuộc nhóm Potyvirus Những nghiên cứu về điện di cho thấy virus SCMV có hình sợi, kích thước 750 x 13nm, acid nucleic của virus là dạng sợi đơn RNA, RNA có hệ số kết tủa là 34 - 38,9 S Trọng lượng phân tử là 2,7 - 3,1 x 106 daltons, trong đó gồm 33,5% A, 20,3% G, 16,2% C và 30% U Á đơn vị protein của SCMV có trọng lượng phân tử là 28.500 - 36.500 daltons và có 264 - 273 gốc amino acid Thể vùi của virus trong tế bào cây có dạng hình trụ Ngưỡng pha

loãng là 10-2 - 10-5 Những phân tử virus được sắp xếp ngẫu nhiên trong tế bào chất, trong khi những siêu thể vùi với lớp màng mỏng xuất hiện giữa chất nguyên sinh và thành tế bào

Nhiều đặc tính của virus SCMV cũng được nghiên cứu Hệ số lắng đọng là 176 ± 5S và mật độ lơ lửng là 1,3327 của SCMV-D, và giá trị 148 ± 2 – 170 ± 5S tương ứng với 1,285 – 1,3421 của SCMV –J

Hình 2.4 SCMV dưới kính hiển vi điện tử (x 30.000 lần)

(Nguồn: www Plantpathology)

2.3.4 Các chủng virus gây bệnh khảm lá mía

Có nhiều chủng virus khác nhau, khác biệt trong khả năng gây nhiễm và mức độ thiệt hại do chúng gây ra Những chủng virus khác nhau thường tạo ra những triệu chứng tương tự nhau trên hầu hết các dòng mía thương mại hiện nay Tuy nhiên chúng cũng có thể được phân biệt bằng các dòng chỉ thị chọn lọc

Theo Koike và Gillaspie (1989) thì có tổng cộng 14 chủng virus SCMV gây bệnh khảm lá phân bố khắp thế giới là A, B, C, D, E, F, G, H, I, J, K, L, M, N

2.3.5 Qui luật phát sinh phát triển bệnh

Virus khảm lá mía lan truyền qua nhiều loại rệp muội theo phương thức nửa bền

vững Rệp ngô Rhapalosiphum maidis Fitch, rệp bông Aphis gossipii, rệp đào Myzus

persicae, rệp mía Melanaphis sacchari … là môi giới chủ yếu truyền bệnh Ngoài ra

bệnh còn có thể truyền qua con đường nhân giống vô tính Virus gây bệnh cũng có thể truyền qua hạt ngô

Cây mía mẫn cảm với bệnh ở giai đoạn cây con Sự phát triển của bệnh trên đồng ruộng phụ thuộc vào nhiều yếu tố như: sức chống chịu của giống mía, sự có mặt của các chủng virus gây bệnh và sự tồn tại của quần thể rệp trên đồng ruộng Điều kiện canh tác cũng ảnh hưởng đến sự mẫn cảm của cây và hoạt động của rệp

Virus có phạm vi kí chủ rộng, gây hại trên một số loại cây trồng như ngô, cao lương và nhiều loại cỏ khác

2.3.6 Tầm quan trọng kinh tế

Trong suốt thời kì từ năm 1928 - 1930, khi bệnh khảm lan rộng nhanh chóng ở Tây Hamiphere, thì việc năng suất giảm 30 - 40% là phổ biến, đôi khi lên đến 60 - 80%

Bệnh khảm thường xuyên kéo dài là yếu tố gây ra sự giảm toàn bộ năng suất, không kể

có hay không các yếu tố khác có liên quan đến (Koike và Gillaspie, 1989)

Sự mất mát về kinh tế phụ thuộc vào tính mẫn cảm với bệnh của các dòng mía,

chủng virus gây bệnh, sự tương tác với các bệnh khác, quần thể môi giới, thời tiết và

