Bước đầu tạo cây tiêu in Vitro kháng nấm Phytophthora sp.

Bước đầu tạo cây tiêu in Vitro kháng nấm Phytophthora sp.

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Thành phố Hồ Chí Minh 2006

MINISTRY OF EDUCATION AND TRAINING NONG LAM UNIVERSITY,HCHC DEPARTMENT OF BIOTECHNOLOGY



INITIAL RESEACH CREATE

PEPPER (Piper nigrum) IN VITRO RESISTANTTO Phytophthora sp

GRADUATION THESIS MAJOR: BIOTECHNOLOGY

Professor Student

MSc NGUYEN THI KIM LINH DINH VU THANG Dr LE ĐINH ĐON TERM: 2002 - 2006

HCMC, 09/2006

i

LỜI CẢM ƠN

Xin chân thành cảm ơn:

- Ban Giám Hiệu trường Đại học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh đã tạo mọi điều kiện cho tôi trong suốt thời gian học tập

- Các thầy cô trong Bộ môn Công Nghệ Sinh Học cùng các thầy cô đã trực tiếp giảng dạy trong suốt bốn năm qua

- Thầy Lê Đình Đôn và cô Nguyễn Thị Kim Linh đã tận tình hướng dẫn và động viên trong thời gian thực hiện đề tài tốt nghiệp

- Các anh chị phụ trách phòng 118 và 105 Khu Phượng Vỹ thuộc Bộ Môn Bảo Vệ Thực Vật - Đại học Nông Lâm TP HCM

- Thầy Trần Ngọc Hùng cùng các chị thuộc Trung tâm Công Nghệ Sinh Học Đại học Nông Lâm TP HCM

- Tập thể lớp CNSH28, hai bạn Nhã Trầm và Thanh Huyền lớp CNSH29 đã hỗ trợ, giúp đỡ và động viên tôi trong suốt thời gian học tập và làm đề tài

Thành kính ghi ơn ba mẹ cùng những người thân trong gia đình luôn tạo điều kiện và động viên con trong suốt quá trình học tập tại trường

TP Hồ Chí Minh tháng 08 năm 2006 Đinh Vũ Thắng

ii

TÓM TẮT

ĐINH VŨ THẮNG, Đại học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh, tháng 8 năm 2006 “BƯỚC

ĐẦU TẠO CÂY TIÊU (Piper nigrum) IN VITRO KHÁNG NẤM Phytophthora sp.”

Giáo viên hướng dẫn: TS LÊ ĐÌNH ĐÔN

ThS NGUYỄN THỊ KIM LINH

Đề tài “Bước đầu tạo cây tiêu (Piper nigrum) in vitro kháng nấm Phytophthora sp.” được tiến hành giai đọan đầu là giai đoạn tạo ra cây tiêu trong phòng

thí nghiệm tại Bộ môn Công Nghệ Sinh Học và Bộ môn Bảo Vệ Thực Vật – Trường Đại Học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh từ tháng 2 đến tháng 6 năm 2006

Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của dịch chiết nấm Phytophthora đến

khả năng hình thành chồi từ mô sẹo tiêu

 Tạo mô sẹo từ mẫu lá cây tiêu in vitro

Thí nghiệm được thực hiện trên môi trường MS có bổ sung 1mg/L 2,4D và 3mg/L BA

 Nuôi cấy tạo dịch nấm Phytophthora

 Thí nghiệm chủng dịch nấm Phytophthora trong môi trường nuôi cấy

mô sẹo cây tiêu

Thực hiện chủng dịch nấm Phytophthora vào môi trường nuôi cấy mô sẹo tiêu

với nhiều nồng độ dịch nấm khác nhau (bảng bố trí thí nghiệm)

Thí nghiệm 2: Nhuộm mẩu mô sẹo

Nhuộm mẫu bằng phẩm nhuộm hai màu là dung dịch gồm hai thứ phẩm nhuộm: - Phẩm đỏ Carmin sẽ nhuộm màu hồng lạt hay tím lạt nếu màng tế bào bằng chất cellulose pectic

- Phẩm xanh lục vert d’iod sẽ nhuộm màu xanh lục nếu màng tế bào bằng chất gỗ (ligin) hay bần (suberin)

iii

Bố trí thí nghiệm chủng dịch nấm Phytophthora trong môi trường

nuôi cấy mô sẹo cây tiêu

Phương pháp vô trùng

Nghiệm thức

Nồng độ dịch nấm (%)

