Thí nghiệm được thực hiện nhằm xác định quy trình ly trích tốt nhất các alkaloid trong cây Trường xuân hoa. Các mẫu ly trích thu thập từ cây Trường xuân hoa trong vườn thực nghiệm của bộ môn Công nghệ sinh học. Dịch chiết alkaloid sẽ được xác định hàm lượng bằng CE. Quy trình ly trích được chọn sẽ sử dụng cho các thí nghiệm sau.
Chỉ tiêu theo dõi
Để đánh giá hiệu quả của hai quy trình ly trích, so sánh hàm lượng alkaloid thu được từ dịch chiết cây Trường xuân hoa in vivo sau khi phân tích bằng CE, dựa vào alkaloid chuẩn.
Công thức tính hàm lượng alkaloid dựa vào chất chuẩn C alkaloid (mg/l) = x* Cc* S alkaloid /Sc x: độpha loãng của mẫu
Cc: nồng độ của chất chuẩn (ppm) Sc: diện tích của píc chuẩn
3.4.2.3. Thí nghiệm 3: Xác định hàm lƣợng alkaloid của cây Trƣờng xuân hoa
in vitro và cây Trƣờng xuân hoa in vivo
Thí nghiệm được thực hiện để so sánh hàm lượng alkaloid có trong mẫu thu được từ cây nuôi cấy mô - in vitro và cây ngoài tự nhiên - in vivo. Từ đó đánh giá hiệu quả của việc sử dụng cây Trường xuân hoa nuôi cấy mô sản xuất các hợp chất
mong muốn. Mẫu cây Trường xuân hoa in vitro sau 2 tuần nuôi cấy trên môi trường MS và mẫu cây Trường xuân hoa in vivo 2 tuần tuổi kể từ khi hạt nảy mầm trong vườn ươm được dùng làm vật liệu cho thí nghiệm này.
Chỉ tiêu theo dõi
Hàm lượng alkaloid có trong cây Trường xuân hoa in vivo và cây in vitro
được xác định bằng CE sau quá trình ly trích.
3.4.2.4. Thí nghiệm 4: Kiểm tra hàm lƣợng alkaloid trong cây Trƣờng xuân hoa ở từng giai đoạn phát triển bằng CE
Mục tiêu của thí nghiệm là xác định được hàm lượng catharanthine, vindoline trong cây Trường xuân hoa in vitro trên môi trường có bổ sung chất kích thích sinh trưởng ở nồng độ thích hợp (đã xác định ở thí nghiệm 1b) qua các giai đoạn.
Chỉ tiêu theo dõi
Hàm lượng alkaloid thu được từ cây Trường xuân hoa in vitro qua các giai đoạn sinh trưởng (7, 14, 21, 28, 35 ngày).
3.4.3. Phƣơng pháp tiến hành
3.4.3.1. Định tính alkaloid trong mẫu cây Trƣờng xuân hoa
Phương pháp định tính qua 2 bước sau:
- Chiết alkaloid ra khỏi tế bào thực vật bằng dung môi hữu cơ trong môi trường kiềm: mẫu vật liệu khô được xay nhuyễn và cân khoảng 2 gram bột tẩm kỹ với dung dịch NH4OH, để khô ngoài không khí, dùng 15 ml chloroform cho vào nguyên liệu, đậy nút ngâm trong 24 giờ. Sau đó mang đi lọc, dịch lọc được cô đặc và trích lại bằng dung dịch H2SO4 loãng (Nguyễn Ngọc Hồng, 2004).
- Định tính bằng thuốc thử: nhỏ vài giọt thuốc thử Wagner vào dịch chiết alkaloid, sẽ xuất hiện lượng kết tủa khác nhau tùy thuộc vào hàm lượng alkalod trong mẫu phân tích.
3.4.3.2. Ly trích alkaloid từ mẫu cây Trƣờng xuân hoa
Quy trình 1: Ly trích alkaloid từ vật liệu tƣơi
Bƣớc 1: Chuẩn bị mẫu cây Trường xuân hoa
Bƣớc 2: Ly trích alkaloid (xem sơ đồ 3.1)
Sơ đồ 3.1: Sơ đồ quy trình ly trích alkaloid từ vât liệu tươi [11].
