Đang tải... (xem toàn văn)
Nghiên cứu tính đa dạng của virus y trên khoai tây trồng tại thái nguyên
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.Lrc-tnu.edu.vn ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM ------------------------------ VŨ THỊ BƯỞI NGHIÊN CỨU TÍNH ĐA DẠNG CỦA VIRUS Y TRÊN KHOAI TÂY TRỒNG TẠI THÁI NGUYÊN Chuyên ngành: Di truyền học Mã số: 60.42.70 TÓM TẮT LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Thái Nguyên-2009 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.Lrc-tnu.edu.vn Công trình được hoàn thành tại: Khoa Sinh -Trường Đại học Sư phạm-Đại học Thái Nguyên Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS. Chu Hoàng Mậu Phản biện 1:…………………………………… Phản biện 2:……………………………………. Luận văn sẽ được bảo vệ trước hội đồng chấm luận văn họp tại: Trường Đại học Sư phạm-Đại học Thái Nguyên Ngày…….tháng………năm 2009 Có thể tìm hiểu luận văn tại thư viện Đại học Thái Nguyên Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.Lrc-tnu.edu.vn ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM ------------------------------ VŨ THỊ BƢỞI NGHIÊN CỨU TÍNH ĐA DẠNG CỦA VIRUS Y TRÊN KHOAI TÂY TRỒNG TẠI THÁI NGUYÊN LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Thái Nguyên-2009 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.Lrc-tnu.edu.vn ii LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới PGS.TS. Chu Hoàng Mậu, Phó Giám đốc Đại học Thái Nguyên, đã rất tận tình hƣớng dẫn, chỉ bảo và giúp đỡ tôi hoàn thành luận văn của mình. Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới TS. Nguyễn Vũ Thanh Thanh (trƣờng Đại học Khoa học), các thầy cô giáo, cán bộ khoa sau đại học và khoa Sinh (trƣờng Đại học Sƣ phạm-Đại học Thái Nguyên) đã hƣớng dẫn, tạo mọi điều kiện cho tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới TS. Chu Hoàng Hà, chị Phạm Thị Vân, Phòng Công nghệ Tế bào Thực vật-Viện Công nghệ Sinh học và các cán bộ phòng thí nghiệm Di truyền học, khoa Sinh-Trƣờng Đại học Sƣ phạm; phòng thí nghiệm thuộc khoa Sinh-Trƣờng Đại học Khoa học, Đại học Thái Nguyên đã nhiệt tình hƣớng dẫn, giúp đỡ để tôi có thể hoàn thành luận văn này. Cuối cùng, tôi xin dành cho những ngƣời thân yêu trong gia đình và bạn bè những lời biết ơn sâu sắc. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.Lrc-tnu.edu.vn iii LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu, kết quả nghiên cứu trong luận văn là trung thực và chƣa có ai công bố trong một công trình nào khác. Thái Nguyên, tháng 9, năm 2009 Tác giả Vũ Thị Bƣởi Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.Lrc-tnu.edu.vn iv NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT aa Acid amine DNA DeoxyribonucleicvAcid RNA Ribonuleic Acid bp Basepair cDNA Complementary DNA CP Coat protein cs Cộng sự DEPC Diethyl pyrocarbonate NXB Nhà xuất bản IPTG Isopropylthio-β-D-galactosidase Kb Kilobase LB Luria and Bertani RT-PCR Reverse Transcriptase – Polymerase Chain Reaction PVY Potato virus Y PVYN Potato virus Y strain N PVYC Potato virus Y strain C PVYO Potato virus Y strain O PVYNTN Potato virus Y strain (variant) NTN RNase Ribonuclease X-gal 5-brom-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactosidase Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.Lrc-tnu.edu.vn