Người ta có thể định lượng toàn bộ alkaloid hay chỉ một hay vài alkaloid là hoạt chất trong một dược liệu. Có nhiều phương pháp định lượng như phương pháp cân, phương pháp đo acid, phương pháp so màu, phương pháp trung hòa, phương pháp đo bằng quang phổ tử ngoại, phương pháp cực phổ, phương pháp sinh vật… Các phương pháp định lượng alkaloid gồm hai giai đoạn chính:
+ Lấy riêng alkaloid ra khỏi dược liệu;
+ Định lượng: tùy theo tính chất của alkaloid mà lựa chọn phương pháp cho thích hợp.
2.7.1. Phƣơng pháp cân
Để định lượng alkaloid bằng phương pháp cân, cần phải chiết được alkaloid tinh khiết không lẫn tạp. Do đó phương pháp này tương đối lâu và người ta chỉ sử dụng khi những phương pháp không thuận tiện bằng.
Phạm vi sử dụng nó là những alkaloid có tính kiềm yếu. Ngoài ra, phương pháp cân còn được dùng trong trường hợp những alkaloid chưa xác định rõ cấu trúc hóa học hoặc hỗn hợp nhiều alkaloid có phân tử lượng rất khác nhau.
Khi định lượng, người ta phải chiết alkaloid tinh khiết bằng một dung môi hữu cơ, sấy tới khối lượng không đổi rồi đem cân.
Nếu hàm lượng alkaloid trong dược liệu rất thấp thì định lượng bằng phương pháp cân trực tiếp khó chính xác nên phương pháp này không được sử dụng.
2.7.2. Phƣơng pháp trung hòa
Mặc dù alkaloid chiết xuất ra được tinh chế nhưng định lượng bằng phương pháp cân thường cho sai số thừa vì các tạp chất còn bị lôi cuốn theo lẫn với cắn alkaloid. Do đó định lượng alkaloid bằng phương pháp trung hòa được dùng nhiều hơn.
Muốn định lượng bằng phương pháp này thì alkaloid phải chiết ra ở dạng kiềm. Dung dịch alkaloid kiềm phải trong vì có vẫn đục hay lẫn phần nhỏ nhũ dịch
sẽ gây ra hiện tượng hấp phụ các chất kiềm làm cho kết quả định lượng có sai số thừa. Ngoài ra, nếu có lẫn các chất kiềm như amoniac, các amin cũng như chất màu và chất béo cũng ảnh hưởng tới kết quả định lượng.
Sau khi đã có dịch chiết alkaloid kiềm tinh khiết có thể tiến hành định lượng bằng cách: lắc alkaloid trong dung môi hữu cơ có lượng acid chuẩn độ dư, sau đó định lượng alkaloid thừa bằng kiềm tương ứng, hoặc làm bốc hơi dung môi hữu cơ, cắn alkaloid còn lại được định lượng trực tiếp hay gián tiếp bằng acid chuẩn độ. Người ta thường dùng HCl hay H2SO4 có nồng độ 0,01 - 0,1N để chuẩn độ, chỉ thị màu dùng trong định lượng phần lớn là methyl đỏ vì hầu hết muối alkaloid đều làm chuyển màu chỉ thị này trong khoảng pH = 4,2 - 6,3.
2.7.3. Định lƣợng alkaloid trong môi trƣờng khan
Những alkaloid có tính kiềm yếu thì chuẩn độ trong môi trường dung dịch nước không chính xác vì muối tạo ra khi trung hòa sẽ thủy phân mạnh nên khó quan sát vùng chuyển màu của chỉ thị. Tuy vậy nếu hòa tan alkaloid vào trong dung môi không phải là nước (gọi là môi trường khan) thì người ta có thể định lượng được những alkaloid có tính kiềm yếu này. Thường dùng acid percloric 0,1N để định lượng và chỉ thị màu là gentian tím.