Quy trình 2: Ly trích alkaloid từ vật liệu khô Bƣớc 1: Chuẩn bị mẫu cây Trường xuân hoa
Mẫu cây được rửa sạch, để ráo nước và mẫu được trữ trong tủ âm 20oC ít nhất 30 phút trước khi đem đông khô. Sau khi đông khô mẫu được bảo quản trong tủ hút ẩm để tránh làm ảnh hưởng đến quá trình phân tích mẫu sau này.
Bƣớc 2: Ly trích alkaloid (xem sơ đồ 3.2)
Dịch chiết isopropanol Nguyên liệu tươi (0,6 g)
Dịch chiết nước acid Dịch chiết nước acid
Nghiền với 4 ml isopropanol Lắc 15 phút, lọc bỏ bã
Thổi khô bằng khí nitơ
Thêm 1 ml acid acetic 0,01M Thêm 1 ml cyclohexan, votex Loại lớp cyclohexan ( lặp lại 2 lần)
Thổi khô bằng khí Nitơ
Sơ đồ 3.2: Sơ đồ quy trình ly trích alkaloid từ vât liệu khô [19]. 3.4.3.3. Phân tích và xác định hàm lƣợng alkaloid bằng CE
Dịch chiết alkaloid sau quá trình ly trích được sử dụng trong phân tích bằng CE với các thông số sau [11]:
- Cột mao quản silica 72 cm với đường kính 50 µm. - Dung dịch đệm ammonium acetat 0,2 M, pH 6,2. - Điện thế sử dụng để phân tích mẫu là 10 Kv. - Thời gian bơm mẫu là 3 giây ở 25 mbar, 25oC.
Bột nguyên liệu (100 mg) Dịch chiết HCl Dịch chiết CHCl3 Cắn alkaloid Dịch chiết alkaloid 1 ml chloroform + 80 µl NH4OH đậm đặc pH = 9 Lắc trên máy lắc 30 phút (250 vòng/phút) Votex 3 lần Ly tâm 13.000 vòng, 10 phút ở 5o C 2 ml methanol Bốc hơi tới khô
Chiết bằng 1,5 ml HCl 0,1N Votex 30s
Lắc trên máy lắc 30 phút (250 vòng/phút) Ly tâm 6000 vòng, 10 phút ở 5oC
Chƣơng 4
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1. Khảo sát khả năng sinh trƣởng của cây Trƣờng xuân hoa in vitro theo thời gian trên môi trƣờng MS có bổ sung NAA
Mẫu được khử trùng và nuôi cấy trên môi trường MS có và không có bổ sung NAA (0,5 mg/l). Sau mỗi thời gian nuôi cấy, cây được đo chiều cao, chiều dài rễ và đếm số rễ. Kết quả được trình bày trong bảng 4.1, 4.2 và 4.3.
Bảng 4.1. Chiều cao cây Trường xuân hoa in vitro sau 7, 14, 21, 28, 35 ngày nuôi cấy trên môi trường có bổ sung NAA 0,5 mg/l trên môi trường có bổ sung NAA 0,5 mg/l trên môi trường có bổ sung NAA 0,5 mg/l
Nghiệm thức
Nồng độ NAA (mg/l)
Chiều cao cây trung bình (mm)
7 ngày 14 ngày 21 ngày 28 ngày 35 ngày
1 (Đ/C) 0 27,4a 40,0a 45,2a 47,1a 49,7a
2 0,5 26,3a 37,0a 44,7a 47,1a 51,1a
P 0,36 0,09 0,72 0,98 0,40
CV (%) 16,1 16,9 11,9 14,2 12,7
* Đ/C: đối chứng, môi trường MS không có NAA
* Trong cùng một cột các giá trị trung bình có kí tự theo sau giống nhau không có sự khác biệt về mặt thống kê (P > 0,05)
Kết quả phân tích thống kê cho thấy chiều cao trung bình của các nghiệm thức trên môi trường có và không có bổ sung NAA không có sự khác biệt về mặt thống kê (P>0,05). Chiều cao trung bình của cây Trường xuân hoa sau 7, 14, 21, 28, 35 ngày nuôi cấy lần lượt là 26,9; 38,5; 44,9; 47,1; 50,4 mm (phụ lục 2). Như vậy khi bổ sung NAA vào môi trường nuôi cấy không ảnh hưởng lên chiều cao cây.