Số

chai Số mẫu/chai Tổng số mẫu

PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

2.1 Nguồn gốc và lịch sử phát triển cây tiêu 3

2.2 Tình hình sản xuất và tiêu thụ hạt tiêu trên thế giới và Việt Nam 3

2.2.1 Thế giới 3

2.2.2 Việt Nam 4

2.2.2.1 Tình hình sản xuất 4

2.2.2.2 Tình hình tiêu thụ 7

2.3 Tình hình bệnh trên cây tiêu 8

2.3.1 Bệnh chết nhanh dây tiêu do nấm Phytophothra gây ra 8

2.3.2 Điều kiện phát sinh bệnh, phát triển bệnh 9

2.4 Giới thiệu về giống Phytophthora 9

2.5 Lịch sử phát triển của nuôi cấy mô tế bào thực vật 10

2.6 Sự hình thành và phát triển của mô sẹo 15

2.6.1 Sự hình thành mô sẹo 15

2.6.2 Sự hình thành chồi từ mô sẹo 17

2.7 Các nhóm chất kích thích ảnh hưởng lên quá trình tạo mô sẹo 17

v

2.7.1 Auxin 17

2.7.1.1 Tính chất sinh lý của Auxin 18

2.7.1.2 Auxin trong cây trồng 18

2.7.1.3 Các chất auxin tổng hợp 19

2.7.2 Cytokinine 19

2.7.2.1 Tính chất sinh lý của Cytokinine 20

2.7.2.2 Cytokinine trong cây trồng 20

2.8 Một số nghiên cứu tạo cây kháng bệnh bằng phương pháp nuôi cấy in vitro 20

3.2.5 Môi trường cơ bản dùng trong thí nghiệm 23

3.3 Vật liệu nuôi cấy 23

3.4 Phương pháp thí nghiệm 24

3.4.1 Thí nghiệm : Ảnh hưởng của dịch chiết nấm Phytophthora đến khả năng hình thành chồi từ mô sẹo tiêu 24

3.4.1.1 Tạo mô sẹo từ mẫu lá cây tiêu in vitro 24

3.4.1.2 Nuôi cấy tạo dịch nấm Phytophthora 24

3.4.2.3 Thí nghiệm chủng dịch nấm Phytophthora trong môi trường nuôi cấy mô sẹo cây tiêu 25

3.4.4 Nhuộm mẫu mô sẹo và xem kết quả dưới kính hiển vi 27

3.5 Phân tích thống kê 27

PHẦN 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 28

4.1 Thí nghiệm : Ảnh hưởng của dịch chiết nấm Phytophthora đến khả nằng hình thành chồi từ mô sẹo tiêu 28

4.1.1 Tạo mô sẹo từ mẫu lá cây tiêu in vitro 28

vi

4.1.2 Thí nghiệm chủng dịch nấm Phytophthora trong

môi trường nuôi cấy mô sẹo cây tiêu 28

4.3 Nhuộm mẫu mô sẹo tiêu sau 10 tuần nuôi cấy 34

viii

DANH SÁCH CÁC BẢNG

Bảng 2.1 Sản lượng tiêu của những quốc gia sản xuất tiêu từ 1991-1996 5

Bảng 2.2 Tình hình sản xuất hồ tiêu các tỉnh trọng điểm (1997 - 1999) 6 Bảng 2.3 Tình hình sản xuất - xuất khẩu

hạt tiêu của Việt Nam và thương mại quốc tế 7

Bảng 2.4 Thị trường và số lượng hạt tiêu xuất khẩu từ

1996 – 6 tháng đầu năm 2000 (Tại cảng Sài Gòn - Thành phố Hồ Chí Minh) 7 Bảng 3.1 Bố trí thí nghiệm chủng dịch nấm

Phytophthora trong môi trường nuôi cấy mô sẹo cây tiêu 26

Bảng 4.1 Kết quả tái sinh chồi và

hệ số tăng trưởng mô sẹo sau 90 ngày cấy 29

1mg/L 2,4-D và 3mg/L BA sau 90 ngày nuôi cấy 31 Hình 4.3 Chồi tiêu hình thành từ mô sẹo trên môi trường MS có bổ sung 1mg/L

2,4-D, 3mg/L BA và 5% dịch nấm, hấp khử trùng sau 90 ngày nuôi cấy 31 Hình 4.4 Chồi tiêu hình thành từ mô sẹo trên môi trường MS có bổ sung 1mg/L

2,4-D, 3mg/L BA và 10% dịch nấm, hấp khử trùng sau 90 ngày nuôi cấy 32 Hình 4.5 Chồi tiêu hình thành từ mô sẹo trên môi trường MS có bổ sung 1mg/L

2,4-D, 3mg/L BA và 20% dịch nấm, hấp khử trùng sau 90 ngày nuôi cấy 32 Hình 4.6 Chồi tiêu hình thành từ mô sẹo trên môi trường MS có bổ sung 1mg/L

2,4-D, 3mg/L BA và 5% dịch nấm, lọc vô trùng sau 90 ngày nuôi cấy 33 Hình 4.7 Chồi tiêu hình thành từ mô sẹo trên môi trường MS có bổ sung 1mg/L

2,4-D, 3mg/L BA và 10% dịch nấm, lọc vô trùng sau 90 ngày nuôi cấy 33 Hình 4.8 Chồi tiêu hình thành từ mô sẹo trên môi trường MS có bổ sung 1mg/L

2,4-D, 3mg/L BA và 20% dịch nấm, lọc vô trùng sau 90 ngày nuôi cấy 34 Hình 4.9 Mặt cắt mặt dưới mô sẹo cây tiêu nuôi cấy trên môi trường MS có

bổ sung 1mg/L2,4D, 3mg/L BA sau 10 tuần (độ phóng đại 4x10) 35 Hình 4.10 Mặt cắt mặt dưới mô sẹo cây tiêu nuôi cấy trên môi trường MS có

bổ sung 1mg/L2,4D, 3mg/L BA và 10% dịch nấm sau 10 tuần

(độ phóng đại 4x10) 35

PHẦN 1 GIỚI THIỆU

1.1 Đặt vấn đề

Cây hồ tiêu (Piper nigum L ) là loại cây công nghiệp có giá trị kinh tế cao, nó

mang lại nguồn thu nhập chính cho nhiều hộ gia đình ở nước ta Hạt tiêu là một loại gia vị được ưa chuộng trên khắp thế giới Hạt tiêu có vị cay, có mùi thơm là gia vị không thể thiếu của nhiều món ăn Ngoài ra tiêu còn được dùng trong công nghiệp chế biến hương liệu, nước hoa và trong y dược

Việt Nam là một nước có điều kiện khí hậu rất thuận lợi cho việc trồng và phát triển cây hồ tiêu Trong những năm gần đây diện tích trồng tiêu của nước ta đã gia tăng rất nhanh nhất là vùng miền Đông Nam Bộ và Tây Nguyên Cùng với việc gia tăng về diện tích là việc gia tăng về sản lượng xuất khẩu Do đó, áp lực dịch bệnh ngày càng gia tăng trong các vườn tiêu Trong đó bệnh chết nhanh dây tiêu do nấm

Phytophthora gây ra thực sự là một tai họa cho nhà vườn ở các vùng tiêu nguyên liệu

lớn ở nước ta Bệnh xuất hiện và lây lan rất nhanh, thường làm tiêu chết hạng loạt, thiệt hại năng suất trầm trọng, vì vậy việc hạn chế thiệt hại do loại bệnh này gây ra là một yêu cầu cấp thiết hiện nay