2.7.4. Phƣơng pháp so màu
Phương pháp so màu chỉ cần một lượng nhỏ alkaloid, lại có độ nhạy và có kết quả nhanh do đó cũng là phương pháp hay dùng để định lượng alkaloid. Nguyên tắc của phương pháp này là dựa vào phản ứng tạo màu của alkaloid, dùng dung dịch có màu để định lượng.
Những alkaloid không thể tạo thành dung dịch có màu để định lượng trực tiếp người ta cho alkaloid tác dụng với thuốc thử tạo tủa có màu, sau đó tách riêng tủa và hòa tan trong dung môi thích hợp sẽ được dung dịch có màu để định lượng alkaloid.
2.7.5. Các phƣơng pháp định lƣợng alkaloid hiện đại 2.7.5.1. Hệ thống sắc kí lỏng cao áp (HPLC)
Nguyên lí hoạt động: phương pháp này dựa theo tính chất hấp thụ, sự
phân bố hay trao đổi ion của chất tan (chất phân tích) với pha tĩnh ở trong cột để tách các chất. Vì dùng hạt pha tĩnh kích thước rất nhỏ (3 - 10 µm) để tăng số đĩa lí thuyết cho cột và để cân bằng giữa pha tĩnh và pha động được thiết lập nhanh, nên phải dùng bơm hoặc khí ép có áp suất cao để đẩy pha động đi được nhanh. Cột tách phải bằng thép không gỉ để chịu được áp suất cao (400 - 600 atm) và có đường kính 1 - 4 mm. Thể tích dung dịch mẫu khoảng vài đến vài chục µl (được tiêm vào phía trên cột). Nếu dùng máy tự ghi sẽ thu được sắc kí đồ với một dãy các pic; mỗi pic ứng với một chất [31].
Ƣu điểm
- Kĩ thuật phân tích hiện đại, hiện nay được sử dụng khá phổ biến trong các lĩnh vực nghiên cứu, kiểm nghiệm, tách các chế phẩm đa thành phần.
- Cho kết quả nhanh, tốt cả về mặt định tính lẫn định lượng.
2.7.5.2. Hệ thống điện di mao quản (CE) [13]
Nguyên lý hoạt động: Phương pháp phân tích này dựa theo nguyên tắc di chuyển của những chất tích điện trong một điện trường nhờ vào hai nguyên tắc cơ bản sau: quá trình điện di (electromigration) và quá trình điện thẩm (electroosmose). + Sự dịch chuyển điện di là sự di chuyển của các cấu tử mang điện trong dung dịch về điện cực ngược dấu.
+ Dòng điện thẩm biểu diễn một dòng chất điện ly lớn gây nên bởi thành mao quản bên trong được tích điện và thế áp đặt. Khi đặt điện thế các cation trong dung dịch điện ly gần thành mao quản di chuyển về phía catod, kéo dung dịch điện ly đi theo chúng. Điều này tạo thành một dòng điện thẩm thấu hướng về phía catod
Mẫu có thể được bơm vào trong hệ thống nhờ áp suất hoặc điện áp. Dưới tác dụng của điện áp cao, các cấu tử đi qua một cửa sổ của mao quản, một detector UV – DAD chọn lọc – bước sóng phát hiện chúng và truyền một tín hiệu điện tỉ lệ với độ hấp thu của mẫu đến máy ghi, tích phân kế hay máy tính. Các tín hiệu này sẽ
được vẽ dưới dạng được sắc kí đồ với một dãy các pic; mỗi pic ứng với một chất. Kĩ thuật điện di mao quản được sử dụng để phân tích nhiều loại mẫu : acid amin, protein, đoạn DNA, acid nucleic và đặc biệt thích hợp cho việc phân tích các chất quý giá có hoạt tính sinh học.
Ƣu điểm
Lượng mẫu đòi hỏi rất bé 5 - 30 µl, với thể tích bơm mẫu thực sự chỉ 10 - 50 nl, ngưỡng phát hiện thấp.