Bảng 4.2. Chiều dài rễ cây Trường xuân hoa in vitro sau 7, 14, 21, 28, 35 ngày nuôi cấy trên môi trường có bổ sung NAA 0,5 mg/l
Nghiệm thức
Nồng độ NAA (mg/l)
Chiều dài rễ trung bình (mm)
7 ngày 14 ngày 21 ngày 28 ngày 35 ngày
1 (Đ/C) 0 0,00a 2,22a 5,22a 5,63a 7,59a
2 0,5 0,00a 7,59b 5,77b 10,07b 12,44b
P 0,00 0,01 0,00 0,00
CV (%) 11 13,2 14,1 14,2
* Đ/C: đối chứng, môi trường MS không có NAA
* Trong cùng một cột các giá trị trung bình có kí tự theo sau giống nhau không có sự khác biệt về mặt thống kê (P> 0,05)
Bảng 4.3. Số rễ của cây Trường xuân hoa in vitro sau 7, 14, 21, 28, 35 ngày nuôi cấy trên môi trường có bổ sung NAA 0,5 mg/l
Nghiệm thức Nồng độ NAA (mg/l) Số rễ trung bình
7 ngày 14 ngày 21 ngày 28 ngày 35 ngày
1 (Đ/C) 0 0,00a 2,22a 3,00a 4,74a 8,33b
2 0,5 0,00a 3,19b 4,22b 6,11b 6,04a
P 0,00 0,00 0,00 0,00
CV (%) 19,6 9,2 13,5 11,4
* Đ/C: đối chứng môi trường MS không có NAA
* Trong cùng một cột và các giá trị trung bình có kí tự theo sau giống nhau không có sự khác biệt về mặt thống kê (P> 0,05)
Kết quả phân tích thống kê cho thấy sự tác động của NAA là rất có ý nghĩa lên chiều dài rễ cây Trường xuân hoa in vitro. Cây được nuôi trên môi trường có bổ sung NAA tạo rễ dài hơn so với cây đối chứng và chiều dài rễ tỉ lệ thuận so với thời gian nuôi cấy. Tuy nhiên sự tác động của NAA lên số rễ của cây có sự khác biệt
giữa các giai đoạn nuôi cấy (Bảng 4.3), trên môi trường có bổ sung NAA cây có số rễ cao nhất là sau 28 ngày nuôi cấy. Ở giai đoạn này cây có số rễ và chiều dài rễ dài gấp 1,5 lần so với cây sau 21 ngày nuôi cấy. Tuy nhiên, sau 35 ngày nuôi cấy số rễ của cây trên môi trường có NAA giảm dần. Điều này chứng tỏ khi bổ sung NAA vào môi trường nuôi cấy cây tạo rễ tốt nhất ở giai đoạn 28 ngày tuổi.
Vì các tiền chất alkaloid được sản xuất nhiều ở rễ nên giả thiết đặt ra là hàm lượng alkaloid đạt được cao nhất ở cây 28 ngày tuổi nên thí nghiệm tiếp theo được theo dõi ở giai đoạn này.
4.2. Khảo sát ảnh hƣởng của nồng độ NAA đến sự sinh trƣởng của cây Trƣờng xuân hoa in vitro
Bảng 4.4. Ảnh hưởng của nồng độ NAA đến sự sinh trưởng của cây Trường xuân
hoa in vitro sau 28 ngày nuôi cấy
Nghiệm thức Nồng độ NAA (mg/l)
Chiều cao cây trung bình (mm) Số rễ trung bình Chiều dài rễ trung bình (mm) 1 (Đ/C) 0 51,9ab 2,93c 4,19c 2 0,1 51,8ab 3,00c 5,22d 3 0,5 55,7b 4,19e 5,48de 4 1 55,9b 3,67d 5,63e 5 5 49,5a 1,93b 2,44b 6 10 49,3a 0,67a 1,11a P 0,02 0,00 0,00 CV (%) 17,1 19,8 17,5
* Đ/C: đối chứng môi trường MS không có hormone
* Trong cùng một cột và cùng một yếu tố ảnh hưởng, các giá trị trung bình có kí tự theo sau giống nhau không có sự khác biệt về mặt thống kê (P> 0,05)
Trong các nghiệm thức thí nghiệm thì sự bổ sung NAA ở nồng độ 0,5 mg/l và 1 mg/l tác động tốt lên chiều cao trung bình của cây nhưng khi nồng độ này quá
cao (5 – 10 mg/l) sẽ làm giảm khả năng phát triển của cây. Kết quả này cũng phù hợp với sự tác động của NAA lên sự hình thành rễ. Nồng độ tạo rễ tốt nhất trong thí nghiệm này là NAA 0,5 mg/l với số rễ trung bình là 4,19 trong khi ở nghiệm thức 6 (NAA = 10 mg/l) số rễ tạo thành là thấp nhất 0,67 (Bảng 4.4).
