Sự biểu hiện của gen Survivin dưới tác động của tinh chất Aslem ở in vitro (LV tốt nghiệp)

Sự biểu hiện của gen Survivin dưới tác động của tinh chất Aslem ở in vitro (LV tốt nghiệp)Sự biểu hiện của gen Survivin dưới tác động của tinh chất Aslem ở in vitro (LV tốt nghiệp)Sự biểu hiện của gen Survivin dưới tác động của tinh chất Aslem ở in vitro (LV tốt nghiệp)Sự biểu hiện của gen Survivin dưới tác động của tinh chất Aslem ở in vitro (LV tốt nghiệp)Sự biểu hiện của gen Survivin dưới tác động của tinh chất Aslem ở in vitro (LV tốt nghiệp)Sự biểu hiện của gen Survivin dưới tác động của tinh chất Aslem ở in vitro (LV tốt nghiệp)Sự biểu hiện của gen Survivin dưới tác động của tinh chất Aslem ở in vitro (LV tốt nghiệp)Sự biểu hiện của gen Survivin dưới tác động của tinh chất Aslem ở in vitro (LV tốt nghiệp)Sự biểu hiện của gen Survivin dưới tác động của tinh chất Aslem ở in vitro (LV tốt nghiệp)Sự biểu hiện của gen Survivin dưới tác động của tinh chất Aslem ở in vitro (LV tốt nghiệp)Sự biểu hiện của gen Survivin dưới tác động của tinh chất Aslem ở in vitro (LV tốt nghiệp)Sự biểu hiện của gen Survivin dưới tác động của tinh chất Aslem ở in vitro (LV tốt nghiệp)

17 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN KHOA SINH HỌC Nguyễn Huyền Nhung SỰ BIỂU HIỆN CỦA GEN SURVIVIN DƯỚI TÁC ĐỘNG CỦA TINH CHẤT ASLEM Ở IN VITRO Khóa luận tốt nghiệp đại học hệ quy Ngành Công nghệ sinh học (Chương trình đào tạo chuẩn) Hà Nội - 2017 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN KHOA SINH HỌC Nguyễn Huyền Nhung SỰ BIỂU HIỆN CỦA GEN SURVIVIN DƯỚI TÁC ĐỘNG CỦA TINH CHẤT ASLEM Ở IN VITRO Khóa luận tốt nghiệp đại học hệ quy Ngành Công nghệ sinh học (Chương trình đào tạo chuẩn) Cán hướng dẫn: TS Lê Thị Thùy Dương PGS TS Hoàng Thị Mỹ Nhung Hà Nội - 2017 chữ Times New Roman, 14pt, bold) LỜI CẢM ƠN Em xin bày tỏ với tất lòng biết ơn TS Lê Thị Thùy Dương, người trực tiếp hướng dẫn dạy dỗ em trình thực đề tài Người tận tình bảo truyền đạt cho em kinh nghiệm, kiến thức quý báu hết niềm đam mê khoa học lớn lao, theo sát giúp đỡ em khắc phục nhược điểm thân để hoàn thành tốt đề tài khóa luận Em xin bày tỏ lòng cảm ơn sâu sắc tới PGS TS Hoàng Thị Mỹ Nhung Người trực tiếp giảng dạy, truyền đạt kiến thức môn giúp em thêm hiểu biết có tình yêu khoa học Em xin gửi lời cảm ơn đến PGS TS Lê Quang Huấn, TS Lã Thị Huyền cán nghiên cứu công tác phòng Công nghệ Tế bào Động vật - Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam hỗ trợ giúp đỡ em suốt thời gian thực tập tạo điều kiện thuận lợi, bảo cho trình nghiên cứu thực đề tài Em xin gửi lời cảm ơn đến toàn thể thầy cô công tác Trường Đại học Khoa học Tự nhiên – ĐHQGHN, thầy cô Khoa sinh học nói chung môn Sinh học Tế bào nói riêng tận tình dạy dỗ truyền đạt tri thức quý báu cho em suốt thời gian em học tập rèn luyện trường Đặc biệt tập thể cán bộ, học viên sinh viên phòng Ung thư thực nghiệm - Bộ môn Sinh học tế bào giúp đỡ em suốt thời gian học tập thực tập Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, người thân bạn bè bên cạnh, động viên, cổ vũ kích lệ tinh thần suốt trình học tập nghiên cứu Hà Nội, tháng năm 2017 Sinh viên, Nguyễn Huyền Nhung Khóa luận tốt nghiệp 2017 Danh mục từ viết tắt DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT Viết tắt aa Tên đầy đủ tiếng Anh Amino acid ADN ARN AS Acid deoxyribonucleic Acid ribonucleic BIRC5 Bacloviral IAP repeat – containing BIR C cADN protein Baculoviral IAP repeat Carbon Complementary ADN CP CPC Cycle