Khảo sát sự tác động của auxin lên sự sinh trưởng và sinh tổng hợp alkaloid của cây trường xuân hoa in vitro

Khảo sát sự tác động của auxin lên sự sinh trưởng và sinh tổng hợp alkaloid của cây trường xuân hoa in vitro

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC



KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

KHẢO SÁT SỰ TÁC ĐỘNG CỦA AUXIN LÊN SỰ SINH TRƯỞNG VÀ SINH TỔNG HỢP ALKALOID CỦA CÂY

TRƯỜNG XUÂN HOA (Catharanthus roseus) IN VITRO

Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Niên khóa : 2003-2007

Sinh viên thực hiện: CAO THỊ THANH LOAN

Thành phố Hồ Chí Minh 2007

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

**************************

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

KHẢO SÁT SỰ TÁC ĐỘNG CỦA AUXIN LÊN SỰ SINH TRƯỞNG VÀ SINH TỔNG HỢP ALKALOID CỦA CÂY

TRƯỜNG XUÂN HOA (Catharanthus roseus) IN VITRO

Giáo viên hướng dẫn: Sinh viên thực hiện:

TS TRẦN THỊ LỆ MINH CAO THỊ THANH LOAN ThS NGUYỄN VĂN CƯỜNG

Thành phố Hồ Chí Minh 2007

LỜI CẢM ƠN

Xin chân thành cảm ơn:

- Ban Giám Hiệu trường Đại học Nông Lâm Tp Hồ Chí Minh đã tạo mọi

điều kiện cho tôi trong suốt thời gian học tập

- Các thầy cô trong Bộ môn Công nghệ sinh học cùng các thầy cô đã trực

tiếp giảng dạy trong suốt bốn năm qua

- TS Trần Thị Lệ Minh và Th.S Nguyễn Văn Cường đã tận tình hướng

dẫn và động viên trong thời gian thực hiện đề tài tốt nghiệp

- TS Phan Phước Hiền và các anh chị phụ trách phòng Hóa Lý thuộc

Trung tâm phân tích thí nghiệm trường Đại học Nông Lâm Tp.HCM

- KS Trần Ngọc Hùng cùng các anh chị thuộc Trung tâm Công nghệ Sinh

học Đại học Nông Lâm Tp.HCM

- Bạn Hoàng Thị Thu cùng toàn thể lớp CNSH29 thân yêu đã hỗ trợ, giúp

đỡ và động viên tôi trong suốt thời gian làm đề tài

Con thành kính ghi ơn ba mẹ cùng những người thân trong gia đình luôn tạo điều kiện và động viên con trong suốt quá trình học tập tại trường

Tháng 08 năm 2007 Cao Thị Thanh Loan

TÓM TẮT

CAO THỊ THANH LOAN, Đại học Nông Lâm Tp Hồ Chí Minh Tháng 8/2007

“KHẢO SÁT SỰ TÁC ĐỘNG CỦA HORMONE TĂNG TRƯỞNG AUXIN

LÊN SỰ SINH TRƯỞNG VÀ SINH TỔNG HỢP ALKALOID CỦA CÂY

TRƯỜNG XUÂN HOA (Catharanthus roseus) IN VITRO”

Hội đồng hướng dẫn: TS Trần Thị Lệ Minh Th.S Nguyễn Văn Cường

Đề tài được thực hiện tại Bộ môn Công nghệ Sinh học và Trung tâm phân tích thí nghiệm trường Đại học Nông lâm Tp.HCM trên đối tượng cây Trường xuân hoa

Tiến hành tạo cây Trường xuân hoa in vitro từ chồi cây Trường xuân hoa trồng

trong vườn thực nghiệm của bộ môn Công nghệ Sinh học

Khả năng sinh trưởng của cây Trường xuân hoa in vitro trên môi trường MS

có bổ sung NAA được theo dõi ở các giai đoạn 7, 14, 21, 28, 35 ngày Bên cạnh đó thay đổi nồng độ NAA, IAA sử dụng nhằm chọn loại chất kích thích tăng trưởng thích hợp thông qua các chỉ tiêu theo dõi như chiều cao cây, số rễ và chiều dài rễ;

xác định sự tạo thành indol alkaloid trong cây in vitro bằng thuốc thử Wagner qua

hiện tượng tạo kết tủa với thuốc thử Bằng hệ thống điện di mao quản, thực hiện

phân tích và định lượng các alkaloid đặc trưng của cây Trường xuân hoa in vitro

như catharanthine, vindoline… Những kết quả thu được:

Khả năng sinh trưởng của cây Trường xuân hoa in vitro: sử dụng NAA 0,5

mg/l và IAA 1 mg/l có tác động tốt lên sự tăng trưởng về chiều dài rễ và số rễ

của cây

Định tính indol alkaloid bằng thuốc thử Wagner: các kết quả định tính cho thấy có sự hiện diện của indol alkaloid trong tất cả các mẫu cây Trường xuân

hoa in vitro Và lượng kết tủa quan sát được nhiều nhất là ở mẫu cây sau 28

ngày nuôi cấy trên môi trường chứa NAA 0,5 mg/l

Phân tích và định lượng indol alkaloid của cây Trường xuân hoa in vitro

bằng hệ thống điện di mao quản: Hàm luợng catharanthine và vindoline của cây

Trường xuân hoa in vitro cao hơn so với hàm luợng catharanthine và vindoline của cây in vivo, và hàm lượng catharanthine đạt được cao nhất là sau 28 ngày

nuôi cấy và vindoline là sau 7 ngày nuôi cấy trên môi trường có bổ sung NAA

0,5 mg/l

SUMMARY

“STUDY ON IMPACT OF AUXIN ON THE GROWTH AND THE

SYNTHEIS ALKALOID IN Catharanthus roseus IN VITRO”

The effect of different growth regulator on growth and production of indol

alkaloid were studied in Catharanthus roseus Shoots were grown in MS solid

medium containing different concentrations of growth regulators Extracted alkaloids were qualitative with Wagner reagent and analyzed by CE for determination of indol alkaloid quantities The growth regulators on the experiment were NAA, IAA and the data were viewed for 7, 14, 21, 28, 35 days

The experiment result showed that NAA at concentration of 0,5 mg/l and IAA 1 mg/l resulted in elongation of roots and higher number of roots The

qualitative results of all in vitro plants have appeared precipitates which the 28 - day

plant sample on the medium containing NAA 0,5 mg/l had the most Analyses by CE showed that the concentration of indol alkaloid (catharanthine and vindoline) in

the in vitro plant is more than in vivo plant, and these plants produce the highest

catharanthine after 28 days and vindoline after 7 days cultured in MS medium adding NAA 0,5 mg/l

1.2 Mục tiêu nghiên cứu 2

2.3 Sơ lược đặc điểm về cây Trường xuân hoa Catharanthus roseus 7

2.3.1 Nguồn gốc của cây Trường xuân hoa 7

2.3.2 Đặc điểm thực vật học và sinh thái của cây Trường xuân hoa 8

2.3.3 Thành phần hoá học của cây Trường xuân hoa 9

2.3.4 Sự phân bố các alkaloid trong cây Trường xuân hoa 13

2.3.5 Tính chất dược lý của cây Trường xuân hoa 13

2.3.6 Ứng dụng của các alakloid Trường xuân hoa trong điều trị bệnh 14

2.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến sản xuất hợp chất thứ cấp 15

2.4.1 Các chất điều hòa sinh trưởng 15

2.4.2 Nguồn đạm 16

2.4.3 Nguồn cacbon 16

2.4.4 Nhiệt độ, pH, ánh sáng và oxygen 16

2.4.5 Các chất khác 16

2.5 Các phương pháp chiết xuất alkaloid 17

2.5.1 Nguyên tắc của sự chiết xuất 17

2.5.2 Phương pháp ly trích bằng dung môi hữu cơ 17

2.5.3 Chiết bằng dung dịch acid loãng trong cồn hoặc trong nước 18

2.6 Các phương pháp định tính sự hiện diện của alkaloid 18

2.6.1 Phản ứng tạo tủa 19

2.6.2 Phản ứng tạo màu 19

2.7 Các phương pháp định lượng alkaloid 20

2.7.1 Phương pháp cân 20

2.7.2 Phương pháp trung hòa 20

2.7.3 Định lượng alkaloid trong môi trường khan 21

2.7.4 Phương pháp so màu 21

2.7.5 Các phương pháp định lượng alkaloid hiện đại 22

2.7.5.1 Hệ thống sắc kí lỏng cao áp 22

2.7.5.2 Hệ thống điện di mao quản 22

2.8 Các nghiên cứu về việc tăng cường sản xuất hợp chất thứ cấp 23

2.8.1 Chọn lọc dòng tế bào có sức sản xuất cao 24

2.8.2 Xử lý với Elicitor 24

2.8.3 Sự bổ sung tiền chất và sự biến đổi sinh học 24

2.8.3.1 Sự bổ sung tiền chất 24

2.8.3.2 Sự biến đổi sinh học 25

CHƯƠNG 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Nội dung nghiên cứu 26