Hiện nay trên thế giới chưa có một dòng tiêu thương mại nào có khả năng

kháng với nấm Phytophthora Tuy nhiên, một vài dòng tiêu có khả năng chống chịu

với loại nấm này đã được tìm thấy ở Ấn Độ, Malaysia và Indonesia

Ở Việt Nam đã có nhiều nghiên cứu về các biện pháp phòng trừ loại nấm này nhưng chưa có biện pháp nào thực sự có hiệu quả và lâu dài Người dân chủ yếu sử dụng thuốc hóa học làm biện pháp chính để hạn chế bệnh nhưng không có hiệu quả Sử dụng thuốc hóa học rất tốn kém và dẫn đến các tác hại đối với môi trường Các nghiên cứu về biện pháp sử dụng nấm đối kháng vẫn chưa thực sự có hiệu quả Vì vậy

cần phải có những dòng tiêu có khả năng chống chịu với nấm Phytophthora để làm

giảm thiệt hại do loại nấm này gây ra Trước những yêu cầu cấp thiết đó chúng tôi

quyết định thực hiện đề tài “Tạo cây tiêu (Piper nigrum) in vitro kháng nấm Phytophthora sp.” để tạo ra những dòng tiêu có khả năng chống chịu với nấm

Phytophthora nhằm làm giảm thiệt hại của loài nấm này gây ra

1.2 Mục đích

- Tạo cây tiêu có khả năng chống chịu nấm Phytophthora

1.3 Yêu cầu

- Thực hiện chủng dịch nấm Phytophthora vô trùng với nhiều nồng độ khác

nhau trên mô sẹo tiêu

- Bước đầu tạo ra nhiều cá thể sau đó thực hiện việc chọn lọc các cá thể có tính kháng cao

- Thực hiện nhuộm mẫu mô sẹo tiêu, xem hình thái để bước đầu đánh giá ảnh hưởng của dịch nấm đối với sự phát triển của mô sẹo

1.4 Giới hạn đề tài

Do giới hạn về thời gian nên đề tài chỉ dừng lại ở giai đoạn tạo ra cây tiêu in vitro

trong phòng thí nghiệm

PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Nguồn gốc và lịch sử phát triển cây tiêu

Cây tiêu (Piper nigrum) thuộc họ Piperaceae Có nguồn gốc từ tây nam Ấn Độ

nằm ở vùng Ghats và Assam, mọc hoang trong rừng, được người Ấn Độ phát hiện, sử dụng đầu tiên và cho rằng việc phát hiện này là rất quý giá

Đến đầu thế kỷ thứ XIII cây tiêu mới được trồng rộng rãi và sử dụng trong bữa

ăn hàng ngày Lúc này, cây tiêu đã được trồng cả ở Indonesia và Malaysia Đến thế kỷ

thứ XVIII cây tiêu được trồng ở Srilanka và Campuchia Vào đầu thế kỷ thứ XX thì cây tiêu được trồng tiếp ở các nước nhiệt đới như Châu Phi như: Madagasca, Nigieria, Congo và ở châu Mỹ như: Brazil, Mexico…

Ở nước ta cây tiêu được trồng rất lâu từ trước khi người Pháp đến xâm chiếm Khi những người Trung Hoa di dân vào Campuchia ở dọc vùng biển vịnh Thái Lan như: Konpong Trach, Kep, Campot và lúc đó tiêu được trồng ở nước ta chủ yếu ở đảo Phú Quốc, Hòn Chông, Hà Tiên, một số ít ở Bà Rịa và Thủ Dầu Một

2.2 Tình hình sản xuất và tiêu thụ hạt tiêu trên thế giới và Việt Nam 2.2.1 Thế giới

Theo thống kê của FAO thì hiện nay trên thế giới có khoảng 70 nước trồng tiêu 1954 toàn thế giới có khoảng 64.000 tấn hột tiêu

1978 là 160.000 tấn hột tiêu 1983 là 180.000 tấn hột tiêu

Sau 1982 sản lượng tiêu trên thế giới giảm dần do sâu bệnh và thời tiết Đồng thời một phần cũng do sự ô nhiễm môi trường gây ảnh hưởng tới sự thụ phấn của hoa tiêu

Đến năm 1989-1990 diện tích trồng tiêu trên toàn thế giới đã tăng vọt và sản lượng đạt khoảng 185.000 tấn tiêu hột Các nước sản xuất tiêu nhiều nhất trên thế giới lúc này là Ấn Độ, Indonesia, Malaysia, Brazil, Madagasca và Srilanka

Hiện nay, những nước trồng tiêu nhiều nhất là Ấn Độ, Indonesia và Việt Nam Trên thế giới mức tiêu thụ hạt tiêu hàng năm đạt khoảng 4-5% Các sản phẩm được trao đổi dưới dạng: tiêu đen, tiêu trắng, tiêu xanh và dầu nhựa tiêu Hiện nay, nước Mỹ đang đứng đầu về nhập khẩu tiêu với khoảng 1/3 lượng tiêu của thế giới Sau

đó là các nước Nga, Đức, Pháp, Ý và thị trường của Anh Ngoài ra thị trường các nước Trung Đông và Bắc Phi cũng đang tiêu thụ ngày càng nhiều (Bảng 2.1)

2.2.2 Việt Nam

2.2.2.1 Tình hình sản xuất

Trước năm 1975, Miền Bắc được trồng chủ yếu ở Nghệ An, Quảng Bình và Miền Nam được trồng ở Phú Quốc, Long Khánh, Lộc Ninh Năm 1995 diện tích từng bước gia tăng song biến động không ổn định bởi thiên tai, bệnh tật Từ 1990-1995 do giá tiêu bị giảm mạnh và không có thị trường tiêu thụ nên các vườn tiêu bị phá đi rất nhiều

Từ năm 1996 các nước như Indonesia, Brazil,… bị ảnh hưởng của thiên tai, khu vực Đông Nam Á bị khủng hoảng tài chính, nên giá tiêu đã gia tăng lên 4.000 USD/tấn vào năm 2000, và đó là cơ hội thuận lợi cho hồ tiêu Việt Nam vươn lên chiếm lĩnh thị trường hạt tiêu thế giới