threshold Chromosomal passenger complex Chu kì ngưỡng Phức hợp truyền tin nhiễm sắc thể DMEM Dulbecco’s Modified Eagle Medium Môi trường nuôi cấy tế bào ĐC EC ER F FBS IAP INCENP in vitro Tên đầy đủ tiếng Việt Aslem endothelial cell estrogen receptor Forward primer Fetal bovine serum Inhibitors of Apoptosis Inner centromere protein in vivo HIF hypoxia-inducible factor mARN N Message ARN Nguyễn Huyền Nhung Chuỗi lặp lại IAP baculovirus ADN bổ sung Đối chứng Tế bào nội mô Thụ thể estrogen Mồi xuôi Huyết bào thai bò Chất ức chế chết theo lập trình tế bào Protein tâm động Mô hình thí nghiệm tế bào Mô hình thí nghiệm động vật Yếu tố kích thích giảm ôxy huyết ARN thông tin Nitơ K58 Công nghệ Sinh học Khóa luận tốt nghiệp 2017 NST Danh mục từ viết tắt Nhiễm sắc thể OD PCR Optical Density Polymer chain reaction Mật độ quang Phản ứng khuếch đại gen RT - qPCR Reverse transcription Quantitativee Polymerase chain reaction standard deviation Phản ứng phiên mã ngược định lượng gen Độ lệch chuẩn STAT3 Signal transducer and activator of transcription Bộ chuyển đổi tín hiệu kích hoạt phiên mã VEGF vascular endothelial growth factor WT Wild type Nhân tố tăng trưởng mạch máu nội mô Tiền thân/ Kiểu dại SD Nguyễn Huyền Nhung K58 Công nghệ Sinh học Khóa luận tốt nghiệp 2017 Danh mục hình ảnh minh họa DANH MỤC HÌNH ẢNH MINH HỌA Hình Cấu trúc phân tử họ IAP Hình Cấu trúc phân tử Survivin Hình Các biến thể khác Survivin mã hoá gen BIRC5 Hình Tác động Survivin lên trình phân bào trình apoptosis Hình Survivin tăng sinh mạch khối u Hình Cơ chế phân tử Survivin hình thành khối u 11 Hình Các chất ức chế Survivin 13 Hình Công thức cấu tạo Aslem 15 Hình Sơ đồ thiết kế thí nghiệm 19 Hình 10 Chu kỳ nhiệt phản ứng PCR 21 Hình 11 Hình ảnh tế bào HCT116 sau 36h thử thuốc nồng độ 6µg/ml 24 Hình 12 Hình ảnh tế bào A549 sau 36h thử thuốc nồng độ 6µg/ml 25 Hình 13 Phổ hấp thụ dòng tế bào HCT116 26 Hình 14 Phổ hấp thụ dòng tế bào A549 26 Hình 15 Biểu đồ thể nồng độ ARN tổng số nhóm đối chứng nhóm thử thuốc dòng tế bào HCT116 A549 sau 36h thử thuốc 28 Hình 16 Biểu đồ đường phản ứng RT - qPCR phát mARN Survivin dòng tế bào HCT116 29 Hình 17 Biểu đồ đường phản ứng RT - qPCR gen nội chuẩn mẫu dòng tế bào HCT116 31 Hình 18 Biểu đồ đường phản ứng RT - qPCR phát mARN Survivin dòng tế bào A549 32 Hình 19 Biểu đồ đường phản ứng RT - qPCR gen nội chuẩn actin dòng tế bào A549 34 Nguyễn Huyền Nhung K58 Công nghệ Sinh học Khóa luận tốt nghiệp 2017 Danh mục bảng minh họa DANH MỤC BẢNG Bảng Biểu protein Survivin loại ung thư khác Bảng Thành phần hỗn hợp phản ứng RT - qPCR 22 Bảng Thành phần hỗn hợp phản ứng RT - qPCR 22 Bảng Chu trình nhiệt phản ứng RT - qPCR 23 Bảng Trình tự cặp mồi probe 23 Bảng Kết đo OD mẫu ARN tổng số dòng tế bào HCT116 A549 27 Bảng Nồng độ ARN tổng số dòng tế bào HCT116 A549 27 Bảng Kết định lượng RT - qPCR mARN Survivin dòng tế bào HCT116 30 Bảng Phân tích thống kê với mẫu dòng tế bào HCT116 30 Bảng 10 Kết định lượng RT - qPCR mARN gen nội chuẩn actin dòng tế bào HCT116 31 Bảng 11 Kết định lượng RT - qPCR mARN Survivin dòng tế bào A549 33 Bảng 12 Phân tích thống kê với mẫu dòng tế bào A549 33 Bảng 13 Kết ngưỡng phát phản ứng RT - qPCR mARN gen nội chuẩn actin dòng tế bào A549 34 Nguyễn Huyền Nhung K58 Công nghệ Sinh học Khóa luận tốt nghiệp 2017 Mục lục MỤC LỤC DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH MINH HỌA DANH MỤC BẢNG MỞ ĐẦU CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 SURVIVIN 1.1.1 Cấu trúc phân tử 