3.2 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 26

3.3 Nội dung 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của IAA, NAA lên sự

sinh trưởng của cây Trường xuân hoa in vitro 26

3.3.1 Vật liệu 26

3.3.1.1 Đối tượng nghiên cứu 26

3.3.1.2 Thiết bị và dụng cụ 26

3.3.2 Điều kiện và môi trường nuôi cấy 26

3.3.3 Phương pháp nghiên cứu 27

3.3.3.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát khả năng sinh trưởng của cây Trường xuân hoa in vitro trên môi trường MS có bổ sung NAA 27

3.3.3.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ NAA, IAA đến sự sinh trưởng của cây Trường xuân hoa in vitro 27

3.4.2 Phương pháp nghiên cứu 30

3.4.2.1 Thí nghiệm 1: Xác định sự hiện diện của alkaloid trong cây Trường xuân hoa in vitro bằng thuốc thử Wagner 30

3.4.2.2 Thí nghiệm 2: Thử nghiệm ly trích alkaloid trong cây Trường xuân hoa 31

3.4.2.3 Thí nghiệm 3: Xác định hàm lượng alkaloid của cây Trường xuân hoa in vitro và cây Trường xuân hoa in vivo 31

3.4.2.4 Thí nghiệm 4: Kiểm tra hàm lượng alkaloid trong cây Trường xuân hoa ở từng giai đoạn phát triển bằng CE 32

3.4.3 Phương pháp tiến hành 32

3.4.3.1 Định tính alkaloid trong mẫu cây Trường xuân hoa 32

3.4.3.2 Ly trích alkaloid từ mẫu cây Trường xuân hoa 32

3.4.3.3 Phân tích và xác định hàm lượng alkaloid bằng CE 34

CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 35

DANH SÁCH CÁC BẢNG

Bảng 2.1 Hàm lượng alkaloid toàn phần trong các bộ phận của cây 13 Bảng 3.1 Bố trí thí nghiệm ảnh hưởng của NAA lên sự

sinh trưởng của cây Trường xuân hoa in vitro 27

Bảng 3.2 Bố trí nghiệm ảnh hưởng của nồng độ NAA đến sự sinh

trưởng của cây Trường xuân hoa in vitro 28

Bảng 3.3 Bố trí thí nghiệm ảnh hưởng của nồng độ IAA đến sự

sinh trưởng của cây Trường xuân hoa in vitro 28

Bảng 4.1 Chiều cao cây Trường xuân hoa in vitro sau 7, 14, 21, 28, 35

ngày nuôi cấy trên môi trường có bổ sung NAA 0,5 mg/l 35

Bảng 4.2 Chiều dài rễ cây Trường xuân hoa in vitro sau 7, 14, 21, 28, 35

ngày nuôi cấy trên môi trường có bổ sung NAA 0,5 mg/l 36

Bảng 4.3 Số rễ của cây Trường xuân hoa in vitro sau 7, 14, 21, 28, 35

ngày nuôi cấy trên môi trường có bổ sung NAA 0,5 mg/l 36

Bảng 4.4 Ảnh hưởng của nồng độ NAA đến sự sinh trưởng của

cây Trường xuân hoa in vitro sau 28 ngày nuôi cấy 37

Bảng 4.5 Ảnh hưởng của nồng độ IAA đến sự sinh trưởng của

cây Trường xuân hoa in vitro sau 28 ngày nuôi cấy 38

Bảng 4.6 Kết quả định tính alkaloid có trong cây Trường xuân hoa

in vitro bằng thuốc thử Wagner 41

Bảng 4.7 Kết quả định tính alkaloid trong thân lá của cây Trường xuân hoa

in vitro trên môi trường MS có bổ sung auxin khác nhau 43

Bảng 4.8 Kết quả định tính alkaloid trong rễ cây Trường xuân hoa

in vitro trên môi trường MS có bổ sung auxin khác nhau 46

Bảng 4.9 Hàm lượng catharanthine và vindoline trong mẫu tươi và

mẫu khô cây Trường xuân hoa in vivo khi phân tính bằng CE 50

N2

Bảng 4.10 Hàm lượng catharanthine và vindoline trong cây

Trường xuân hoa in vitro và in vivo 2 tuần tuổi khi phân tính bằng CE 53

Bảng 4.11 Hàm lượng catharanthine và vindoline trong cây

Trường xuân hoa in vitro qua các giai đoạn nuôi cấy 54

DANH SÁCH CÁC HÌNH VÀ SƠ ĐỒ

Hình 2.1: Con đường sinh tổng hợp của Terpenoid indole alkaloid 7

Hình 2.2: Hoa Trường xuân hoa 7

Hình 2.3: Cây Trường xuân hoa 8

Hình 2.4: Công thức cấu tạo của catharanthine 10

Hình 2.5: Công thức cấu tạo của vindoline 10

Hình 2.6: Công thức cấu tạo của vincristine và vinblastine 11

Hình 2.7: Con đường sinh tổng hợp các indol alkaloid ở cây Trường xuân hoa từ tiền chất 12

Hình 4.1: Rễ cây Trường xuân hoa trên các môi trường MS có bổ sung NAA, IAA với các nồng độ khác nhau sau 28 ngày nuôi cấy 39

Hình 4.2: Phản ứng với thuốc thử Wagner của alkaloid trong mẫu cây Trường xuân hoa in vitro ở 7, 14, 21, 28, 35 ngày 42

Hình 4.3: Phản ứng với thuốc thử Wagner của alkaloid trong cây Trường xuân hoa in vitro trên môi trường MS có bổ sung NAA 42

Hình 4.4: Phản ứng với thuốc thử Wagner của alkaloid trong thân lá của cây Trường xuân hoa in vitro trên môi trường có chứa NAA 44

Hình 4.5: Phản ứng với thuốc thử Wagner của alkaloid trong thân lá của cây Trường xuân hoa in vitro trên môi trường có chứa IAA 45

Hình 4.6: Phản ứng với thuốc thử Wagner của alkaloid trong rễ cây Trường xuân hoa in vitro trên môi trường có chứa NAA 46

Hình 4.7: Phản ứng với thuốc thử Wagner của alkaloid trong rễ cây Trường xuân hoa in vitro trên môi trường có chứa IAA 47

Hình 4.8: Kết quả CE chuẩn catharanthine 20 mg/l, vindoline 20 mg/l 48

Hình 4.9: Kết quả phân tích CE các alkaloid có trong mẫu Trường xuân hoa in vivo tươi 49

Hình 4.10 Kết quả phân tích CE các alkaloid có trong mẫu Trường xuân hoa in vivo khô 50

Hình 4.11: Kết quả phân tích CE các alkaloid có trong cây

Trường xuân hoa in vitro 2 tuần tuổi 52

Hình 4.12: Kết quả phân tích CE các alkaloid có trong cây

Trường xuân hoa in vivo 2 tuần tuổi 52

Sơ đồ 3.1: Sơ đồ quy trình ly trích alkaloid từ vât liệu tươi 33 Sơ đồ 3.2: Sơ đồ quy trình ly trích alkaloid từ vât liệu khô 34 Biểu đồ 4.1: Hàm lượng catharanthine và vindoline khi ly trích

cây Trường xuân hoa in vivo theo quy trình 1 và 2 51

Biểu đồ 4.2: So sánh hàm lượng catharanthine và vindoline giữa

cây Trường xuân hoa in vitro và cây in vivo 53

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT

TDC : Tryptophan decarboxylase STR : Strictosidine synthase TIA : Terpenoid indole alkaloid EOF : electroosmosis flow CE : Capillary electrophoresis

HPLC : High – performance liquid chromatography DNA : Deoxy nucleic acid

MS : Murashiga & Skoog IAA : Indole-3-acetic acid NAA : 1-Naphthalene acetic acid BA : Benzyladenine