v DANH MỤC CÁC HÌNH Tên hình Trang Hình 1.1. Các gen kháng (màu xanh) với 4 virus chủ yếu (PVY, PLRV, PVX, PVA) Hình 1.2. Những đốm (mottle) điển hình trên cây thuốc lá N. tabacum cv Xanthi gây ra bởi PVY khoai tây sau 15 ngày tiêm . Hình 1.3. Hình dạng của PVY . Hình 1.4. Sơ đồ mô tả hệ gen của các chủng PVYO, PVYN và các biến thể PVYNTN, PVYNW . Hình 1.5. Loài rệp có cánh truyền PVY (Aphis nasturtii) . Hình 1.6. Dấu hiệu so sánh PVY trên Nicotiana tabacum cv Xanthi (sau 15 ngày tiêm) . Hình 1.7. Triệu chứng nhiễm lần 2 với PVY trên cánh đồng khoai tây Hình 1.8. Triệu chứng của bệnh đốm chết hoại củ khoai tây (PTNRD) Hình 1.9. Vị trí các gen kháng PVY trên genome khoai tây . Hình 2.1. Sơ đồ thí nghiệm tổng quát . Hình 3.1. Một số hình ảnh về khoai tây ở các vùng nghiên cứu . Hình 3.2. Kết quả RT-PCR từ RNA của các mẫu lá khoai tây nghi nhiễm bệnh Hình 3.3. Kết quả điện di DNA thu đƣợc từ kỹ thuật thôi gel trên agarose 1% . Hình 3.4. Kết quả colony-PCR một số dòng khuẩn lạc với mẫu Phổ Yên Hình 3.5. Kết quả colony-PCR một số dòng khuẩn lạc với mẫu Phú Bình Hình 3.6. Kết quả điện di tách plasmid mang gen CP Hình 3.7. So sánh trình tự nucleotide của gen CP-PVY trên 2 mẫu nghiên cứu . Hình 3.8. So sánh trình tự acid amine của gen CP-PVY trên 2 mẫu nghiên cứu . Hình 3.9. Biểu đồ hình cây biểu diễn mối quan hệ di truyền của CP-PVY phân lập đƣợc từ Phổ Yên và Phú Bình với 19 trình tự trong ngân hàng gen 13 16 16 17 19 21 22 23 24 29 39 41 43 45 46 46 49 50 52 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.Lrc-tnu.edu.vn vi DANH MỤC CÁC BẢNG Tên bảng Trang Bảng 1.1. Một số virus khoai tây thuộc nhóm 1 . Bảng 1.2. Một số virus khoai tây thuộc nhóm 2 . Bảng 1.3. Một số virus khoai tây thuộc nhóm 3 . Bảng 1.4. Ảnh hƣởng của bệnh virus đến củ khoai tây . Bảng 2.1. Danh sách các mẫu thu tại các điểm nghiên cứu Bảng 2.2. Thành phần phản ứng PCR Bảng 2.3. Chu kì nhiệt cho phản ứng PCR . Bảng 2.4. Thành phần phản ứng gắn gen vào vector tách dòng Bảng 2.5. Thành phần phản ứng PCR đọc trình tự . Bảng 2.6. Chu kì nhiệt cho phản ứng PCR đọc trình tự Bảng 3.1. Tỉ lệ có triệu chứng bị bệnh ở các cánh đồng khoai tây nghiên cứu . Bảng 3.2. Trình tự mồi đặc hiệu nhân gen CP Bảng 3.3. Trình tự mồi để thực hiện colony-PCR Bảng 3.4. 19 trình tự trong ngân hàng gen đƣợc sử dụng để đƣa ra so sánh . Bảng 3.5. Hệ số giống nhau và khác nhau về trình tự nucleotide vùng mã hoá của gen CP ở mẫu nghiên cứu với các mẫu trên ngân hàng gen NCBI 8 8 9 10 28 32 32 33 35 36 39 40 45 51 54 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.Lrc-tnu.edu.vn vii MỤC LỤC MỞ ĐẦU . Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU . 1.1. Cây khoai tây 1.1.1. Nguồn gốc, phân loại và giá trị của khoai tây . 1.1.2. Một số đặc điểm sinh học của cây khoai tây . 1.1.3. Tình hình sản xuất khoai tây trên thế giới và ở Việt Nam . 1.2. Virus gây bệnh trên khoai tây 1.2.1. Các loại virus khoai tây 1.2.2. Đặc điểm chính của bệnh virus trên khoai tây 1.3. Virus Y ở khoai tây . 1.3.1. Phân loại 1.3.2. Cây chủ 1.3.3. Hình dạng và cấu trúc phân tử 1.3.4. Quan hệ họ hàng với các potyvirus khác 1.3.5. Lan truyền của PVY . 1.3.6. Một số đặc điểm của PVY trên khoai tây . 