Bên cạnh đó quan sát thấy ở nồng độ NAA cao (5 mg/l, 10 mg/l) có sự phát sinh mô sẹo ở phần gốc cây (Hình 4.1) bởi vì nồng độ auxin trong môi trường cao sẽ ngăn cản sự phát sinh hình thái nhưng lại cảm ứng sự tạo sẹo (Nguyễn Đức Lượng, 2002). Như vậy tác động của NAA phụ thuộc vào nồng độ sử dụng, việc thay đổi nồng độ NAA trong môi trường nuôi cấy dẫn đến sự khác biệt về khả năng tạo rễ ở cây nuôi cấy mô. Ở thí nghiệm này nồng độ NAA thích hợp cho sự tạo rễ của cây là 0,5 mg/l.
4.3. Khảo sát ảnh hƣởng của nồng độ IAA đến sự sinh trƣởng của cây Trƣờng xuân hoa in vitro
Bảng 4.5. Ảnh hưởng của nồng độ IAA đến sự sinh trưởng của cây Trường xuân
hoa in vitro sau 28 ngày nuôi cấy.
Nghiệm thức Nồng độ IAA (mg/l)
Chiều cao cây trung bình (mm) Số rễ trung bình Chiều dài rễ trung bình (mm) 1 (Đ/C) 0 51,8b 2,93b 4,19b 2 0,1 51,5b 4,30c 4,81c 3 0,5 50,4b 4,04c 5,67d 4 1 49,4ab 5,63d 5,85d 5 5 48,7ab 2,67ab 4,67c 6 10 46,3a 2,59a 3,78a P 0,03 0,00 0,00 CV (%) 13,1 16,4 13,5
* Đ/C: đối chứng môi trường MS không có hormone
* Trong cùng một cột và cùng một yếu tố ảnh hưởng, các giá trị trung bình có kí tự theo sau giống nhau không có sự khác biệt về mặt thống kê (P> 0,05)
Sẹo Sẹo Rễ NAA = 0,5 mg/l N3 = 1 mg/l NAA = 0,1 mg/l NAA = 5 mg/l NAA = 10 mg/l IAA = 0,5 mg/l IAA = 1 mg/l IAA = 5 mg/l IAA = 10 mg/l IAA = 0,1 mg/l
Hình 4.1: Rễ cây Trường xuân hoa trên các môi trường MS có
Kết quả phân tích thống kê cho thấy các cây nuôi cấy mô trên môi trường có bổ sung IAA đều bị ảnh hưởng nhưng ở mức độ khác nhau. Khi bổ sung IAA ở nồng độ thấp 0 – 0,5 mg/l tác động khác biệt không có ý nghĩa lên chiều cao cây, nhưng khi tăng nồng độ IAA lên (1 - 10 mg/l) thì chiều cao trung bình của cây giảm dần và ở nghiệm thức 6 (IAA = 10 mg/l) cây có chiều cao thấp nhất (Bảng 4.5).
Cây đối chứng và cây trên môi trường chứa IAA có sự khác biệt về số rễ và chiều dài rễ trên phương diện thống kê (P< 0,05). Nồng độ IAA 1 mg/l cho thấy cây tạo được nhiều rễ nhất với chiều dài trung bình là 5,85 mm nhưng khi tăng nồng độ IAA sử dụng lên 10 mg/l thì chiều dài rễ là 3,78 mm và số rễ của cây giảm xuống còn 2,59. Ngoài ra ở nghiệm thức 5 và 6 còn có hiện tượng tạo sẹo và rễ bị biến dạng về hình thái (Hình 4.1) bởi vì khi sử dụng IAA liều cao sẽ kích thích cảm ứng sự tạo mô sẹo làm giảm khả năng tạo rễ.