1.1.2 Chức 1.1.2.1 Điều hòa trình phân chia tế bào 1.1.2.2 Ức chế trình apoptosis 1.1.2.3 Hỗ trợ trình tăng sinh mạch 1.1.3 Survivin với ung thư 1.1.3.1 Biểu Survivin tế bào ung thư 1.1.3.2 Cơ chế Survivin 10 1.1.3.3 Survivin chuẩn đoán điều trị ung thư 13 1.2 ASLEM 15 1.2.1 Nguồn gốc 15 1.2.2 Tác dụng hóa lý 15 1.2.2.1 Công thức cấu tạo 15 1.2.2.2 Tính chất hóa lý 16 1.2.3 Tính chất dược lý 16 1.2.4 Tác dụng tinh chất Aslem tế bào ung thư 16 1.2.5 Chỉ định liều dùng 17 CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18 2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 18 2.1.1 Tế bào 18 2.1.2 Tinh chất 18 2.1.3 Hóa chất 18 2.1.4 Dụng cụ trang thiết bị nghiên cứu 18 Nguyễn Huyền Nhung K58 Công nghệ Sinh học Khóa luận tốt nghiệp 2017 Mục lục 2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19 2.2.1 Nuôi cấy tế bào 19 2.2.2 Tách chiết ARN 20 2.2.3 Xác định nồng độ độ tinh ARN vừa tách chiết dựa vào bước sóng phổ hấp thụ 20 2.2.4 RT-qPCR phát gene Survivin 21 2.2.4.1 Nguyên tắc 21 2.2.4.2 Quy trình phản ứng 22 2.2.4.3 Trình tự cặp mồi probe 23 2.2.5 Xử lý thống kê 23 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 24 3.1 KẾT QUẢ THỬ THUỐC TRÊN TẾ BÀO 24 3.1.1 Trên dòng tế bào HCT116 24 3.1.2 Trên dòng tế bào A549 25 3.2 KẾT QUẢ TÁCH CHIẾT ARN 25 3.2.1 Phổ hấp thụ ARN 25 3.2.2 Nồng độ ARN tổng số 27 3.3 KẾT QUẢ PHẢN ỨNG RT-qPCR 28 3.3.1 Dòng tế bào HCT116 29 3.3.2 Dòng tế bào A549 32 KẾT LUẬN 38 ĐỀ NGHỊ 38 TÀI LIỆU THAM KHẢO 39 Nguyễn Huyền Nhung K58 Công nghệ Sinh học Mở đầu Khóa luận tốt nghiệp MỞ ĐẦU Ung thư thuật ngữ chung cho nhóm lớn bệnh đặc trưng tăng trưởng bất thường tế bào, sau di sang quan khác Thuật ngữ phổ biến khác sử dụng khối u ác tính u Ung thư ảnh hưởng đến phận thể coi nguyên nhân hàng đầu gây tử vong toàn giới Theo báo cáo WHO, vào năm 2015 có 8,8 triệu ca tử vong bệnh ung thư Trên toàn cầu, gần 1/6 trường hợp tử vong ung thư Một số nguyên nhân gây ung thư đột biến gen ung thư (oncogene) Đây gen kiểm soát phát triển tế bào, điều hòa đường dẫn truyền tín hiệu, kích thích phân bào trình chết theo lập trình tế bào (apoptosis) Khi gen bị đột biến gây tăng sinh tế bào không kiểm soát dẫn đến khối u Survivin coi oncogene phát vào khoảng 20 năm gần Survivin biểu mức hầu hết tế bào ung thư, chống lại trình apoptosis tế bào ảnh hưởng tới chu kỳ phân bào giúp khối u tồn phát triển Hiện nay, giới có nhiều nghiên cứu biểu ứng dụng Survivin vào liệu pháp điều trị ung thư Để điều trị bệnh ung thư, nhiều phương pháp loại thuốc sử dụng Aslem thuốc tăng cường miễn dịch, hỗ trợ điều trị ung thư sản xuất Việt Nam Thuốc ứng dụng sử dụng lâm sàng 10 năm Tuy nhiên, chế sinh học phân tử đích tác dụng thuốc chưa nghiên cứu nhiều Do đó, thực đề tài “Sự biểu gen Survivin tác động tinh chất Aslem in vitro” nhằm đánh giá tác động Aslem lên biểu gen Survivin dòng tế bào ung thư ruột (HCT116) ung thư phổi (A549) Kết thảo luận Khóa luận tốt nghiệp 2017 Bảng 11 Kết định lượng RT - qPCR mARN Survivin dòng tế bào A549 Tương tự với dòng tế bào HCT116, mẫu dòng tế bào A549 cho tín hiệu huỳnh quang vượt ngưỡng phát Mẫu đối chứng (-) tín hiệu phát Giá trị CP phân tích thống kê phần mềm MS Office 2016 thể Bảng 12 Bảng 12 Phân tích thống kê với mẫu dòng tế bào A549 A549 X ± SD ĐC 21,94 22,16 21,93 22,01 ± 0,1 p 0,048 < 0,05 AS 23,15 22,46 23,83 23,15 ± 0,56 Kết Bảng 13 cho thấy giá trị CP nhóm thử 23,15 ± 0,56 cao so với nhóm đối chứng 22,01 ± 0,1; sai khác có ý nghĩa thống kê với độ tin cậy 95% P