CRD : Completely Randomized Design

Cây Trường xuân hoa (Catharanthus roseus) là một trong các loại thực vật

có khả năng sản xuất các indol alkaloid - có dược tính quan trọng trong chế tạo thuốc chống ung thư như vinblastine và vincristine Nhưng các chất này lại có hàm lượng rất nhỏ trong tế bào thực vật và không thể tổng hợp được bằng con đường hóa học, do có cấu trúc phức tạp Vì vậy, phương pháp bán tổng hợp vinblastine từ sự kết hợp tiền chất vindoline với catharanthine là hết sức hữu hiệu, vì vindoline là một nguồn dồi dào trong cây Trường xuân hoa và catharanthine có thể đạt nồng độ cao trong cây Trường xuân hoa nuôi cấy mô Điều này có thể thực hiện được thông

qua việc sử dụng các tác nhân kích thích như nấm và chất hóa học Hiện nay, việc

sản xuất catharanthine nhờ nuôi cấy mô vẫn còn quá thấp để tiến tới sản xuất công nghiệp Bên cạnh đó, các alkaloid chỉ được tổng hợp trong những loại tế bào đặc trưng và vào những giai đoạn phát triển đặc biệt, điều này làm cho việc chiết xuất chúng gặp nhiều khó khăn Do đó, việc chọn lọc các phương pháp và thời gian nuôi cấy hiệu quả là một trong những con đường quan trọng và thiết thực để gia tăng sức

sản xuất các tiền chất như catharanthine và vindoline trong cây Trường xuân hoa in vitro

Chính vì tầm quan trọng của các indol alkaloid trong việc điều trị bệnh và tính cấp thiết của việc gia tăng các hợp chất thứ cấp có giá trị này nên chúng tôi thực hiện đề tài

“Khảo sát sự tác động của IAA, NAA lên sự sinh trưởng và sinh tổng hợp

alkaloid của cây Trường xuân hoa (Catharanthus roseus) in vitro” nhằm kích

thích khả năng sản xuất các indol alkaloid trong cây Trường xuân hoa in vitro nhờ

chất kích thích sinh trưởng (IAA NAA)

1.2 Mục tiêu nghiên cứu

Xác định giai đoạn nuôi cấy mô cây Trường xuân hoa sinh tổng hợp nhiều alkaloid nhất, từ đó chọn quy trình nuôi cấy cây Trường xuân hoa có khả năng sản xuất được nhiều catharanthine và vindoline thông qua việc sử dụng chất kích thích sinh trưởng IAA (indole - 3 - acetic acid) hay NAA (1- Naphthalene acetic acid)

1.3 Yêu cầu

- Tạo được cây Trường xuân hoa in vitro có hàm lượng alkaloid cao

- Định tính sự hiện diện của alkaloid trong cây Trường xuân hoa bằng thốc thử Wagner - Phân tích định lượng được lượng alkaloid trong từng giai đoạn nuôi cấy mô bằng hệ thống điện di mao quản (Capillary electrophoresis – CE)

Chương 2

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Hợp chất tự nhiên trong cây [7, 9]

Sinh vật trong quá trình sinh trưởng và phát triển luôn tiến hành quá trình trao đổi chất, kết quả là tạo nên các sản phẩm của trao đổi chất Trong thực vật các sản phẩm này được chia làm hai nhóm:

- Chất trao đổi bậc một hay hợp chất sơ cấp: là các chất cơ bản cần cho sự sống của cây và có ở tất cả các loại cây trồng, bao gồm các hydrat cacbon, lipit và acid amin Đó là những thành phần không thể thiếu trong cây

- Chất trao đổi bậc hai hay hợp chất thứ cấp: là những hợp chất đặc trưng cho loài cây trồng và chúng đóng vai trò quan trọng trong sự sống và sinh sản của thực vật Các hợp chất thứ cấp là những hợp chất được sinh tổng hợp từ chất trao đổi sơ cấp nhưng có sự phân bố giới hạn trong thực vật [7]

2.1.1 Tầm quan trọng của hợp chất thứ cấp

Hợp chất thứ cấp không có chức năng rõ ràng như các hợp chất sơ cấp nhưng thường có vai trò sinh thái học: góp phần tạo màu sắc, quyến rũ ong bướm giúp cho quá trình thụ phấn của cây, giúp cho cây thích nghi được với những điều kiện khắc nghiệt của môi trường hay bảo vệ cây trồng chống lại côn trùng, các loại vi sinh vật và những động vật ăn mồi khác, như là cỏ ba lá hay cỏ đinh lăng có tác dụng như estrogen làm ảnh hưởng đến khả năng sinh sản của động vật ăn cỏ [17] Thậm chí là chúng còn ức chế sự phát triển của các thực vật khác bởi vì nhiều hợp chất thứ cấp có độc tính đối với thực vật Vì vậy so với các chất sơ cấp, hợp chất thứ cấp được xem là nguồn nguyên liệu đặc biệt quý giá từ thực vật [14]

Các hợp chất thứ cấp đã được ứng dụng rất rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khác nhau: chúng có vai trò quan trọng trong việc tạo hương vị và màu sắc cho các món ăn, đặc biệt hiện nay vấn đề sức khỏe rất được quan tâm do đó ngày càng nhiều các chất có nguồn gốc tự nhiên đang có xu hướng thay thế các chất tổng hợp làm

phụ gia trong thực phẩm Bên cạnh đó các tinh dầu thơm của thực vật còn tham gia vào thành phần quan trọng của nước hoa Ngoài ra chúng còn được ứng dụng trong lĩnh vực thuốc trừ sâu, thuốc diệt côn trùng do các chất chiết từ một số loài thực vật có đặc tính kháng khuẩn, kháng nấm, kháng virút…, vì có nguồn gốc từ tự nhiên nên không làm ảnh hưởng đến sức khỏe con người và môi trường sinh thái Bởi vì có hoạt tính sinh học dồi dào, nên các hợp chất thứ cấp từ lâu đã được sử dụng làm thuốc trong y học cổ truyền, và ngày nay chúng vẫn là nguồn nguyên liệu có giá trị trong bào chế dược phẩm Một số chất thứ cấp như glucosinolate, alkaloid gây độc có chọn lọc đối với tế bào tiền ung thư được dùng để bào chế thuốc chống ung thư, hoặc một số chất có tác dụng trên tim như ajmalin, quinidin được dùng làm thuốc chữa loạn nhịp tim…

Hiện nay trên thế giới nhiều loại thuốc tổng hợp đã được sử dụng nhưng chúng vẫn không thay thế được các loại thuốc có nguồn gốc từ thực vật Vì có một số hoạt chất thứ cấp chưa tổng hợp được bằng con đường hóa học hoặc nếu tổng hợp được thì giá thành của các loại thuốc sản xuất tổng hợp không rẻ hơn mà tác dụng lại không bằng các chất chiết xuất từ cây Ví dụ như ajmalin, morphin, scopolamin, quinin, strychmin… [5]

2.1.2 Sự phân loại hợp chất thứ cấp

Các hợp chất thứ cấp ở thực vật được phân loại theo con đường sinh tổng hợp của chúng Gồm có ba nhóm chủ yếu: phenolic, terpene và steroid, alkaloid Phenolic là nhóm hợp chất phổ biến ở thực vật bậc cao vì những phân tử này liên quan đến quá trình tổng hợp lignin, còn các hợp chất khác như alkaloid thì phân bố rải rác, nó đặc trưng cho giống, loài thực vật [17]

2.2 Alkaloid [27]

Alkaloid là nhóm hợp chất tự nhiên với cấu trúc hóa học và hoạt tính sinh học rất đa dạng

* Đặc điểm chung: Trên 10.000 loại alkaloid đã được biết, khoảng 10 – 15 %

alkaloid ở trong mạch nhựa cây có hoa, loại hai lá mầm nhưng đôi khi cũng được tìm thấy ở nấm, sinh vật biển, ở một số loài động vật và côn trùng…

* Thuật ngữ: Alkaloid thường có tên tận cùng bằng “ine” Chúng được đặt tên theo

một phần tên La tinh của loài sinh vật tạo ra nó Ví dụ atropine từ Atropa

belladonna (cây cà dược) Một vài hợp chất được đặt tên dựa trên hoạt tính sinh học

của chúng ví dụ như emetine (thuốc gây nôn - emetic)

* Tính chất vật lý: hầu hết alkaloid là không màu ở dạng tinh thể rắn và độ nóng

chảy cao Tuy nhiên một vài alkaloid ở dạng nhựa vô định hình, một vài alkaloid ở dạng lỏng như nicotine hay có màu như berberine

* Tính tan: phần lớn alkaloid là ở dạng bazơ tự do nên tan được trong dung môi

hữu cơ và không tan được trong nước ở pH cao, các muối của alkaloid thì tan trong nước, alcol và hầu như không tan trong dung môi hữu cơ Ở pH thấp alkaloid sẽ thêm vào một proton và trở nên tan trong nước, không tan trong dung môi hữu cơ Tính tan của alkaloid rất quan trọng trong việc ly trích các alkaloid ra khỏi cây, trong phân tích các loại alkaloid, và trong việc bào chế các alkaloid thành các dạng thuốc phù hợp