điều kiện môi trường canh tác

Sự kết hợp của bệnh khảm và các bệnh khác làm giảm sự sinh trưởng của cây cao hơn khi bệnh tác động riêng rẻ Người ta đã theo dõi và nhận thấy rằng có sự giảm sút lớn về năng suất khi bệnh khảm và bệnh cằn gốc mía cùng xuất hiện trên các giống CP44-101, CP52-68 và NCo hơn từng bệnh riêng lẻ (Koike và Gillaspie, 1989)

2.3.7 Phòng trừ

Sử dụng giống kháng, chọn nguồn giống khỏe, sạch bệnh làm vật liệu trồng Tiêu diệt cây bệnh và cỏ dại, hạn chế bệnh lây lan, ẩn náu trên đồng ruộng Luân canh với cây trồng khác họ

Xử lí hom giống bằng nhiệt độ hoặc thuốc hóa học

Nuôi cấy mô phân sinh ngọn hoặc nuôi cấy mô kết hợp với xử lí nhiệt Tránh trồng và đốn mía vào thời kỳ có mật độ cao của quần thể môi giới

2.3.8 Các phương pháp xác định bệnh khảm lá mía

2.3.8.1 Dựa vào trạng thái dấu vết bệnh

Phương pháp này đơn giản và nhanh nhất nhưng hiện tượng dương tính giả và âm tính giả cũng cao nhất Đơn giản vì vết bệnh dễ biến đổi, nhiều khi cây bị bệnh mà vết bệnh không phát ra ngoài Một số trường hợp khác như vết bệnh không rõ ràng, bệnh trong giai đoạn tiềm ẩn cũng gây khó khăn trong chẩn đoán

2.3.8.2 Phương pháp chẩn đoán dùng kính hiển vi

Phương pháp đơn giản là sử dụng dịch chiết từ lá cây bệnh hoặc thông qua làm tinh khiết cố định bằng hóa chất trên lưới đồng để quan sát dưới kính hiển vi điện tử Đây là phương pháp trực tiếp và đơn giản

2.3.8.3 Phương pháp ELISA (Enzym-link immunosorbent assay)

Phương pháp ELISA là phương pháp miễn dịch liên kết enzym Năm 1972 - 1973, ELISA được sử dụng đầu tiên trong y học để chẩn đoán virus Đến năm 1977 Clark và Adam lần đầu tiên ứng dụng ELISA để xác định virus hại thực vật tại Scottlen Đây là kỹ thuật khá nhạy và tương đối đơn giản, cho phép xác định kháng nguyên (KN) và kháng thể (KT) ở nồng độ rất thấp (khoảng 0,1ng/ml), rẻ tiền, an toàn và độ chính xác cao (Phạm Văn Ty, 2001)

Có 3 phương pháp chính làm nền tảng cơ bản cho tất cả các dạng ELISA là:

- Direct ELISA: Đây là dạng đơn giản nhất của phương pháp ELISA Trong đó, kháng nguyên cần phát hiện sẽ được gắn trực tiếp lên bề mặt giá thể và sẽ được phát hiện bằng một kháng thể duy nhất (kháng thể này đã được gắn enzyme)

- Indirect ELISA: Phương pháp này khác Direct ELISA ở chỗ kháng thể bắt kháng nguyên không được gắn enzyme mà nó là mục tiêu gắn đặc hiệu của một kháng thể khác (kháng thể này mới là kháng thể được gắn với enzyme)

- Sandwich ELISA: Đây là một dạng ELISA được sử dụng phổ biến nhất trong thực tiễn do nó cho phản ứng mạnh và nhạy Được gọi là “sandwich” là do kết quả thí nghiệm được đánh giá thông qua sự kết hợp của hai loại kháng thể là kháng thể bắt (capture antibodies) và kháng thể phát hiện (detection antibodies) Kỹ thuật này cũng được phân làm hai dạng là Direct sandwich ELISA (DAS-ELISA - Double antibody sandwich) và Indirect sandwich ELISA (TAS-ELISA - Triple antibody sandwich)