Thời gian phân tích mẫu ít hơn so với các phương pháp truyền thống khác, thời gian phân tích cơ bản chỉ cần vài phút, trường hợp đặc biệt lên đến 30 phút.
Xác định được danh tính và nồng độ các phân tử trong hỗn hợp dựa vào chất chuẩn.
Các yếu tố có khả năng ảnh hƣởng đến kết quả phân tích trên CE - Khi sử dụng dung dịch đệm có pH quá cao hay quá thấp gây ra tính không đồng nhất của điện tích bề mặt thành cột làm ảnh hưởng đến sự phân tách các cấu tử mẫu.
- Nhiệt độ thay đổi dẫn đến thay đổi độ nhớt và dòng điện thẩm (EOF) cũng ảnh hưởng đến quá trình tách chất.
- Điện thế sử dụng bị thay đổi làm thay đổi tương ứng thời gian lưu.
Kĩ thuật sắc kí lỏng cao áp (HPLC) và kĩ thuật điện di mao quản (CE) đều là những phương pháp có độ chính xác cao. Tuy nhiên CE có nhiều ưu điểm hơn về mặt thời gian phân tích, dung môi hóa chất sử dụng và giá thành cho một lần thử nghiệm.
2.8. Các nghiên cứu về việc tăng cƣờng sản xuất hợp chất thứ cấp thực vật [26]
Zenk và cộng sự (1977) đã kiểm tra sự sản xuất serpentine, một loại indole alkaloid trên những môi trường cơ bản khác nhau, kết quả cho thấy lượng serpentine tạo ra phụ thuộc vào thành phần môi trường đã sử dụng. Trong tất cả môi trường đã sử dụng, môi trường MS là thích hợp nhất cho sự tạo thành alkaloid này thông qua nuôi cấy huyền phù tế bào Catharanthus roseus [21].
Trong các thành phần của môi trường chứa chất kích thích sinh trưởng, auxin và kinetin có ảnh hưởng rõ rệt lên sự phát triển và trao đổi chất ở thực vật. Ví dụ như auxin được thêm vào môi trường để kích thích tạo ra mô sẹo nhưng thêm một lượng ít.
2.8.1. Chọn lọc dòng tế bào có sức sản xuất cao
Những đặc tính sinh lý học của mỗi loại tế bào thực vật không phải lúc nào cũng giống nhau, Zenk cùng cộng sự ở Đức đã thu được dòng tế bào Trường xuân hoa chứa hàm lượng ajmalicine và serpentine cao [21]. Điều này cũng tương tự như việc phân lập đơn khuẩn lạc. Tiếp sau những kết quả của họ, nhiều nhà nghiên cứu đã sử dụng phương pháp tạo dòng như là một con đường hứa hẹn để gia tăng các chất chuyển hóa.
2.8.2. Xử lý với Elicitor
Mẫu cấy thực vật nhiễm vi sinh vật có thể tạo ra sự tổng hợp các chất thứ cấp đặc trưng. Nấm là tác nhân gây bệnh được hiểu rõ nhất, nó có các phân tử điều hòa như glucan polymer, glycoprotein và các acid hữu cơ trọng lượng phân tử thấp. DiCosmo và Towers [26] đã xét về sự tương quan giữa stress và sự trao đổi chất thứ cấp trong tế bào nuôi cấy. Các yếu tố gây stress được ứng dụng thông qua chu trình nuôi cấy hoặc như là một yếu tố gây sốc chính tại một vài điểm của chu trình nuôi cấy để làm tăng lượng alkaloid tích lũy.
Những nghiên cứu gần đây cho thấy rằng những phân tử hữu cơ và vô cơ có thể tác động đến sự tích lũy các sản phẩm thứ cấp như vanadyl sulphate tác động đến sự tích tụ indole alkaloid trong nuôi cấy Catharanthus roseus. Những chất khác có thể kích thích sự tích lũy alkaloid trong cây Trường xuân hoa gồm có sodium chloride, potassium chloride, abscisic acid và sorbitol. Những quy trình này với việc tận dụng những elicitor đơn giản và rẻ tiền hứa hẹn cho sản xuất tế bào thực vật quy mô công nghiệp.