* Tính chất hóa học: alkaloid với những nhóm chức liền kề chủ yếu là cho điện tử

Những hợp chất thu điện tử (như nhóm amide carbonyl) là trung tính hay mang tính acid yếu Những alkaloid ở dạng bazơ tự do không ổn định như ở dạng muối

Các alkaloid cho một số phản ứng chung thường dùng để xác định chúng: alkaloid tạo tủa với kim loại nặng hay acid hữu cơ Có nhiều loại thuốc thử tạo tủa với alkaloid như thuốc thử Mayer, thuốc thử Dragendoff (potassium bismuth iodide solution)

Nói chung, alkaloid là hợp chất tương đối bền; tuy vậy, một số hợp chất thuộc loại dẫn xuất của indol sẽ dễ bị phân hủy hoặc biến chất khi gặp ánh sáng và các tác nhân oxi hóa [27]

* Phân loại: do cách phân loại dựa vào cấu trúc nhân cơ bản không thể đáp ứng

được cho số lượng alkaloid rất nhiều và đa dạng, nên để tiện lợi các alkaloid được chia thành 3 loại: alkaloid thật, protoalkaloid và giả alkaloid (pseudoalkaloid)

Alkaloid thật: là những hợp chất có hoạt tính sinh học, luôn có tính bazơ, thường chứa nguyên tử nitơ trong vòng dị hoàn, thường được sinh tổng hợp từ

amino acid, phân bố giới hạn trong thực vật và hiện diện trong cây dưới dạng muối của một acid hữu cơ, ngoại trừ: colchicine, acid aristolochic, alkaloid tứ cấp Các alkaloid loại này thường được chia thành nhóm theo nguồn gốc sinh tổng hợp của chúng (ornithine, lysin, phenilalanine, tryptophan, histidine, acid antranilic…) hơn là theo vòng dị hoàn

Các protoalkaloid được xem là những amin có hoạt tính sinh học kể cả mescaline và N,N - dimetiltryptamine Chúng là những amin đơn giản, được tổng hợp từ các amino acid, trong đó nguyên tử nitơ không ở trong vòng dị hoàn

Các giả - alkaloid là những hợp chất không bắt nguồn từ những amino acid Bao gồm hai hợp chất lớn là alkaloid steroid và alkaloid terpenoid (như conesine) và purine (cafeine) [8]

Vài họ thực vật rất giàu alkaloid, ví dụ như họ Apocynaceae Lindl., Juss Họ này phân bố trên toàn thế giới đặc biệt là ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới Trong số đó các terpenoid indol alkaloid nổi lên với vai trò là các chất có hoạt tính sinh học mạnh và là tiềm năng ứng dụng trong y học

Terpenoid indole alkaloid (TIA) bao gồm hơn 3000 hợp chất trong đó có các

chất chống ung thư như vinblastine, vincristine từ loài Catharanthus roseus và

Vinca spp., camptothecin từ Camptotheca acuminata, chống sốt rét như quinine từ Cinchona officinalis [15]

Xét về vai trò sinh thái học các terpenoid indole alkaloid đóng vai trò quan trọng trong cơ chế bảo vệ cây chống lại sâu hại và các mầm bệnh Trường hợp các chất indol alkaloid trong cây Trường xuân hoa là một ví dụ: năm 1989, Chockalingam và các cộng sự tìm thấy cao chiết Trường xuân hoa có hoạt tính

chống lại sự ăn của ấu trùng Spodoptera Theo Frischknecht (1987) sau khi gây vết

thương vừa phải trên cây Trường xuân hoa, thì có sự gia tăng tổng hợp các alkaloid này như một cơ chế phòng vệ Ngoài ra các alkaloid từ cây Trường xuân hoa còn có khả năng chống lại các loài vi sinh vật, ví dụ như ajmalicine, catharanthine và vindoline được tạo ra để ức chế sự phát triển của vi khuẩn và nấm (Hemandez,

1979) [16] Hiện nay người ta đang dựa trên những đặc tính này của thực vật

Hình 2.2: Hoa Trường xuân hoa để tìm ra phương thức tăng cường sự sản xuất các hợp chất thứ cấp

TIA gồm có hai thành phần: một nhóm indole lấy từ tryptamine và một nhóm terpenoid có nguồn gốc từ iridoid glucoside secologanin [10]

Hình 2.1: Con đường sinh tổng hợp của Terpenoid indole alkaloid với sự tham gia

của các enzym TDC: tryptophan decarboxylase, STR: strictosidine synthase [32]

2.3 Sơ lược đặc điểm về cây Trường xuân hoa Catharanthus roseus

2.3.1 Nguồn gốc của cây Trường xuân hoa [23, 33] Nguồn gốc phân loại [33]

Giới : Thực vật Giới phụ : Tracheobionta Ngành : Magnoliophyta Ngành phụ : Spermatophyta Lớp : Magnoliopsida Lớp phụ : Asteridae Bộ : Gentianales Họ : Apocynaceae

Tên khoa học : Catharanthus roseus

Tên thông thường: Bông dừa, hoa hải đằng, phjắc pót đông (Tày), dừa cạn, trường xuân hoa, Madagascar periwinkle…

Chi Catharanthus G.Don có nguồn gốc ở Madagasca, cây Trường xuân hoa

được du nhập sang nhiều nước nhiệt đới ở Nam Á cũng như Đông Nam Á trong đó có Việt nam và đảo Hải Nam Trung Quốc Vào đầu khoảng giữa thế kỷ 18, Trường xuân hoa được trồng ở Paris, sau đó có mặt tại nhiều vườn thực vật khác ở Châu Âu

2.3.2 Đặc điểm thực vật học và sinh thái của cây Trường xuân hoa [23]

Cây Trường xuân hoa là cây thân thảo sống lâu năm, cao 40 – 60 cm, phân nhiều cành Thân mọc thẳng, hình trụ nhẵn, màu xanh lục nhạt hay nâu đỏ Lá mọc đối, hình bầu dục, gốc thuôn, đầu tù hoặc hơi nhọn, dài 4 – 6 cm, rộng 2 – 3 cm, hai mặt nhẳn, mặt trên sẩm bóng, mặt dưới nhạt (Hình 2.3)

Hoa màu hồng hoặc trắng (trắng hiếm hơn) Hoa mọc riêng lẻ ở kẽ lá gần ngọn, dài 5 thùy, hình ống ngắn, tràng có 5 cánh, ống tràng hẹp phình ra ở dưới các cánh hoa, nhị 5 đính vào họng của ống tràng (Hình 2.2) Quả dài 2,5 – 3 cm, mọc thẳng hơi choãi ra, hạt nhỏ, hình trứng màu nâu nhạt hoặc nâu đen Mùa hoa quả, tháng 4 – 5 và tháng 9 – 10

Ở Việt Nam, Trường xuân hoa là cây hoang dại, có vùng phân bố tự nhiên tương đối đặc trưng từ tỉnh Quảng Ninh đến Kiên Giang dọc theo vùng ven biển,

Hình 2.3: Cây Trường xuân hoa

tương đối tập trung ở các tỉnh miền Trung như Thanh Hóa, Nghệ An, Huế, Quảng Nam, Ðà Nẵng, Bình Ðịnh và Phú Yên Ở những vùng phân bố tự nhiên ven biển, Trường xuân hoa có khi mọc gần như thuần loại trên các bãi cát dưới rừng phi lao, trảng cỏ cây bụi thấp, có khả năng chịu đựng điều kiện đất đai khô cằn của vùng cát ven biển Trường xuân hoa còn được trồng khắp nơi trong nước để làm cảnh và làm thuốc Nơi tập trung nhiều nhất thuộc các tỉnh Nghệ An, Hà Tĩnh, Quảng Bình, Quảng Nam, Quảng Ngãi, Bình Định, Phú Yên và Khánh Hòa