Trong phạm vi khóa luận này, chúng tôi đã sử dụng kỹ thuật DAS ELISA (Double Antibody Sandwich) để thực hiện chẩn đoán SCMV Đây là một dạng của Direct sandwich ELISA với kháng thể sử dụng là kháng thể đa dòng Quy trình các bước thực hiện DAS ELISA được sơ đồ hóa như Sơ đồ 2.1

Sơ đồ 2.1 Tiến trình thực hiện ELISA Sandwich trực tiếp

Phân tích kết quả ELISA dựa trên sự đổi màu của các giếng (Hình 2.5) và bằng máy đọc ELISA Máy đọc ELISA hoạt động dựa trên nguyên lí quang phổ kế, đo giá

Thêm cơ chất tạo màu Ủ, đọc kết quả

PCR là một phản ứng sinh hóa phụ thuộc vào nhiệt độ, sử dụng đặc điểm của quá trình sao chép DNA với sự tham gia của một loại enzym chịu nhiệt (thường dùng

enzym “Taq” được chiết xuất từ vi khuẩn từ suối nước nóng Thermus apquaticus), có

2 đoạn ngắn DNA một sợi làm mồi và dùng các đoạn DNA mạch đơn làm khuôn để tổng hợp nên sợi mới bổ sung với nó Đối với một số loại virus có cấu trúc acid

nucleic là RNA nói chung và virus SCMV nói riêng thì bước phiên mã ngược (reverse

transcriptase - RT) là cần thiết để tồng hợp nên complementary DNA (cDNA) trước

khi tiến hành phản ứng PCR

Phản RT - PCR gồm 2 quá trình: (Sơ đồ 2.2)

 Quá trình reverse transcriptase (RT)

Để chuyển RNA thành DNA, phản ứng này dựa trên khả năng của enzyme phiên mã ngƣợc, một polymerase RNA phụ thuộc DNA để tạo ra một sợi DNA bổ sung (first-strand cDNA) sử dụng mRNA nhƣ một khuôn mẫu

Sơ đồ 2.2 Sơ đồ tổng quát của kỹ thuật RT-PCR (Trích dẫn Vương Hồ Vũ, 2005)

Trong kỹ thuật PCR, các đoạn mồi đƣợc chọn nằm ở 2 đầu đoạn DNA cần nhân lên, sao cho các sợi DNA đƣợc tổng hợp mới đƣợc bắt đầu tại mỗi đoạn mồi và kéo dài về phía đoạn mồi nằm trên sợi kia, cho sản phẩm có độ dài nằm giữa 2 đoạn mồi này

Độ dài của sản phẩm PCR có thể từ vài trăm đến hàng ngàn cặp nucleotid

Như vậy sau mỗi chu kỳ, các điểm bám cho các đoạn mồi lại xuất hiện trên mỗi sợi DNA mới được tổng hợp Hỗn hợp phản ứng lại được nâng nhiệt độ thích hợp sao cho các sợi ban đầu tách khỏi sợi mới được tổng hợp, các sợi này sau đó được dùng làm khuôn cho chu kỳ tiếp theo

Kết quả cuối cùng của phản ứng PCR là sau n chu kỳ (thường từ 25-35 chu kỳ), tính theo lý thuyết ta có: 2n bản sao các phân tử DNA mạch kép nằm giữa 2 đoạn mồi Như vậy, từ một đoạn DNA định trước được nhân lên với một số lượng rất lớn

2.4 Bệnh cằn mía gốc

2.4.1 Nguồn gốc và phân bố

Bệnh cằn mía gốc hiện nay được xếp vào loại bệnh có tầm quan trọng kinh tế lớn trên thế giới (Davis và Bailey, 2000) Nguyên nhân là do sự phân bố rộng khắp của nó trên thế giới, sự thiếu các triệu chứng có thể nhận diện được ở cây kí chủ, thiếu các đặc tính của tác nhân gây bệnh, sự nghiên cứu về bệnh, và những chiến lược cần thiết để kiểm soát bệnh có hiệu quả Do vậy bệnh cằn mía gốc hiện đang là một trong những bệnh đang gây hậu quả nghiêm trọng cho các vùng trồng mía trên thế giới