Năm 1997-1999 diện tích tiêu tăng từ 9.777 lên 15.461 ha Diện tích tiêu tăng nhanh nhất ở vùng Đông Nam Bộ từ 5.893 ha tăng lên 9.115 ha (chiếm 60,27% diện tích tiêu của cả nước) (Bảng 2.2)

Năng suất tăng chậm và có sự sai khác rất lớn giữa các vùng và tỉnh có trồng tiêu Năng suất bình quân năm 1997 là 2,08 tấn/ha đến năm 1999 cũng chỉ đạt 2,12 tấn/ha nhưng cao nhất là ở vùng Đông Nam Bộ đạt 2,55 tấn/ha, trong khi năng suất thấp nhất là ở vùng Bắc Trung Bộ chỉ đạt 0,75 tấn/ha (bằng 29,4% so với năng suất tiêu của vùng Đông Nam Bộ) Đặc biệt tỉnh Bình Phước với diện tích thu hoạch 2.405 ha, năng suất đạt 3,8 tấn/ha (gấp 6,9 lần năng suất tiêu của tỉnh Quảng Bình)

Năng suất bình quân năm 1997 đạt 18.970 tấn Sản lượng tiêu tính trên diện tích cho thu hoạch theo thống kê năm 1997 là 13.007 tấn và năm 1999 tăng lên 18.970 tấn song thực tế xuất khẩu năm 1999 đạt 34.000 tấn Tổng lượng tiêu 3 năm 1997-1999 là 47.860 tấn trong khi lượng tiêu xuất khẩu lại là 74.500 tấn (Bảng 2.3)

Bảng 2.1 Sản lƣợng tiêu của những quốc gia sản xuất tiêu từ 1991-1996 (đơn vị: tấn)

bình Asia & Pacific 182,016 183,721 144,976 158,028 169,189 153,988 165,320 India 55,000 60,000 55,000 50,000 55,000 60,000 55,833 Indonesia 61,000 62,000 23,500 42,500 59,000 39,200 47,867 Malaysia 29,000 26,000 17,600 16,000 13,000 12,000 18,933 Vietnam 8,900 7,830 18,500 20,000 20,000 20,000 15,872 China P.R 13,108 12,321 10,461 12,409 5,000 8,000 10,217 Thailand 10,443 10,500 9,000 10,104 10,949 9,773 10,128 Sri Lanka 2,850 3,255 9,000 5,000 3,725 3,000 4,472 Cambodia 1,700 1,800 1,900 2,000 2,500 2,000 1,983

Bảng 2.2 Tình hình sản xuất hồ tiêu các tỉnh trọng điểm (1997 - 1999) Đơn vị tính: DT (ha); NS (tấn/ha); SL (tấn)

Nguồn: Tổng cục thống kê Việt Nam, năm 2000

Số thứ tự

Hạng Mục

Diện tích Tổng số

Bảng 2.3 Tình hình sản xuất - xuất khẩu hạt tiêu của Việt Nam và thương mại quốc tế

Đơn vị tính: Tấn

Năm Sản lượng hạt tiêu sản xuất

Khối lượng xuất khẩu

Thương mại quốc tế 1996

1997 1998 1999

Tổng cộng

10.500 13.007 15.883 18.970

58.360

25.300 24.700 23.000 34.800

107.800

195.700 243.700 225.000

Nguồn: Bộ thương mại, năm 2000

Thị trường tiêu xuất khẩu chủ yếu của Việt Nam (1996-6/2000) là các nước: Mỹ, các nước EU, Singapore

Bảng 2.4 Thị trường và số lượng hạt tiêu xuất khẩu từ 1996 – 6 tháng đầu năm 2000

(Tại cảng Sài Gòn - Thành phố Hồ Chí Minh)

(tấn)

Thị trường nhập 1996

1997 1998 1999

6 tháng đầu năm 2000

Tổng cộng

24.776,80 20.815,51 7.669,78 28.593,42 28.801,16

110.656,67

Mỹ, Ấn Độ, Singapore, EU, Hà Lan, Pháp, Ai Cập, Hồng Kông, Malaysia, Sudan, UAE, Bulgaria, Pakistan, Kuwait, Israel, Hy lạp, Đức, Hungari, Nga, Tây Ban Nha

Nguồn: Kiểm dịch - Cục BVTV, năm 2000

2.3 Tình hình bệnh trên cây tiêu

2.3.1 Bệnh chết nhanh dây tiêu do nấm Phytophothra gây ra

Thành phần bệnh hại trên tiêu rất đa dạng và phong phú, chúng làm cho cây suy yếu, héo vàng rồi làm chết cây hay làm cho cây không phát triển nổi, nhưng cũng có bệnh làm cho cây tiêu chết rất nhanh trong vòng 3-4 ngày, chết hàng loạt, phổ biến ở tất cả các vùng tiêu nguyên liệu trên thế giới như Malaysia, Indonesia, Ấn Độ, Brazil, Srilanka, Thái Lan và Việt Nam

Trong các bệnh hại trên tiêu như: thán thư (Colletotrichum gloeosprioides), đen lá (Lansiondiplodia theobromce), đốm lá (Rosellina sp.), khô vằn (Rhizoctonia solani), bệnh chết nhanh dây tiêu (Phytophthora parasitica), bệnh chậm lớn cây lùn, bệnh tiêu điên và

bệnh do tuyến trùng gây ra Trong đó bệnh chết nhanh dây tiêu thật sự là một tai họa cho nhà vườn, bệnh xuất hiện và lây lan rất nhanh, thường làm tiêu chết hàng loạt gây mất

trắng hay làm giảm năng suất trầm trọng Bệnh thường do nấm Phytophthora sp sống trong đất gây ra, đôi khi con kết hợp với các nấm khác như Fusarium sp., Pythium sp.,

Rhizoctonia sp cùng tấn công làm cây tiêu chết nhanh chóng Bệnh thường xảy ra trong

mùa mưa khi có khí hậu nóng và ẩm (Trần Văn Hòa, 2001)