Ngoài ra còn có ở Côn Đảo và Phú Quốc Môi trường ven biển cũng là nơi mọc tập trung của Trường xuân hoa ở Madagasca, Srilanca, Ấn Độ, Philippin, Malaysia, Thái Lan Ở Madagasca, cây còn mọc cả ở những vùng đồi, savan, cây bụi trên đất pha cát hoặc sỏi đá, độ cao tới 1.500m Trường xuân hoa là loại cây ưa sáng, ưa ẩm và có khả năng chịu được hạn Trong điều kiện trồng trọt (ở Hà Nội - vườn hoa, nông trường Đồng Gia - Ninh Bình, 1972) và ở Tuy Hòa hiện nay Cây sinh trưởng phát triển mạnh, khối lượng chất xanh thu được có thể cao gấp đôi cây mọc từ thiên nhiên Cây ra hoa quả nhiều hàng năm, cây trồng từ hạt ra hoa quả sau 4 - 5 tháng Trong thời kỳ sinh trưởng mạnh, nếu bị cắt, cây tái sinh chồi khỏe Nguồn Trường xuân hoa mọc tự nhiên ở Việt Nam tương đối dồi dào Trước năm 1975, miền Bắc đã từng xuất khẩu sang Đông Âu 1 - 3 tấn/năm Những năm gần đây, lượng xuất khẩu sang Pháp (khoảng trên 10 tấn/năm) thường xuyên hơn, nhưng chủ yếu là từ cây trồng tại tỉnh Phú Yên [23]

2.3.3 Thành phần hoá học của cây Trường xuân hoa [22]

Nghiên cứu của các nhà khoa học cho thấy, Trường xuân hoa có chứa một số

alkaloid có tác dụng hạ huyết áp như trong cây ba gạc Ấn Độ (Rawolfia serpentiana

Benth) Ngoài ra còn có resecpin, secpentin, ajmalixin, vinxein, vindolixin, digitalin

và hoạt chất giống insulin, nhưng đáng chú ý nhất là những alkaloid có nhân indol

có trong tất cả các bộ phận của cây, nhiều nhất là ở rễ và rất thấp ở lá Năm 1958, Noble và cộng sự đã chiết được một alkaloid từ lá Trường xuân hoa vincaleucoblastine (còn gọi là Vinblastine) [29] Sau đó 4 năm, Svoboda và cộng sự cũng tìm thêm một alkaloid nữa là vincaleucocristin (còn gọi là vincristine) [30]

Hình 2.5: Công thức cấu tạo của vindoline

Hàm lượng các alkaloid này trong Trường xuân hoa rất nhỏ khoảng 1 phần vạn trong lá Trường xuân hoa khô đối với Vinblastine còn đối với vincristine thì ít hơn 10 lần nữa

Tùy theo nơi thu hái hàm lượng các alkaloid này thay đổi từ 0,2% đến 1% và khi dùng cũng dùng với liều rất thấp

Căn cứ vào cấu tạo hóa học người ta chia alkaloid trong cây Trường xuân hoa làm ba nhóm chính:

Nhóm alkaloid có nhân indol: perivine, peviridine, perosine, catharanthine, cavicine, ajmalicine…

Hình 2.4: Công thức cấu tạo của catharanthine

Nhóm alkaloid có nhân indoline: lochnericine, lochneridin, lochrovine, vindoline, ajmaline …

Nhóm alkaloid có hai vòng indol hoặc một vòng indol và một vòng indoline như leurosine và leurosidine đặc biệt trong nhóm này có những alkaloid có tác dụng chữa bệnh ung thư như vinblastine nhưng có hàm lượng rất thấp: 0,005% - 0,015% trong lá và vincristine: 0,003 - 0,005% trong lá

Hình 2.6: Công thức cấu tạo của vincristine và vinblastine

Về mặt tính chất hóa học, các alkaloid có thể tham gia phản ứng cộng, oxi hóa khử… Dưới tác dụng xúc tác của enzyme, một số monomer có thể kết hợp tạo thành các dimer, ví dụ như sự kết hợp của hai tiền chất catharanthine với vindoline tạo thành vinblastine và vincristine như hình 2.7

Hình 2.7: Con đường sinh tổng hợp các indol alkaloid

ở cây Trường xuân hoa từ tiền chất [20] Đơn phản ứng

Đa phản ứng

2.3.4 Sự phân bố các alkaloid trong cây Trường xuân hoa

Sự phân bố các alkaloid khác nhau ở các bộ phận khác nhau của Trường xuân hoa tùy thuộc nhiều vào các yếu tố liên quan đến quá trình sinh tổng hợp của cây Sự hình thành alkaloid ở lá, thân, rễ tùy thuộc vào bước sóng ánh sáng chiếu vào cây Quá trình tạo alkaloid trong rễ cây không có phản ứng quang hợp như các bộ phận trên mặt đất của cây nên các alkaloid trong rễ cây là indol alkaloid không chứa nhóm methoxy như ajmalicin, cathidine, serpentine, perivin, alstonin, tertrahydroalstonin, còn các alkaloid ở lá có chứa nhóm methoxy như anhydrovinblastine, catharanthine, leusosine, leurosidin, vinblastine, vincristine, vindoline, ở hạt thì có vinsedicin, vincedine, còn ở hoa chỉ có có vinblastine dạng vết [4]

Ngoài ra, hàm lượng của alkaloid trong cây cũng phụ thuộc vào nhiều yếu tố như khí hậu, ánh sáng, chất lượng đất, giống cây và cũng rất khác nhau tùy vào các bộ phận thu hái:

Bảng 2.1 Hàm lượng alkaloid toàn phần trong các bộ phận của cây [5]

2.3.5 Tính chất dược lý của cây Trường xuân hoa [23, 24, 25]

Theo tài liệu cổ, Trường xuân hoa vị hơi đắng, tính hàn, có tác dụng kháng nham (chống ung thư), an thần, trấn tĩnh, bình can, thanh nhiệt, lương huyết, giải

độc thường được áp dụng chữa huyết áp cao, bệnh bạch huyết, u lim-phô [25] Theo kinh nghiệm dân gian ở Việt Nam và Trung Quốc, có nơi dùng thân và lá phơi khô sắc uống để thông tiểu tiện, chữa bệnh đi tiểu đỏ, ít và làm thuốc điều kinh Ở nam châu Phi, người dân dùng trị bệnh đái tháo đường Có nơi dùng chữa tiêu hóa kém và lỵ [23]

Nói đến Trường xuân hoa trong cây thuốc của Việt Nam như là một cây thuốc rất quý dùng nhiều trong các bệnh về nội khoa mà đặc trưng ở 3 nhóm bệnh: bệnh lý về nội tiết, bệnh lý về tim mạch và bệnh lý về máu

Cao lỏng Trường xuân hoa có tác dụng hạ huyết áp, an thần gây ngủ và có độc tính nhẹ Khi cho chuột cống trắng cái đã thụ tinh uống cao Trường xuân hoa, thấy liều cao không gây tai biến cho chuột mẹ nhưng có dấu hiệu ngăn cản sự phát triển của thai Cao Trường xuân hoa dùng để trị bệnh cao huyết áp trên lâm sàng có tác dụng giảm huyết áp trên bệnh nhân thấy rõ rệt Việc điều trị đơn giản, dễ áp dụng, không thấy biến chứng ngộ độc

Hai loại thuốc chế từ Trường xuân hoa chữa ung thư được dùng là Vinblastine và Vincristine Các nhà khoa học đã nghiên cứu chiết xuất từ cây Trường xuân hoa 2 alkaloid vinblastine và vincristine, là những chất ức chế mạnh sự phân bào Các alkaloid này liên kết đặc hiệu với tubulin, là protein ống vi thể ở thoi phân bào, phong bế sự tạo thành các vi ống này và gây ngừng phân chia tế bào ở pha giữa Ở nồng độ cao, thuốc diệt được tế bào, còn ở nồng độ thấp làm ngừng phân chia tế bào [24] Vinblastine có tác dụng chống ung thư còn do tác động đối với chuyển hoá của glutamat và aspartat, và vincristine ngăn cản sự tổng hợp RNA và các protein Ngoài ra cao Trường xuân hoa còn có tác dụng kháng một số chủng nấm gây bệnh [23]

2.3.6 Ứng dụng của các alakloid Trường xuân hoa trong điều trị bệnh

 Vinblastin sulfat: Là thuốc dùng trong liệu pháp phối hợp, được lựa chọn

hàng đầu để điều trị ung thư biểu mô tinh hoàn và được lựa chọn hàng thứ hai trong liệu pháp trị bệnh ung thư lá lách, ung thư nhau, ung thư biểu mô da đầu và ung thư

biểu mô thận Lựa chọn hàng thứ ba để điều trị u nguyên bào thần kinh, ung thư vú, ung thư cổ tử cung và ung thư dạng nấm da [24]