Bệnh cằn mía gốc được phát hiện đầu tiên ở Queensland trong thời gian từ năm 1944 - 1945, lúc này trên giống mía Q28 đang trồng người ta phát hiện ra có hiện tượng bị hủy hoại bất thường Sau đó người ta phát hiện ra rằng RSD đã phân bố khắp vùng Queensland, và có mặt ở hầu hết các vùng trồng mía trên thế giới

2.4.2 Triệu chứng

2.4.2.1 Triệu chứng bên ngoài

Hầu như không có triệu chứng bên ngoài có thể nhận ra được từ cây mía bị bệnh ngoại trừ sự cằn cọc và phát triển kém của cây Tuy nhiên những đặc điểm trên đều có thể thấy được ở những vùng đất trồng kém dinh dưỡng, độ ẩm không thích hợp hay cây bị thiếu dinh dưỡng

Về sự phát triển của chồi thì cây bị bệnh phát triển chậm hơn cây sạch bệnh đặc biệt là trong mùa khô khi mà các gốc mía dường như không phát triển trong vài tuần hay cả khi cả tháng Những gốc mía này thường rất khỏe và không có sự bất thường nào ở hệ thống rễ cũng như ở thân hay chồi ở dưới đất Sự cằn cỗi biểu hiện không đồng nhất giữa các chồi nhiễm bệnh, và ruộng nhiễm bệnh biểu hiện cả sự đi lên và đi xuống của sự phát triển, ngay cả khi tất cả các cây đều bị nhiễm bệnh

2.4.2.2 Triệu chứng bên trong cây

Khi chẻ đôi thân cây bị nhiễm bệnh bằng một con dao sắc thì sẽ thấy ở phần dưới

các mắt mía có những chấm đổi màu hình dấu chấm hay dấu phẩy Sự đổi màu thường diễn ra từ đốt dưới rồi mới lên đến các nốt bên trên, thường định vị ở những vùng dưới bẹ lá ngay tại vị trí của nơi xuất dịch cây Trong vùng này là nơi phát sinh ra lá và các nhánh của các bó mạch Sự đổi màu do RSD không diễn ra ở phẩn giữa đốt Màu của mô nhiễm bệnh khác nhau về mức độ đậm nhạt và cường độ phụ thuộc vào mức độ nhiễm bệnh và các giống mía khác nhau, và nó cũng có thể khác nhau bên trong các giống Một vài giống thì không biểu hiện các triệu chứng này Các vùng bị biến đổi màu này rất đa dạng có thể là màu vàng, cam, hồng, đỏ, và hơi đỏ nâu và những màu này thường nổi bật lên trên trên nền màu trắng sáng của mô tế bào Có trường hợp bệnh tạo ra những vết đổi màu kem, khó có thể phân biệt trong toàn bộ đốt khi so sánh với mô của cây khỏe mạnh Nhưng khi các vệt này xuất hiện tại một nốt mà nốt kế cận lại không biểu hiện thì vẫn không chắc là nó có bị bệnh cằn mía gốc hay không Để chẩn đoán chính xác, thì các vệt đổi màu phải xuất hiện trên tất cả các nốt của cây

Triệu chứng của RSD trên chồi mía 1 - 2 tháng tuổi là sự chuyển hồng tại các đốt

còn non, nhưng nó diễn ra chỉ trong vài dòng mía và dưới những điều kiện canh tác

khác nhau Sự đổi màu diễn ra và khuyếch tán từ nốt lên 1 - 2 cm đến đỉnh sinh trưởng của nốt kết cận Phần đầu của đỉnh sinh trưởng không liên kết với RSD Những triệu chứng ban đầu được thấy rõ nhất khi cắt các chồi non theo chiều dọc