Theo kết quả nghiên cứu của bộ môn Bảo Vệ, Viện Kỹ Thuật Khoa Học Nông Lâm Nghiệp Tây Nguyên năm 1999 thì bệnh này xuất hiện với tỷ lệ thấp (0.11% ở Gia Lai), chưa được coi là bệnh nguy hiểm cho cây tiêu ở vùng Tây Nguyên nhưng đến năm 2000-2001 bệnh đã gây thành dịch ở một số vùng EaHLeo, Easup, CưM’gar thuộc tỉnh Đắc Lắc Ở tỉnh Gia Lai, vùng bị thiệt hại nặng là Mang Yang (Tạp chí thông tin khoa học kỹ thuật Nông Lâm Nghiệp, số 1/2001)

Từ khi cây tiêu rũ lá vàng và rụng hàng loạt chỉ trong 5-7 ngày Bệnh lây lan rất nhanh, qua đất, qua nước tưới, cả vườn tiêu bị hại chỉ trong vòng vài tuần hay vài tháng Khi thấy triệu chứng héo dây thì bộ rễ đã bị nấm tấn công trước 1,5-2 tháng, do đó bệnh rất khó phòng trị (Trần Văn Hòa, 2001)

Trong vườn có khoảng 5-7% cây chết thì phần lớn cây khác đã bị nấm tấn công Thực tại các vườn tiêu chuyên canh ở Bình Phước, Bà Rịa – Vũng Tàu, Đồng Nai hiện đang bị bệnh này tàn phá dữ dội, có vườn hầu như chết hoàn toàn gây mất trắng năng suất Bệnh này hại hầu hết các bộ phận của cây tiêu: Thân, rễ, lá, cổ rễ, trái Bộ phận rễ và phần thân ngầm bị nấm tấn công thối đen, vỏ bong ra khỏi rễ, phần dây trên mặt đất bị

héo, lá chuyển sang màu vàng và rụng hàng loạt trong 7-14 ngày, để lại cành trơ trụi và khô đi, sau đó toàn cây bị héo đen và chết Vào mùa mưa bệnh xuất hiện ở lá dưới những vòng nâu đen, tập trung ở đầu lá, các đốm lớn dần, có màu nâu sậm và rất dễ rụng Khi bệnh tấn công vào dây, thân, lá bị bệnh và rụng, cùng lúc đó lóng cũng bị rụng

Đến nay chưa có biện pháp hữu hiệu để trị nấm Phytophthora khi đã bị xâm

nhập vào cây tiêu Khi bệnh đã rồi thì không còn chữa trị được nữa, cho nên hiện nay phòng bệnh là biện pháp chủ yếu để làm giảm tối thiểu thiệt hại do nấm

Phytophthora gây ra

2.3.2 Điều kiện phát sinh bệnh, phát triển bệnh

Bệnh héo nhanh do nấm Phytophthora sp tấn công trên cây tiêu thường xảy ra

trong mùa mưa, khi có khí hậu nóng và ẩm Bệnh xảy ra trên những vườn thoát nước

kém, đất bị úng nước hoàn toàn là điều kiện cho nấm phát triển Nấm Phytophthora

sống trong đất dưới hình thức các sợi nấm (mycelium) hoặc các bào tử có vách dày gọi là noãn bào tử (oospores), các noãn bào tử tồn tại hàng năm trong đất Khi đất ẩm, các noãn bào tử nảy mầm cho ra các sợi nấm (mycelia), các sợi nấm sinh ra các bào tử nang (sporangia), các bào tử nang chứa các cá thể gây bệnh gọi là động bào tử (zoospores) Các động bào tử chỉ phóng thích ra ngoài bào tử nang để đi gây bệnh khi đất bị úng nước hoàn toàn Khi ra ngoài các động bào tử dùng roi (flagella) bơi tới các rễ cây để gây bệnh hay bơi theo dòng nước mưa để tới các nơi khác trong vườn, làm bệnh lây lan rất nhanh Vườn bị ngập úng nước càng lâu thì áp lực bệnh càng lớn Ngoài ra tuyến trùng cũng tạo điều kiện thuận lợi cho nấm phát triển, tuyến trùng xâm

nhập vào rễ tạo vết thương hở cho nấm xâm nhập vào gây bệnh (Trần Văn Hòa, 2001)

2.4 Giới thiệu về giống Phytophthora

Phytophthora (Gr Phyton: Thực vật; phthora: phá hoại), được đặt bởi Bary

(1876) Nấm Phytophthora là loại khá phổ biến của lớp Oomycetes thuộc họ

Pythiacea, bộ Pernoporales, sợi nấm không màu, không vách ngăn, đơn bào, kích thước không đều, túi bào tử có hình trứng và hình quả chanh, trên đầu có nuốm hoặc không có nuốm, không màu, trong suốt Bào tử hình cầu hoặc hình thận có hai lông roi, di chuyển rất nhanh trong nước, nhiệt độ thích hợp để nấm sinh trưởng và phát triển từ 25-30oC, pH 6-7

Các loài Phytophthora tấn công một phạm vi thực vật rộng lớn và là tác nhân

gây một số dịch bệnh nghiêm trọng trên thế giới – điểm hình như bệnh mốc sương mai (hay tàn lụi muộn) trên khoai tây đã gây ra nạn đói ở Châu Âu những năm 1840,

nguyên nhân do nấm P infestans (Bourke, 1964) Bệnh Phytophthora đã được nghiên

cứu sâu tại Châu Âu Tuy nhiên đây lại là bệnh khá phổ biến ở vùng nhiệt đới ẩm và gây nhiều bệnh nguy hiểm làm mất mùa ở nhiều loại cây ăn quả quan trọng ở những

vùng này; như bệnh thối rễ, thối ở cổ rễ, loét thân, tàn lụi lá và thối trái Nấm P

palmivora đã gây rất nhiều bệnh trên nhiều loại cây trồng khác nhau: đen vỏ cacao;

thân và trái đu đủ; thối rễ và tàn lụi trên cam quýt; thối chồi trên cọ; sọc đen trên cao su; thối rễ loét thân sầu riêng; chết nhanh trên tiêu Trên cây tiêu dòng nấm