 Vincristin sulfat: Là một trong những thuốc chống ung thư được dùng

rộng rãi nhất, đặc biệt có ích đối với các bệnh ung thư máu, thường được dùng để làm thuyên giảm bệnh bạch cầu lympho cấp Nó được dùng trong liệu pháp phối hợp thuốc, là lựa chọn hàng đầu để điều trị bệnh ung thư biểu mô phổi, ung thư Hodgkin (ung thư hạch ở hệ bạch huyết), u bạch huyết không - Hodgkin, bạch cầu tủy bào mạn (đợt cấp tính), sarcom Ewing và sarcom cơ vân [18] Phối hợp thuốc chứa Vincristin là lựa chọn hàng thứ hai cho ung thư biểu mô vú, ung thư cổ tử cung, u nguyên bào thần kinh và bệnh bạch cầu lympho mạn tính Hiện nay, Trường xuân hoa đang được ta xuất khẩu sang Pháp, chủ yếu để bào chế thuốc chữa bệnh bạch cầu

 Vindoline và catharanthine: vindoline và catharanthine được dùng trong

việc điều trị bệnh bí tiểu và làm hạ lượng đường trong máu Từ vindoline và catharanthine người ta tổng hợp được những alkaloid chứa nhóm dimer như vinblastine, vincristine có tác dụng trị ung thư

 Ajmalicine: là chất có biệt tính dược học mạnh, dùng để điều trị cao huyết

áp, dùng làm thuốc giảm đau và điều trị các bệnh về hệ thần kinh và các triệu chứng lâm sàng khác

 Serpentine: dùng để điều trị bệnh cao huyết áp và thuốc an thần

2.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến sản xuất hợp chất thứ cấp trong nuôi cấy mô

2.4.1 Các chất điều hòa sinh trưởng [6]

Nghiên cứu ảnh hưởng của các chất điều hòa sinh trưởng đến quá trình nuôi cấy tế bào cho thấy:

- Chất điều hòa sinh trưởng cần thiết cho nuôi cấy tế bào

- Chất điều hòa sinh trưởng ảnh hưởng đến quá trình biệt hóa tế bào hình thành cơ quan như chồi, thân , lá, rễ

- Chất điều hòa sinh trưởng ảnh hưởng đến sự tổng hợp các chất thứ cấp và

cấu trúc tế bào: auxin cần thiết cho nuôi cấy tế bào như IAA, NAA,

2,4-Dichlorophenoxy acetic acid và cytokinin như Kinetin và BA (Benzyladenine) Chất sinh trưởng tác động riêng lẽ hay phối hợp trong cùng nhóm hay cả hai nhóm đến sự sinh trưởng tế bào và tổng hợp các chất thứ cấp Nồng độ chất sinh trưởng được sử dụng từ 1 đến 10 mg/l

- Ánh sáng: Các chất thứ cấp được tạo ra trong quá trình nuôi cấy ở điều kiện tối hay có ánh sáng phụ thuộc vào từng loài thực vật và trong quá trình dinh dưỡng

ở nuôi cấy in vitro là quá trình quang tự dưỡng

Mỗi loại thực vật có những điều kiện tối ưu khác nhau để sinh trưởng và sản

xuất các chất hữu dụng, vì thế tùy từng trường hợp mà thay đổi các yếu tố cho phù hợp

2.4.5 Các chất khác [4]

Trong những nghiên cứu gần đây cho thấy sử dụng các cơ chất trong quá trình nuôi cấy là cần thiết để tăng hiệu suất thu nhận các chất thứ cấp Điều này cho

phép thực hiện các phản ứng sinh tổng hợp ra các chất thứ cấp mới mà bản thân tế bào thực vật không có Như vậy việc sản xuất các chất thứ cấp có trong tự nhiên hay các chất mới bằng phương pháp nuôi cấy mô thực vật và có sự tham gia của các cơ chất là có thể thực hiện

2.5 Các phương pháp chiết xuất alkaloid [2, 3] 2.5.1 Nguyên tắc của sự chiết xuất

Dược liệu được cấu tạo bởi các tế bào thực vật Khi cho dung môi chiết vào, dung môi sẽ đi qua các thành tế bào của dược liệu, các hoạt chất bên trong tế bào sẽ hòa tan vào dung môi, khi đó xuất hiện một quá trình thẩm thấu giữa dịch chiết trong thành tế bào và dung môi bên ngoài Quá trình thẩm thấu này kết thúc khi có sự cân bằng về nồng độ hoạt chất của dung dịch bên trong và bên ngoài thành tế bào [2] Có hai phương pháp cơ bản để ly trích các alkaloid ra khỏi bột cây khô, dựa vào tính bazơ đặc trưng của các alkaloid:

- Alkaloid nói chung là những chất kềm yếu, thường tồn tại trong cây dưới dạng muối của acid hữu cơ hoặc vô cơ, đôi khi ở dạng kết hợp với tanin, nên phải tán nhỏ để dược liệu dễ thấm với dịch chiết và giải phóng alkaloid khỏi muối của nó bằng những kiềm trung tính hay kiềm mạnh

- Hầu hết các alkaloid kiềm không tan trong nước nhưng lại dễ tan trong dung môi hữu cơ ít phân cực, các muối alkaloid thường tan trong nước cồn Mặt khác còn tùy theo tính chất của alkaloid như loại hay bay hơi hoặc không bay hơi mà dùng phương pháp chiết xuất cho thích hợp [3]

2.5.2 Phương pháp ly trích bằng dung môi hữu cơ [1, 5, 8]

* Nguyên tắc: Tán nhỏ dược liệu rồi tẩm bột dược liệu với dung dịch kiềm

để chuyển đổi các alkaloid ở dạng muối thành dạng bazơ tự do, kế tiếp bột cây tẩm này được trích với dung môi hữu cơ như: benzen, eter etil, chloroform, acetat etil, nhưng chloroform là dung môi thích hợp nhất cho việc chiết hầu hết các alkaloid kiềm, dung môi này hòa tan các alkaloid bazơ vừa được giải phóng

Cất thu hồi dung môi hữu cơ dưới áp lực hơi nước giảm rồi lắc dịch chiết cô đặc với dung dịch acid loãng (2 - 5%) thường dùng acid HCl, H2SO4…Các alkaloid

chuyển sang dạng muối tan trong nước, còn mỡ, sắc tố, sterol… ở lại dung môi hữu cơ Gộp các dịch chiết muối lại rồi kiềm hóa để chuyển alkalod sang dạng bazơ, lắc với dung môi hữu cơ thích hợp nhiều lần để lấy kiệt alkaloid bazơ Việc chiết bằng dung môi hữu cơ có thể dùng bình gạn hay các dụng cụ chiết chất lỏng

Sau khi lấy riêng lớp dung môi hữu cơ chứa alkaloid bazơ người ta thường loại nước bằng muối trung tính khan nước (Na2SO4 khan) rồi cất thu hồi dung môi hoặc bốc hơi dung môi sẽ thu được cắn alkaloid thô

2.5.3 Chiết bằng dung dịch acid loãng trong cồn hoặc trong nước [5]

Thấm ẩm bột dược liệu bằng dung môi chiết xuất Các alkaloid trong dược liệu sẽ chuyển sang dạng muối và tan trong dung môi trên

Cất thu hồi dung môi hoặc bốc hơi dung môi dưới áp lực giảm, dùng ether rửa dịch chiết đậm đặc còn lại Ở môi trường acid, ether thường hòa tan một số tạp chất chứ không hòa tan các alkaloid

Sau khi tách lớp ether, kiềm hóa dung dịch nước rồi lấy alkaloid bazơ được giải phóng ra bằng một dung môi hữu cơ thích hợp, cất thu hồi dung môi hữu cơ rồi bốc hơi tới khô sẽ thu được cặn alkaloid thô Phương pháp này còn gọi là STAS-OTTO

Ngoài hai phương pháp trên người ta còn sử dụng phương pháp chiết bằng cồn đối với các alkaloid trong dược liệu tồn tại dưới dạng muối tan tốt trong cồn ở môi trường trung tính Sau khi tán nhỏ dược liệu được đem thấm ẩm và chiết bằng

cồn etylic cho tới kiệt alkaloid, quá trình tiếp theo được thực hiện tương tự như trên

2.6 Các phương pháp định tính sự hiện diện của alkaloid

 Định tính alkaloid bằng thuốc thử chung

Các alkaloid cho phản ứng với một số thuốc thử gọi là thuốc thử chung của alkaloid Những phản ứng chung này chia làm hai loại: phản ứng tạo tủa và phản ứng tạo màu Có rất nhiều thuốc thử cho phản ứng tạo màu hoặc tạo kết tủa với alkaloid Có 3 loại thuốc thử thông dụng là: Mayer, Dragendorff, Wagner, ngoài ra còn một số thuốc thử khác để phát hiện các loại alkaloid đặc thù