Hình 2.6 Triệu chứng của cây mía bị bệnh cằn mía gốc (Irvine, 1999)

Chú thích: A: Cây bệnh cằn cọc kém phát triển; B: Đốt thân ngắn; C: Vết đổi màu trong thân cây mía bị bệnh

Các triệu chứng khác xảy ra trên cây mía bị bệnh cằn mía gốc là cây còi cọc, kém phát triển hơn so với các cây cùng độ tuổi, đốt thân ngắn đường kính thân nhỏ hơn so với cây mía bình thường (Hình 2.6)

xyli có kích thước 0,25 - 0,35 x 1 - 4 μm (đôi khi dài đến

10μm) và sinh sản theo cách thức nhân đôi Hình dạng thẳng hay gậy mảnh, nhưng một vài tế bào lại căn phình ra ở ngoại biên hay ở giữa tế bào Mesosome thường hiện diện và thỉnh

thoảng xuất hiện khi hình thành vách ngăn Gần đây vi khuẩn Clavibacter xyli subsp xyli được phân loại trở lại sang một giống mới, là Leifsonia xyli subsp xyli (Evtushenko,

thành phần cấu tạo Protein của Lxx điện di với gel polyacryamide giống với băng điện di của các chủng vi khuẩn như Corynebacterium michiganensis, và các tác nhân gây bệnh có chứa 2,4 - diaminobutyric acid

2.4.4 Quy luật phát sinh phát triển bệnh

Bệnh lây truyền giữa các ruộng mía thông qua các dụng cụ thu hoạch như dao, máy cắt mía,.v.v do dịch chiết nước mía từ cây bị bệnh vẫn còn dính trên dụng cụ khi chuyển sang ruộng khác thu hoạch

Bởi vì bệnh thường khó nhận ra được bằng các triệu chứng bên ngoài nên các vi khuẩn này đã lan truyền từ vùng này sang vùng khác và từ quốc gia này sang các quốc gia khác thông qua các chương trình trao đổi giống cây trồng

Hình 2.7 Vi khuẩn Lxx

dưới kính hiển vi điện tử (x30.000 lần) (K E Damann, 2002)

2.4.5 Tầm quan trọng kinh tế

Hình hưởng của RSD gây ra trên cây mia chủ yếu là làm giảm năng suất của cây, tác động này phụ thuộc vào yếu tố giống và điều kiện thời tiết

Năng suất giảm mạnh mẽ khi cây bị hạn hán và có thể giảm đáng kể trong điều

kiện được tưới tiêu hợp lí

Bệnh trầm trọng hơn khi mía bước vào vụ mía gốc do đó bệnh làm giảm tốc độ phát triển của mía gốc và số vụ mía gốc của giống mía Hàm lượng đường thường không bị ảnh hưởng ngoại trừ khi cây bị chết

2.4.6 Kiểm soát bệnh

Giữ vệ sinh dụng cụ thu hoạch: trước và sau mỗi lần thu hoạch chúng ta đều phải làm sạch các dụng cụ thu hoạch trước khi cắt sang vườn cây sạch bệnh Chúng ta có

thể dùng cách đốt, hay sử dụng hóa chất không lây nhiễm

Làm sạch cây giống trước khi trồng ta dùng phương pháp ngâm chúng trong dòng nước nóng ở 52OC trong vòng 4 tiếng là có thể loại Lxx ra khỏi vật liệu trồng

Dùng giống kháng với bệnh cằn mía gốc

2.4.7 Các phương pháp chẩn đoán bệnh cằn mía gốc trên cây mía 2.4.7.1 Phương pháp chẩn đoán trực tiếp bằng kính hiển vi

Dịch chiết nước mía thu được bằng cách đẩy khí từ đầu này sang đầu kia của một đoạn thân cây mía và xem trực tiếp dưới kính hiển vi (không cần nhuộm) Kết quả dương tính trong chẩn đoán phụ thuộc vào kinh nghiệm của người quan sát rất nhiều, nguyên nhân ở đây là rất khó để nhận ra vi khuẩn trong dịch chiết nước mía, đặc biệt là khi nồng độ của chúng trong dịch chiết thấp