Phytophthora gây hại được xác định là nấm Phytophthora sp gây hại chủ yếu trong

mùa mưa, nhất là vào cuối mùa mưa khi có khí hậu ấm và ẩm Nấm Phytophthora sp có thể tấn công riêng lẻ nhưng đa số có sự kết hợp với các nấm khác như Fusarium,

Pythium và Rhizoctonia

Có thể nói Phytophthora là một nhóm lớn có mặt khắp mọi nơi trên thế giới và có hơn 1000 cây ký chủ, một vài loài của Phytophthora đã trở thành dịch hại (Gregory, 1983) Trong khi P cinnamomi được tìm thấy ở vùng nhiệt đới thì P palmivora, P

paracitica (P nicotianae) và P citrophthora là đặc trưng ở vùng nhiệt đới và cận

nhiệt đới; P infestans, P syringae và P fragariae xuất hiện phổ biến ở vùng ôn đới

2.5 Lịch sử phát triển của nuôi cấy mô tế bào thực vật

Năm 1983, hai nhà sinh vật học Đức Schleiden và Schwan đã đề xướng thuyết tế bào và nêu rõ: mọi cơ thể sinh vật phức tạp đều gồm nhiều đơn vị nhỏ các tế bào hợp thành Các tế bào đã phân hóa đều mang các thông tin di truyền có trong tế bào đầu tiên, đó là trứng sau khi thụ tinh, và là những đơn vị độc lập, từ đó có thể xây dựng lại toàn bộ cơ thể

Năm 1902, Haberlandt là người đầu tiên đưa các giả thuyết của Schleiden và Schwan vào thực nghiệm Ông viết trong một tác phẩm như sau: “Để kết luận, tôi tin tưởng rằng tôi không đưa ra một tiên đoán quá táo bạo nếu cho rằng bằng nuôi cấy, người ta có khả năng tạo các phôi nhân tạo từ các tế bào soma” Haberlandt đã gặp thất

bại trong nuôi cấy từ lá một số cây một lá mầm như: Erythronium, Ornithogalum,

Tradescantia Ngày nay, chúng ta biết rất rõ thất bại của Haberlandt vì các cây một lá

mầm rất khó nuôi cấy, hơn nữa, ông đã dùng những tế bào đã mất khả năng tái sinh Năm 1922, Kotte, học trò của Haberlandt, và Robins, người Mỹ, lập lại thí nghiệm của Haberlandt với đỉnh sinh trưởng tách từ đầu rễ một cây hòa thảo Trong môi trường lỏng gồm có muối khoáng và glucose, đầu rễ sinh trưởng khá mạnh, tạo nên một hệ rễ nhỏ có cả rễ phụ Tuy nhiên, sự sinh trưởng như vậy chỉ tồn tại một thời gian, sau đó chậm dần và ngừng lại, mặc dù các tác giả đã chuyển sang môi trường mới

Năm 1934, bắt đầu giai đoạn thứ hai của nuôi cấy mô tế bào thực vật, khi White

nuôi cấy thành công trong một thời gian dài rễ cây cà chua (Lycopersicum esculentum)

với một môi trường lỏng chứa muối khoáng, glucose và nước chiết nấm men Sau đó ít lâu, White chứng minh là có thể thay thế nước chiết nấm men bằng hỗn hợp ba loại vitamin nhóm B: thiamine (B1), pyridoxine (B6) và nicotinic acid Từ đó, việc nuôi cấy đầu rễ trong thời gian vô hạn đã được tiến hành ở nhiều cây khác nhau

Cũng trong thời gian này Gautheret ở Pháp đã tiến hành các nghiên cứu nuôi cấy mô tượng tầng một số cây gỗ Sau khi Went và Thimann phát hiện chất điều hóa sinh trưởng (hormon) đầu tiên, acid- -indolacetic (IAA), và kết tinh được chất này, Gautheret xác nhân tác dụng kích thích sinh trưởng mô sẹo của IAA và nhóm 3 vitamin do White đề nghị Cùng với Nobercourt, năm 1939, Gautheret đã thành công

trong việc duy trì sự sinh trưởng trong thời gian vô hạn của mô sẹo cà rốt (Daucus

carota) trên một môi trường rắn bằng thạch, bằng cách cấy chuyền 6 tuần một lần

Năm 1941, Overbeck chứng minh tác dụng kích thích sinh trưởng của nước dừa

trong nuôi cấy phôi họ cà (Datura) Sau đó, năm 1948, Steward xác nhận tác dụng

nước dừa trên mô sẹo cà rốt Trong thời gian này, nhiều chất sinh trưởng nhân tạo thuộc nhóm auxin được nghiên cứu và tổng hợp thành công Chất -napthyl acetic acid (NAA) và chất 2,4-dichloro phenoxy acetic acid (2,4D) được bắt đầu sử dụng để trừ lá cỏ rộng trong nông nghiệp Nhiều tác giả đã nhận thấy rằng cùng với nước dừa, 2,4D và NAA đã giúp tạo mô sẹo, gây phân chia tế bao thành công ở nhiều đối tượng thực trước đây rất khó nuôi cấy

Năm 1954, Skoog đã tình cờ thấy, nếu thêm một ít chế phẩm đã để lâu của acid desoxyribonucleic (DNA) lấy từ tinh dịch cá bẹ vào môi trường nuôi cấy các mảnh mô

thân cây thì tác dụng kích thích sinh trưởng trở nên rõ rệt Phòng thí nghiệm Skoog cố gắng tìm bản chất hiện tượng kích thích sinh trưởng của DNA DNA mới ly trích từ tinh dịch cá bẹ không có tác dụng nhưng nếu đem hấp trong hơi acid thì mẫu DNA cũng có hoạt tính như mẫu DNA cũ Skoog cho rằng chất có hoạt tính là một sản phẩm phân giải của DNA Năm 1955, chất này được xác lập là 6-furfurylaminopurine và được Skoog đặt tên là Kinetin do tác dụng kích thích sự phân bào Sau này người ta chứng minh rằng sự phân bào của thực vật trong tự nhiên cũng do chất hóa học tương tự như kinetin điều khiển và gộp các chất này vào nhóm cytokinin Chất cytokinin đầu tiên được tách từ thực vật bậc cao là zeatin lấy từ mầm ngô