2.6.1 Phản ứng tạo tủa [8]

Thuốc thử Mayer (K2HgI4): hòa tan 1,36 g HgCl2 trong 60 ml nước cất và hòa tan 5 g KI trong 10ml nước cất, trộn hai dung dịch này lại và thêm nước cất đủ 100 ml Nhỏ vài giọt thuốc thử Mayer vào dung dịch acid loãng chứa alkaloid, nếu có alkaloid sẽ xuất hiện kết tủa màu trắng hoặc vàng nhạt, nhưng tủa tạo thành có thể hòa tan trở lại trong lượng thừa thuốc thử hoặc hòa tan bởi AcOH, etanol có sẵn trong dung dịch thử

Thuốc thử Dragendorff (KBiI4): hòa tan 8,0 g Nitrat bismuth trong 25 ml HNO3 30%, và hòa tan 28 g KI, 1 ml HCl 6N trong 5 ml nước cất Trộn hỗn hợp hai dung dịch này lại, thêm đủ 100 ml nước cất thu được dung dịch có màu đỏ cam, dùng để thử nghiệm trong ống nghiệm hay để pha thuốc phun xịt bản mỏng

+ Định tính bằng ống nghiệm: Nhỏ vài giọt thuốc thử Dragendoff vào dung dịch acid loãng có chứa alkaloid, nếu có alkaloid sẽ xuất hiện tủa màu cam - nâu

+ Để phun xịt lên tấm bảng mỏng: Pha dung dịch phun xịt trong bình phun xịt, nếu có akaloid sẽ cho vết màu cam - đỏ trên bản mỏng

Thuốc thử Wagner: hòa tan 1,27 g iod và 2 g KI trong 20ml nước cất, thêm nước cất đủ 100 ml Nhỏ vài giọt thuốc thử Wagner vào dung dịch acid pha loãng có chứa alkaloid, nếu có alkaloid sẽ xuất hiện tủa màu nâu

2.6.2 Phản ứng tạo màu [5]

Có một số thuốc thử cho tác dụng với alkaloid cho những màu đặc biệt khác nhau do đó người ta cũng dùng phản ứng tạo màu để xác định alkaloid Phản ứng tạo tủa cho ta biết có alkaloid hay không, còn phản ứng tạo màu cho biết có alkaloid gì trong đó Thuốc thử tạo màu thường là những hợp chất hữu cơ hoặc vô cơ hòa trong acid H2SO4 đậm đặc Những thuốc thử tạo màu quan trọng là: acid sulfuric đậm đặc, acid Nitric đậm đặc, thuốc thử Frohde (acid sulfomolybdic), thuốc thử Marquis (sulfofocmol), thuốc thử Mandelin (acid sulfovanadic)…

Trong dịch chiết có nhiều alkaloid và còn lẫn tạp chất khác thì phản ứng lên màu không thật rõ bằng những alkaloid đã được chiết và phân lập ở dạng tinh khiết

Do đó để kết luận được chắc chắn người ta thường dùng phản ứng màu kết hợp với phương pháp sắc kí lớp mỏng có alkaloid tinh khiết làm chất chuẩn so sánh

2.7 Các phương pháp định lượng alkaloid [5]

Người ta có thể định lượng toàn bộ alkaloid hay chỉ một hay vài alkaloid là hoạt chất trong một dược liệu Có nhiều phương pháp định lượng như phương pháp cân, phương pháp đo acid, phương pháp so màu, phương pháp trung hòa, phương pháp đo bằng quang phổ tử ngoại, phương pháp cực phổ, phương pháp sinh vật… Các phương pháp định lượng alkaloid gồm hai giai đoạn chính:

+ Lấy riêng alkaloid ra khỏi dược liệu;

+ Định lượng: tùy theo tính chất của alkaloid mà lựa chọn phương pháp cho thích hợp

2.7.1 Phương pháp cân

Để định lượng alkaloid bằng phương pháp cân, cần phải chiết được alkaloid tinh khiết không lẫn tạp Do đó phương pháp này tương đối lâu và người ta chỉ sử dụng khi những phương pháp không thuận tiện bằng

Phạm vi sử dụng nó là những alkaloid có tính kiềm yếu Ngoài ra, phương pháp cân còn được dùng trong trường hợp những alkaloid chưa xác định rõ cấu trúc hóa học hoặc hỗn hợp nhiều alkaloid có phân tử lượng rất khác nhau

Khi định lượng, người ta phải chiết alkaloid tinh khiết bằng một dung môi hữu cơ, sấy tới khối lượng không đổi rồi đem cân

Nếu hàm lượng alkaloid trong dược liệu rất thấp thì định lượng bằng phương pháp cân trực tiếp khó chính xác nên phương pháp này không được sử dụng

2.7.2 Phương pháp trung hòa

Mặc dù alkaloid chiết xuất ra được tinh chế nhưng định lượng bằng phương pháp cân thường cho sai số thừa vì các tạp chất còn bị lôi cuốn theo lẫn với cắn alkaloid Do đó định lượng alkaloid bằng phương pháp trung hòa được dùng nhiều hơn

Muốn định lượng bằng phương pháp này thì alkaloid phải chiết ra ở dạng kiềm Dung dịch alkaloid kiềm phải trong vì có vẫn đục hay lẫn phần nhỏ nhũ dịch

sẽ gây ra hiện tượng hấp phụ các chất kiềm làm cho kết quả định lượng có sai số thừa Ngoài ra, nếu có lẫn các chất kiềm như amoniac, các amin cũng như chất màu và chất béo cũng ảnh hưởng tới kết quả định lượng

Sau khi đã có dịch chiết alkaloid kiềm tinh khiết có thể tiến hành định lượng bằng cách: lắc alkaloid trong dung môi hữu cơ có lượng acid chuẩn độ dư, sau đó định lượng alkaloid thừa bằng kiềm tương ứng, hoặc làm bốc hơi dung môi hữu cơ, cắn alkaloid còn lại được định lượng trực tiếp hay gián tiếp bằng acid chuẩn độ Người ta thường dùng HCl hay H2SO4 có nồng độ 0,01 - 0,1N để chuẩn độ, chỉ thị màu dùng trong định lượng phần lớn là methyl đỏ vì hầu hết muối alkaloid đều làm chuyển màu chỉ thị này trong khoảng pH = 4,2 - 6,3

2.7.3 Định lượng alkaloid trong môi trường khan

Những alkaloid có tính kiềm yếu thì chuẩn độ trong môi trường dung dịch nước không chính xác vì muối tạo ra khi trung hòa sẽ thủy phân mạnh nên khó quan sát vùng chuyển màu của chỉ thị Tuy vậy nếu hòa tan alkaloid vào trong dung môi không phải là nước (gọi là môi trường khan) thì người ta có thể định lượng được những alkaloid có tính kiềm yếu này Thường dùng acid percloric 0,1N để định

lượng và chỉ thị màu là gentian tím

2.7.4 Phương pháp so màu

Phương pháp so màu chỉ cần một lượng nhỏ alkaloid, lại có độ nhạy và có kết quả nhanh do đó cũng là phương pháp hay dùng để định lượng alkaloid Nguyên tắc của phương pháp này là dựa vào phản ứng tạo màu của alkaloid, dùng dung dịch có màu để định lượng

Những alkaloid không thể tạo thành dung dịch có màu để định lượng trực tiếp người ta cho alkaloid tác dụng với thuốc thử tạo tủa có màu, sau đó tách riêng tủa và hòa tan trong dung môi thích hợp sẽ được dung dịch có màu để định lượng alkaloid

2.7.5 Các phương pháp định lượng alkaloid hiện đại 2.7.5.1 Hệ thống sắc kí lỏng cao áp (HPLC)

 Nguyên lí hoạt động: phương pháp này dựa theo tính chất hấp thụ, sự

phân bố hay trao đổi ion của chất tan (chất phân tích) với pha tĩnh ở trong cột để tách các chất Vì dùng hạt pha tĩnh kích thước rất nhỏ (3 - 10 µm) để tăng số đĩa lí thuyết cho cột và để cân bằng giữa pha tĩnh và pha động được thiết lập nhanh, nên phải dùng bơm hoặc khí ép có áp suất cao để đẩy pha động đi được nhanh Cột tách phải bằng thép không gỉ để chịu được áp suất cao (400 - 600 atm) và có đường kính 1 - 4 mm Thể tích dung dịch mẫu khoảng vài đến vài chục µl (được tiêm vào phía trên cột) Nếu dùng máy tự ghi sẽ thu được sắc kí đồ với một dãy các pic; mỗi pic ứng với một chất [31]