2.8.3. Sự bổ sung tiền chất và sự biến đổi sinh học 2.8.3.1 Sự bổ sung tiền chất 2.8.3.1 Sự bổ sung tiền chất
Bổ sung vào môi trường nuôi cấy các tiền chất thích hợp hay những hợp chất liên quan đôi khi cũng làm kích thích sự sản xuất các chất thứ cấp. Phương pháp này rất có lợi nếu giá thành của các tiền chất không đắt. Từ khi Chan và Staba [26]
tương tự cũng đã được thực hiện. Ví dụ như, amino acid đã được thêm vào môi trường nuôi cấy huyền phù tế bào để sản xuất tropane alkaloid, indole alkaloid, ephedorin và vài hiệu quả kích thích đã được quan sát.
Thật sự thì amino acid là tiền chất của những alkaloid khác nhau, nhưng các bước sinh tổng hợp từ amino acid thành alkaloid rất phức tạp đến nỗi người ta nghi ngờ rằng có hay không việc các amino acid được kết hợp trực tiếp để tạo thành alkaloid trong nuôi cấy tế bào. Có lẽ, các amino acid không chỉ tác động lên sự sinh tổng hợp trực tiếp các alkaloid với vai trò như một tiền chất mà còn tác động gián tiếp thông qua những con đường trao đổi chất khác trong tế bào [26].
2.8.3.2. Sự biến đổi sinh học
Thay vì bổ sung những tiền chất vào môi trường nuôi cấy tế bào thực vật, thì người ta còn có thể sử dụng các cơ chất thích hợp để chuyển hóa thành sản phẩm mong muốn trong tế bào thực vật. Phương pháp này đã được ứng dụng rộng rãi trong lên men công nghiệp bằng việc sử dụng vi sinh vật và các enzym của chúng.
Công ty Allelix Inc. ở Canada (Misawa và cộng sự, 1988) đã thiết lập quy trình sản xuất một loại thuốc chống u bướu rất đắt tiền là vinblastine từ catharanthine và vindoline. Cũng quan tâm đến việc sản xuất những hợp chất liên quan đến vinblastine, Bede và DiCosmo (1992) cho rằng sự chuyển hóa catharanthine và vindoline thành anhydrovinblastine là nhờ sử dụng enzyme peroxidase và glucose oxidase để kết hợp vindoline và catharanthine [6].
Tóm lại, tiến trình chuyển hóa liên quan đến sự bổ sung các tiền chất vào môi trường nuôi cấy là một trong những phương án thiết thực nhất xét về phương diện thương mại trong nuôi cấy mô thực vật. Tuy nhiên việc kiếm được những tiền chất không đắt vẫn là vấn đề chính. Do đó việc nuôi cấy mô thực vật tạo ra nhiều tiền chất như catharanthine và vindoline là rất đáng quan tâm.
Chương 3
VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP TIẾN HÀNH
3.1. Nội dung nghiên cứu
Nội dụng 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của IAA, NAA lên sự sinh trưởng của cây Trường xuân hoa in vitro.
Nội dung 2: Xác định sự tạo alkaloid trong cây Trường xuân hoa in vitro khi bổ sung IAA, NAA trên môi trường nuôi cấy.
3.2. Thời gian và địa điểm nghiên cứu
Đề tài được thực hiện từ 29/1/2007 đến 13/08/2007 tại Bộ môn Công nghệ Sinh học và Trung tâm Phân tích Thí nghiệm Hóa Sinh trường Đại học Nông Lâm Tp.HCM.
3.3. Nội dung 1: Nghiên cứu ảnh hƣởng của IAA, NAA lên sự sinh trƣởng của cây Trƣờng xuân hoa in vitro
3.3.1. Vật liệu
3.3.1.1. Đối tƣợng nghiên cứu
Đối tượng nghiên cứu là cây Trường xuân hoa (Catharanthus roseus). Nguồn mẫu để tiến hành thí nghiệm trong đề tài này được thu từ cây trồng trong vườn thực nghiệm của bộ môn Công nghệ sinh học. Các cây Trường xuân hoa có độ tuổi từ 1 năm đến 1 năm rưỡi, cây khỏe và cho hoa đẹp.