Kết quả bảng 4.4 và 4.5 cho thấy việc sử dụng NAA 0,5 mg/l hoặc IAA 1mg/l đều tác động tốt lên sự sinh trưởng của cây. Tuy nhiên số rễ được tạo thành khi sử dụng IAA vẫn cao hơn so với khi sử dụng NAA (đặc biệt ở nghiệm thức 6, nồng độ 10mg/l). Điều này có thể là do IAA là loại auxin tự nhiên nên khi bổ sung vào môi trường nuôi cấy với nồng độ cao không gây kích ứng như khi sử dụng auxin nhân tạo NAA.
4.4. Xác định sự hiện diện của alkaloid trong cây Trƣờng xuân hoa in vitro
bằng thuốc thử Wagner
Định tính alkaloid từ cây Trƣờng xuân hoa in vitro qua các giai đoạn sinh trƣởng của cây (7, 14, 21, 28, 35 ngày tuổi) bằng thuốc thử Wagner
Bảng 4.6. Kết quả định tính alkaloid có trong cây Trường xuân hoa in vitro bằng thuốc thử Wagner
Môi trƣờng Ngày nuôi cấy Phản ứng màu với thuốc thử Wagner
MS
7 dung dịch đục mờ, không lắng 14 dung dịch tạo tủa ít
21 dung dịch tạo tủa ít
28 dung dịch tạo tủa nhiều
35 dung dịch đục, tạo tủa vừa
MS + NAA 0,5 mg/l
7 dung dịch đục mờ, không lắng 14 dung dịch tạo tủa ít
21 dung dịch tạo tủa ít
28 dung dịch tạo tủa nhiều
35 dung dịch đục, tạo tủa vừa
Tất cả các mẫu cây Trường xuân hoa nuôi cấy in vitro phản ứng với thuốc thử cho lượng kết tủa khác nhau (Hình 4.2, 4.3), điều này có nghĩa là alkaloid hiện diện trong tất cả các mẫu cây nuôi cấy in vitro nhưng với lượng khác nhau. Quan sát sự tạo kết tủa của alkaloid sau khi cho phản ứng với thuốc thử nhận thấy mẫu cây được nuôi trên môi trường có NAA cho kết tủa nhiều hơn so với mẫu cây nuôi trên môi trường MS ở cùng một thời điểm. Việc thay đổi môi trường sống của cây có thể đã tác động đến chu trình hình thành các alkaloid vì alkaloid được sản xuất ở thực vật nhằm giúp cho cây thích nghi với môi trường, dẫn đễn lượng alkaloid cao ở mẫu cây trên môi trường có NAA. Đặc biệt ở mẫu cây sau 28 ngày nuôi cấy xuất hiện kết tủa nhiều nhất, chứng tỏ hàm lượng alkaloid ở giai đoạn này là cao nhất. Điều này phù hợp với giả thiết đã đặt ra. Ở các giai đoạn còn lại cũng thu được kết tủa nhưng với lượng ít hơn, trong số đó mẫu cây sau 7 ngày nuôi cấy cho kết tủa ít nhất (dung dịch đục và có vòng nhẫn).
Qua thí nghiệm này cho thấy khi bổ sung NAA vào môi trường nuôi cấy, cây sản xuất lượng alkaloid cao nhất sau 28 ngày.
Định tính alkaloid trong thân lá cây Trƣờng xuân hoa in vitro trên môi trƣờng có bổ sung IAA hoặc NAA bằng thuốc thử Wagner
7 ngày 14 ngày 21 ngày 28 ngày 35 ngày
Hình 4.2: Phản ứng với thuốc thử Wagner của alkaloid trong cây Trường xuân hoa
in vitro ở 7, 14, 21, 28, 35 ngày nuôi cấy trên môi trường MS. Phản ứng dương tính: xuất hiện kết tủa (mũi tên).
7 ngày 14 ngày 21 ngày 28 ngày 35 ngày Hình 4.3: Phản ứng với thuốc thử Wagner của alkaloid trong cây Trường xuân hoa
in vitro ở 7, 14, 21, 28, 35 ngày nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung NAA 0,5 mg/l. Phản ứng dương tính: xuất hiện kết tủa (mũi tên).
Nhỏ vài giọt thuốc thử vào dịch chiết alkaloid từ mẫu thân lá của cây Trường xuân hoa in vitro 28 ngày tuổi trên các môi trường có bổ sung NAA, IAA với các