 Ưu điểm

- Kĩ thuật phân tích hiện đại, hiện nay được sử dụng khá phổ biến trong các lĩnh vực nghiên cứu, kiểm nghiệm, tách các chế phẩm đa thành phần

- Cho kết quả nhanh, tốt cả về mặt định tính lẫn định lượng

2.7.5.2 Hệ thống điện di mao quản (CE) [13]

 Nguyên lý hoạt động: Phương pháp phân tích này dựa theo nguyên tắc di

chuyển của những chất tích điện trong một điện trường nhờ vào hai nguyên tắc cơ bản sau: quá trình điện di (electromigration) và quá trình điện thẩm (electroosmose) + Sự dịch chuyển điện di là sự di chuyển của các cấu tử mang điện trong dung dịch về điện cực ngược dấu

+ Dòng điện thẩm biểu diễn một dòng chất điện ly lớn gây nên bởi thành mao quản bên trong được tích điện và thế áp đặt Khi đặt điện thế các cation trong dung dịch điện ly gần thành mao quản di chuyển về phía catod, kéo dung dịch điện ly đi theo chúng Điều này tạo thành một dòng điện thẩm thấu hướng về phía catod

Mẫu có thể được bơm vào trong hệ thống nhờ áp suất hoặc điện áp Dưới tác dụng của điện áp cao, các cấu tử đi qua một cửa sổ của mao quản, một detector UV – DAD chọn lọc – bước sóng phát hiện chúng và truyền một tín hiệu điện tỉ lệ với độ hấp thu của mẫu đến máy ghi, tích phân kế hay máy tính Các tín hiệu này sẽ

được vẽ dưới dạng được sắc kí đồ với một dãy các pic; mỗi pic ứng với một chất Kĩ thuật điện di mao quản được sử dụng để phân tích nhiều loại mẫu : acid amin, protein, đoạn DNA, acid nucleic và đặc biệt thích hợp cho việc phân tích các chất quý giá có hoạt tính sinh học

 Các yếu tố có khả năng ảnh hưởng đến kết quả phân tích trên CE

- Khi sử dụng dung dịch đệm có pH quá cao hay quá thấp gây ra tính không đồng nhất của điện tích bề mặt thành cột làm ảnh hưởng đến sự phân tách các cấu tử mẫu

- Nhiệt độ thay đổi dẫn đến thay đổi độ nhớt và dòng điện thẩm (EOF) cũng ảnh hưởng đến quá trình tách chất

- Điện thế sử dụng bị thay đổi làm thay đổi tương ứng thời gian lưu

Kĩ thuật sắc kí lỏng cao áp (HPLC) và kĩ thuật điện di mao quản (CE) đều là những phương pháp có độ chính xác cao Tuy nhiên CE có nhiều ưu điểm hơn về mặt

thời gian phân tích, dung môi hóa chất sử dụng và giá thành cho một lần thử nghiệm

2.8 Các nghiên cứu về việc tăng cường sản xuất hợp chất thứ cấp thực vật [26]

Zenk và cộng sự (1977) đã kiểm tra sự sản xuất serpentine, một loại indole alkaloid trên những môi trường cơ bản khác nhau, kết quả cho thấy lượng serpentine tạo ra phụ thuộc vào thành phần môi trường đã sử dụng Trong tất cả môi trường đã sử dụng, môi trường MS là thích hợp nhất cho sự tạo thành alkaloid này

thông qua nuôi cấy huyền phù tế bào Catharanthus roseus [21]

Trong các thành phần của môi trường chứa chất kích thích sinh trưởng, auxin và kinetin có ảnh hưởng rõ rệt lên sự phát triển và trao đổi chất ở thực vật Ví dụ như auxin được thêm vào môi trường để kích thích tạo ra mô sẹo nhưng thêm một lượng ít

2.8.1 Chọn lọc dòng tế bào có sức sản xuất cao

Những đặc tính sinh lý học của mỗi loại tế bào thực vật không phải lúc nào cũng giống nhau, Zenk cùng cộng sự ở Đức đã thu được dòng tế bào Trường xuân hoa chứa hàm lượng ajmalicine và serpentine cao [21] Điều này cũng tương tự như việc phân lập đơn khuẩn lạc Tiếp sau những kết quả của họ, nhiều nhà nghiên cứu đã sử dụng phương pháp tạo dòng như là một con đường hứa hẹn để gia tăng các chất chuyển hóa

2.8.2 Xử lý với Elicitor

Mẫu cấy thực vật nhiễm vi sinh vật có thể tạo ra sự tổng hợp các chất thứ cấp đặc trưng Nấm là tác nhân gây bệnh được hiểu rõ nhất, nó có các phân tử điều hòa như glucan polymer, glycoprotein và các acid hữu cơ trọng lượng phân tử thấp DiCosmo và Towers [26] đã xét về sự tương quan giữa stress và sự trao đổi chất thứ cấp trong tế bào nuôi cấy Các yếu tố gây stress được ứng dụng thông qua chu trình nuôi cấy hoặc như là một yếu tố gây sốc chính tại một vài điểm của chu trình nuôi cấy để làm tăng lượng alkaloid tích lũy

Những nghiên cứu gần đây cho thấy rằng những phân tử hữu cơ và vô cơ có thể tác động đến sự tích lũy các sản phẩm thứ cấp như vanadyl sulphate tác động

đến sự tích tụ indole alkaloid trong nuôi cấy Catharanthus roseus Những chất khác

có thể kích thích sự tích lũy alkaloid trong cây Trường xuân hoa gồm có sodium chloride, potassium chloride, abscisic acid và sorbitol Những quy trình này với việc tận dụng những elicitor đơn giản và rẻ tiền hứa hẹn cho sản xuất tế bào thực vật quy mô công nghiệp

2.8.3 Sự bổ sung tiền chất và sự biến đổi sinh học 2.8.3.1 Sự bổ sung tiền chất

Bổ sung vào môi trường nuôi cấy các tiền chất thích hợp hay những hợp chất liên quan đôi khi cũng làm kích thích sự sản xuất các chất thứ cấp Phương pháp này rất có lợi nếu giá thành của các tiền chất không đắt Từ khi Chan và Staba [26] thử nghiệm sản xuất alkaloid bằng cách này vào thập niên 60, nhiều thí nghiệm

tương tự cũng đã được thực hiện Ví dụ như, amino acid đã được thêm vào môi trường nuôi cấy huyền phù tế bào để sản xuất tropane alkaloid, indole alkaloid, ephedorin và vài hiệu quả kích thích đã được quan sát

Thật sự thì amino acid là tiền chất của những alkaloid khác nhau, nhưng các bước sinh tổng hợp từ amino acid thành alkaloid rất phức tạp đến nỗi người ta nghi ngờ rằng có hay không việc các amino acid được kết hợp trực tiếp để tạo thành alkaloid trong nuôi cấy tế bào Có lẽ, các amino acid không chỉ tác động lên sự sinh tổng hợp trực tiếp các alkaloid với vai trò như một tiền chất mà còn tác động gián tiếp thông qua những con đường trao đổi chất khác trong tế bào [26]

2.8.3.2 Sự biến đổi sinh học

Thay vì bổ sung những tiền chất vào môi trường nuôi cấy tế bào thực vật, thì người ta còn có thể sử dụng các cơ chất thích hợp để chuyển hóa thành sản phẩm mong muốn trong tế bào thực vật Phương pháp này đã được ứng dụng rộng rãi trong lên men công nghiệp bằng việc sử dụng vi sinh vật và các enzym của chúng

Công ty Allelix Inc ở Canada (Misawa và cộng sự, 1988) đã thiết lập quy trình sản xuất một loại thuốc chống u bướu rất đắt tiền là vinblastine từ catharanthine và vindoline Cũng quan tâm đến việc sản xuất những hợp chất liên quan đến vinblastine, Bede và DiCosmo (1992) cho rằng sự chuyển hóa catharanthine và vindoline thành anhydrovinblastine là nhờ sử dụng enzyme peroxidase và glucose oxidase để kết hợp vindoline và catharanthine [6]

Tóm lại, tiến trình chuyển hóa liên quan đến sự bổ sung các tiền chất vào môi trường nuôi cấy là một trong những phương án thiết thực nhất xét về phương diện thương mại trong nuôi cấy mô thực vật Tuy nhiên việc kiếm được những tiền chất không đắt vẫn là vấn đề chính Do đó việc nuôi cấy mô thực vật tạo ra nhiều tiền chất như catharanthine và vindoline là rất đáng quan tâm