Việc phát hiện vai trò của IAA, NAA, 2,4D và kinetin cùng với phát hiện vai trò của các vitamin và nước dừa là những bước tiến rất quan trọng trong giai đoạn phát triển thứ hai cùa nuôi cấy mô thực vật, đó là tiền đề kỹ thuật cho việc xây dựng các môi trường xác định về mặt hóa học và cho việc làm các thí nghiệm ổn định dẫn đến các giai đoạn tiếp theo của ngành khoa học này

Năm 1957, Skoog và Miller công bố các kết quả nghiên cứu về ảnh hưởng của tỷ lệ kinetin/auxin trong môi trường nuôi cấy đối với việc hình thành các cơ quan của mô sẹo thuốc lá Khi giảm thấp tỷ lệ kinetin/auxin, mô sẹo có khuynh hướng phát triển rễ, ngược lại nếu tỷ lệ kinetin/auxin tăng thì dẫn đến hiện tượng tạo chồi ở mô sẹo Hiện tượng này được xác nhận trên nhiều cây khác nhau và đóng góp rất lớn vào điều khiển sinh trưởng, phát triển, phát sinh cơ quan của mô tế bào trong nuôi cấy Thành công của Skoog và Miller dẫn đến nhiều phát hiện quan trọng khác, mở đầu cho giai đoạn thứ ba của lịch sử nuôi cấy mô thực vật

Trong thời gian từ 1954 đến 1959, kỹ thuật tách và nuôi cấy tế bào đơn, các tế bào sống độc lập không dính với các tế bào khác đã được phát triển Muir, Hildebrandt và Riker đã tách các tế bào mô sẹo thành một dịch huyền phù các tế bào đơn bằng cách đưa lắc trên máy lắc Nickell (1956) nuôi liên tục được một huyền phù tế bào đơn cây

đậu (Phaseolus vulgaris) Melches và Beckman (1959) đã nuôi liên tục tế bào đơn

trong các bình dung tích khá lớn bằng cách sục khí liên tục và thỉnh thoảng thu hoạch tế bào, thêm dung dịch dinh dưỡng mới Kỹ thuật nuôi cấy tế bào đơn đã phát triển cao độ với các thiết bị tinh vi phức tạp do Street và những người cộng tác đề nghị Năm 1960 Bergman công bố có thể dùng phương pháp lọc đơn giản để thu được một huyền

phù không có tế bào dính cụm ma gồm hầu hết là tế bào đơn Các tế bào đơn có thể gieo trên môi trường, trong các hộp lồng, tiếp tục sống, phân chia và tái tạo mô sẹo Cùng với kỹ thuật gieo tế bào của Bergman, nhiều tác giả đã thành công trong việc tạo dựng được một cây hoàn chỉnh từ một tễ bào, chứng minh một cách tốt đẹp tính toàn thế của tế bào thực vật Khả năng nuôi cấy tế bào thực vật trong các bình lên men dùng trong công nghiệp vi sinh và khả năng tái tạo cây hoàn chỉnh từ tế bào đã mở ra những triển vọng mới trong việc tạo dòng tế bào đột biến, các dòng tế bào siêu sản xuất (over production) một sản phẩm thứ cấp nào đó và khả năng tăng tần suất đột biến trong di truyền đột biến ở thực vật bậc cao

Người ta bắt đầu chú ý đến kỹ thuật nuôi cấy túi phấn sau khi Guha và Maheswari (1966) công bố tạo thành công cây đơn bội từ nuôi cấy túi phấn cây cà độc

dược (Datura inoxia) Một năm sau, nhóm Bourgin và Nitsch tạo thành công cây đơn

bội từ túi phấn thuốc lá Đến nay, việc tạo cây đơn bội thông qua nuôi cấy túi phấn và hạt phấn dã thành công ở rất nhiều cây và đã đóng góp vô cùng lớn vào việc tăng thêm các kiến thức di truyền thực vật và thực tiễn tuyển chọn giống

Năm 1960, Cooking ở trường đại học Nottingham công bố có thể dùng cellulase để phân hủy vỏ cellulose của vỏ tế bào thực vật, kết quả thu được các tế bào tròn, không có vỏ bọc gọi là protoplast Người ta thật sự chú ý đến triển vọng của protoplast vào đầu những năm 1970, khi các tác giả Nagata và Takebe (Nhật) thành công trong việc làm cho các protoplast tách từ mô thuốc lá tái tạo vỏ cellulose, phân chia và tạo thành một quần lạc tế bào trong môi trường lỏng Đông thời Takebe, Labib và Melchers đã sử dụng kỹ thuật gieo tế bào của Bergman vào protoplast và tạo cây hoàn chỉnh từ protoplast Do các protoplast có khả năng dung hợp được với nhau trong các điều kiện nhất định và hấp thu các phân tử lớn hoặc thậm chí các cơ quan tử từ bên ngoài, các nhà nuôi cấy mô thực vật đặt hi vòng vào kỹ thuật protoplast để chọn giống có hiệu quả hơn Hy vọng này đến nay được thực tế hoàn toàn xác nhận sau khi nhiều nhóm nghiên cứu trên thế giới đã tuyên bố lai thành công giữa loài nhờ kỹ thuật protoplast, một việc không thể thực hiện được bằng lai hữu tính cổ điển Về mặt lý luận di truyền học, protoplast là công cụ không thay thế được để nghiên cứu hiện tượng NST hòa hợp của các tế bào khác loài sau khi dung hợp, vai trò của DNA trong các cơ quan tử và quan hệ của chúng với DNA trong nhân bào