2.4.7.2 Phương pháp huyết thanh học

 Nhuộm kháng thể huỳnh quang (flourescent antibody staining)

Harris và Gillaspie (1978) là những người đầu tiên đưa ra phương pháp kháng thể huỳnh quang gián tiếp (indirect flourescent antibody technique - FAT) sử dụng kháng

huyết thanh đặc hiệu với Lxx để chẩn đoán RSD Brlansky và ctv (1982) đã phát hiện

Lxx trực tiếp trên mẫu mía bằng cách dùng kháng thể IgG đặc hiệu để gắn kết Lxx với

tetramethylrhodamine isothiocyanate (TRITC)

Davis (1985) tăng độ nhạy của FAT lên 100 lần bằng kỹ thuật đếm trực tiếp kháng thể gắn huỳnh quang trên màng lọc (FADCF) Màng lọc được kiểm tra có vi khuẩn gắn huỳnh quang hay không bởi kính hiển vi huỳnh quang ở độ phóng đại 1200 lần

 Phân tích miễn dịch học enzym liên kết với mô mẫu (Tissue Blot Enzym Immunoassay)

Kỹ thuật Tissue Blot Enzym Immunoassay (TBIA) là một dạng thay đổi của kỹ

thuật dot - blot assay, trong đó vi khuẩn được tách ra khỏi mô bị bệnh nhờ ly tâm và

dính lên màng nitrocellulose (NCM) Sau đó vi khuẩn sẽ được nhuộm kháng thể Những giếng màu xanh xuất hiện trên màng NCM là mẫu dương tính đối với vi khuẩn

Lxx khi đem phân tích miễn dịch học

 Dot Blot Assay

Thu dịch chiết từ đốt mía (50 μl) trộn với 10 mM PBS, pH 7,2 theo tỉ lệ 1:1 về thể tích 96 mẫu dịch chiết đã trộn với PBS được lọc qua màng màng lọc NCM kích thước lỗ 0,45 μm trên thiết bị lọc Tháo màng lọc ra khỏi thiết bị và đem sấy ở 80OC trong 60 phút trước khi đem nhuộm bằng phương pháp EIA/TBIA Các phản ứng dương tính

được nhận diện bằng các đốm màu xanh đậm trên màng

 Evaporative - binding Enzym Linked immunosorbent assay (EB - ELISA)

Phương pháp EB - ELISA do Croft và ctv đưa ra năm 1994 để chẩn đoán RSD Dịch chiết nước mía thu được ly tâm ở 3000 vòng trong 15 phút hay 13000 vòng trong 5 phút Dịch nổi được loại bỏ và tái huyền phù phần cặn lắng bằng 550 μl dịch đệm Mẫu phân tích được cho bay hơi hoàn toàn trong buồng ủ thoáng khí ở 350

C Sau khi ủ mẫu được đem đổ đĩa với hỗn hợp sữa không kem và kháng thể

Phương pháp EB - EIA có thể phát hiện vi khuẩn nuôi cấy trong môi trường với mật độ thấp hơn 105

tế bào/ml và 5.105 tế bào/trong dịch nhiễm

 Liquid Transfer Enzyme immunoassay (LT - EIA)

Leaman và ctv (1991) sử dụng phương pháp LT- EIA để chẩn đoán RSD và so

sánh phương pháp này với phương pháp FADCF LT - EIA phát hiện được Lxx ở mật

độ 5.101 tế bào/ml chiết và cho độ chính xác đến 98% FADCF có khả năng phát hiện 5.101 tế bào/ml và với độ chính xác đến 100% Tuy nhiên, FADCF khó có khả năng thực hiện được trên nhiều mẫu cùng lúc Phương pháp LT - EIA thích hợp cho việc kiểm tra một số lượng mẫu lớn.