3.3.1.2. Thiết bị và dụng cụ
Các thiết bị phục vụ nuôi cấy mô như tủ cấy vô trùng, autoclave, bình tam giác, đĩa petri, bình nuôi cấy 500 ml, dao cấy, đèn cồn, máy đo pH, cân phân tích…
3.3.2. Điều kiện và môi trƣờng nuôi cấy
Môi trường nuôi cấy cơ bản là môi trường MS (Murashiga & Skoog, 1962) có bổ sung các hormone tăng trưởng BA, NAA, IAA tùy thí nghiệm.
Điều kiện phòng nuôi in vitro: nhiệt độ: 24 ± 2oC, ẩm độ: 55 % - 60 %, chiếu sáng 16 giờ/ngày với cường độ ánh sáng là 1000 - 2000 lux.
3.3.3. Phƣơng pháp nghiên cứu
3.3.3.1. Thí nghiệm 1: Khảo sát khả năng sinh trƣởng của cây Trƣờng xuân hoa in vitro theo thời gian trên môi trƣờng MS có bổ sung NAA
Thí nghiệm được tiến hành để xác định giai đoạn cây sinh trưởng tạo rễ tốt nhất khi nuôi cấy trên môi trường MS bổ sung NAA. Vì NAA thường được sử dụng ở nồng độ 0,5 mg/l cho nhiều loại cây nuôi cấy mô nên nồng độ này được chọn để thực hiện trong thí nghiệm. Thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên, một yếu tố. Mỗi nghiệm thức 3 lần lặp lại, gồm 9 cây in vitro.
Bảng 3.1. Bố trí thí nghiệm ảnh hưởng của NAA lên sự sinh trưởng của cây Trường xuân hoa in vitro
Nghiệm thức Hormone NAA 0,5 mg/l
1 2
- +
(-) không có NAA trong môi trường nuôi cấy (+) có NAA trong môi trường nuôi cấy
Số nghiệm thức: 2
Tổng số mẫu: 270 mẫu
Để đánh giá tác động của NAA lên sự sinh trưởng của cây Trường xuân hoa
in vitro, tiến hành đo chiều cao của cây - được tính từ chóp lá cao nhất đến gốc của cây, ghi nhận sự thay đổi về chiều dài rễ và số rễ được tạo thành trên cây. Đơn vị tính là mm. Các chỉ tiêu theo dõi được ghi nhận sau 7, 14, 21, 28, 35 ngày nuôi cấy.
3.3.3.2. Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hƣởng của nồng độ NAA, IAA đến sự sinh trƣởng của cây Trƣờng xuân hoa in vitro
Thí nghiệm được tiến hành với mục tiêu xác định nồng độ và loại chất kích thích sinh trưởng thích hợp bổ sung vào môi trường nuôi cấy để kích thích cây tạo rễ. Thí nghiệm thực hiện trên môi trường MS có bổ sung chất kích thích sinh trưởng (NAA, IAA) với các nồng độ 0,1 mg/l, 0,5 mg/l, 1 mg/l, 5 mg/l, 10 mg/l tùy từng nghiệm thức. Thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên, một yếu tố, 6 nghiệm thức cho mỗi loại chất kích thích sinh trưởng với nghiệm thức 1 là đối chứng. Mỗi nghiệm thức 3 lần lặp lại, mỗi nghiệm thức gồm 9 cây in vitro.
Thí nghiệm 2a: Khảo sát ảnh hƣởng của nồng độ NAA đến sự sinh trƣởng của cây Trƣờng xuân hoa in vitro
Bảng 3.2. Bố trí nghiệm ảnh hưởng của nồng độ NAA đến sự sinh