Vấn đề biến tính của tế bào thực vật được Ledoux và cộng tác viên đề xướng vào năm 1965 Ông cho rằng tế bào, thậm chi hạt gống thực vật, có khả năng hấp thụ DNA ngoại lai vào trong tế bào DNA ngoại lai có thể gắn với DNA nội bào và có hoạt động biểu hiện tính di truyền, gây nên sự biến tính ở thực vật như đã chứng minh ở vi sinh vật Các thí nghiệm của Ledoux được tranh cãi rất nhiều, đến nay hầu hết các nhà khoa học có liên quan đều xác nhận khả năng xâm nhập của DNA ngoại lai, nhất là vào protoplast thực vật, khả năng tồn tại và biểu hiện các thông tin di truyền của chúng Vấn đề quan trọng là làm thế nào để bảo vệ DNA ngoại lai chống lại hệ phân hủy acid nucleic có trong tế bào chủ

Từ năm 1980 đến 1922 hàng loạt các thành công mới trong lĩnh vực gene thực vật và được công bố Nhờ các plasmid, phân tử DNA vòng thường có trong tế bào vi khuẩn, được lắp ghép, cấu trúc lại sao cho trong plasmid có gắn thêm một gene xác định đã thực hiện thành công, hàng loạt công trình chuyển gene ngoại lai vào nhiều họ thực vật Chỉ trong một thời gian rất ngắn các thành công này được các công ty cây trồng siêu quốc gia khai thác triệt để Các phương pháp để đưa gene ngoại lai vào tế bào thực vật cũng trở nên đa dạng Ngoài phương pháp chuyển gene bằng vi khuẩn

Agrobacterium, các phương pháp chuyển gene trực tiếp như kỹ thuật sử dụng điện

(electroporation), kỹ thuật vi tiêm (microinjection), sử dụng siêu âm (ultrasonic gene transfer), sử dụng súng bắn gene (gene gun) đang được các phòng thí nghiệm trên thế giới phát triển mạnh và đạt kết quả rất chắc chắn

Khả năng ứng dụng nuôi cấy mô thực vật dễ thấy nhất là trong lĩnh vực nhân giống cây trồng và phục tráng cây trồng Ngay từ năm 1960, Morel đã nhận thấy đỉnh

sinh trưởng của các loài địa lan (Cymbidium) khi đem nuôi cấy sẽ hình thành các

protocorm Khi chia cắt các protocorm và nuôi cấy tiếp lại thì được các protocorm mới Khi để trong các điều kiện nhất định thì protocorm có thể phát triển thành cây lan con Hơn nữa các tế bào ở đỉnh sinh trưởng thực vật chứa rất ít hoặc hoàn toàn không chứa virus, do đó với phương pháp nuôi cấy đỉnh sinh trưởng, Morel có thể phục tráng, tạo các dòng vô tính không bị nhiễm bệnh virus Kỹ thuật này đặc biệt có giá trị với cây khoai tây, dâu tây, cây ăn quả và nhiều cây nhân giống vô tính khác

Việc ứng dụng nuôi cấy mô thực vật trong nhân giống được Nozeran nhân lên một mức mới khi ông nhận thấy sự trẻ hóa của chồi nách cây nho và cầy khoai tây

đem nuôi cấy nhiều lần trong ống nghiệm Việc ứng dụng nuôi cấy mô ở quy mô lớn không còn hạn chế ở cây cảnh mà được thực hiện ở quy mô thương mại đối với hàng loạt cây trồng có giá trị kinh tế cao như chuối, cà phê, cọ dầu, sắn, khoai tây, cây ăn quả có múi và đã có những đống góp to lớn cho nông nghiệp thế giới Chúng ta đang bước vào giai đoạn phát triển thứ 4 của nuôi cấy mô thực vật Đó là gia đoạn nuôi cấy mô thực vật được ứng dụng mạnh mẽ vào thực tiễn chọn giống, nhân giống, vào việc sản xuất các chất thứ cấp có hoạt tính sinh học và vào nghiên cứu lý luận di truyền thực vật bậc cao Các hiểu biết cơ bản về đời sống của mô và tế bào đơn độc trong môi trường nhân tạo, nhu cầu chất khoáng, vitamin, chất sinh trưởng, nguồn cacbon của chúng, các kỹ thuật cơ bản để tách, nuôi cấy, điều khiển sự phân hóa từ các bộ phận khác nhau của cây trồng là những tiền đề được chuẩn bị trong giai đoạn trước

Nuôi cấy mô thực vật hiện nay được đưa vào trong các chương trình chọn giống, nhân giống hiện đại Mặc dù còn rất nhiều vấn đề phải đi sâu nghiên cứu đẻ giải quyết trong những năm tới, nuôi cấy mô thực vật ở Việt Nam đã thoát ra khỏi giai đoạn phôi thai của nó và đang chuẩn bị những đóng góp tích cực vào lý luận sinh học cây trồng và vào thực tiễn nông nghiệp

2.6 Sự hình thành và phát triển của mô sẹo 2.6.1 Sự hình thành mô sẹo

Mô sẹo là một khối tế bào phát sinh vô tổ chức, có hình dạng không nhất định, do không có lớp nhu mô Mô sẹo được hình thành từ mặt cắt của thân hay rễ, bao gồm tế bào nhu mô và thành phần tế bào rây (Esau, 1977) Mô sẹo hình thành ở hầu hết các bộ phận của cây (thân, lá, rễ), khi nơi đó có vết cắt (Street, 1969) Điều quan trọng được nhận thấy ở đặc tính của mô sẹo là.: mô sẹo phát triển không theo quy luật nhưng có khả năng biệt hóa thành rễ, chồi và phôi để có thể phát triển thành cây hoàn chỉnh

Đặc điểm sinh trưởng của mô sẹo có quan hệ với cơ quan hình thành mô sẹo, thành phần môi trường nuôi cấy, và điều kiện nuôi cấy Sự hình thành mô sẹo chia ra 3 giai đoạn: phát sinh mô sẹo, phân chia tế bào và biệt hóa

(1) Trong phase phát sinh mô sẹo, sự trao đổi chất kích thích tế bào chuẩn bị phân chia, giai đoạn này dài hay ngắn phụ thuộc vào tình trạng sinh lý của mô được đưa vào nuôi cấy và điều kiện nuôi cấy

(2) Tế bào đi vào giai đoạn phân chia tăng sinh khối