1.4. Tình hình nghiên cứu PVY trên thế giới và ở Việt Nam 1.4.1. Tình hình nghiên cứu PVY trên thế giới . 1.4.2. Tình hình nghiên cứu PVY ở Việt Nam . 1 3 3 3 5 5 6 7 9 14 14 14 16 17 18 20 24 24 27 Chƣơng 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU . 2.1. Vật liệu nghiên cứu . 2.2. Hóa chất, thiết bị, địa điểm nghiên cứu . 2.2.1. Hóa chất . 2.2.2. Thiết bị . 2.2.3. Địa điểm nghiên cứu 2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu . 2.3.1. Phƣơng pháp thống kê 2.3.2. Phƣơng pháp tách chiết RNA tổng số . 28 28 28 28 28 29 29 29 30 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.Lrc-tnu.edu.vn viii 2.3.3. Phƣơng pháp RT-PCR . 31 2.3.4. Phƣơng pháp tinh sạch sản phẩm PCR . 2.3.5. Phƣơng pháp gắn gen vào vector tách dòng . 2.3.6. Biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào khả biến E.coli DH5α 2.3.7. Phƣơng pháp PCR trực tiếp từ khuẩn lạc (colony-PCR) . 2.3.8. Tách chiết plasmid . 2.3.9. Phƣơng pháp xác định trình tự nucleotide 2.3.10. Phƣơng pháp xử lí trình tự gen thu đƣợc Chƣơng 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Kết quả khảo sát tỉ lệ nhiễm PVY . 3.2. Kết quả nhân gen, tách dòng cDNA 3.2.1. Kết quả nhân gen bằng kỹ thuật RT-PCR . 3.2.2. Kết quả tinh sạch sản phẩm PCR 3.2.3. Kết quả biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào khả biến E.coli DH5α. 3.2.4. Kết quả chọn lọc plasmid tái tổ hợp bằng colony-PCR . 3.2.5. Kết quả tách plasmid từ các khuẩn lạc của 2 mẫu nghiên cứu 3.3. Kết quả so sánh trình tự gen CP-PVY phân lập từ 2 mẫu nghiên cứu với một số trình tự trong ngân hàng gen 3.3.1. So sánh trình tự nucleotide và acid amine của gen CP-PVY trên 2 mẫu nghiên cứu . 3.3.2. So sánh trình tự nucleotide gen CP-PVY trên 2 mẫu nghiên cứu với các trình tự gen CP-PVY trên khoai tây đã đƣợc công bố trong ngân hàng gen KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ . CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ . TÀI LIỆU THAM KHẢO . 33 33 34 34 34 35 36 38 38 40 40 42 43 44 46 47 47 50 55 56 57 [...]... sĩ là: Nghiên cứu tính đa dạng của virus Y trên khoai t y trồng tại Thái Nguyên 2 MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU Xác định sự đa dạng trong cấu trúc gen mã hoá protein vỏ (CP- coat protein) của PVY phân lập từ các mẫu lá khoai t y thu tại một số địa phƣơng thuộc tỉnh Thái Nguyên 3 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 3.1 Khảo sát, thống kê và xác định tỉ lệ nhiễm PVY trên khoai t y ở Thái Bình, Thái Nguyên, Hƣng Y n, Bắc Giang... nhiều y u tố, trong đó hai y u tố quan trọng nhất là giống khoai t y và chủng virus 1.3.6.2 Các chủng và các biến thể của PVY khoai t y PVY khoai t y đƣợc chia thành 3 chủng (PVYO, PVYN và PVYC), nhiều biến thể PVYO, PVYN và PVYC đƣợc phân biệt dựa trên các phản ứng của chúng trên c y thuốc lá Nicotiana tabacum và trên khoai t y trồng mang các „hypersensitivity gene’ Nytbr và Nc (Kerlan, 2008) [40] PVYN... hoặc Lys50 cho Asn, Ile225 cho Val, Ser355 cho Gly Lys50 là một Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 19 http://www.Lrc-tnu.edu.vn phần của “LITC motif” có tính bảo thủ (Lys–Ile–Thr–Cys) Thay đổi bên trong hay xung quanh motif n y có thể làm mất tính chất có thể truyền bởi rệp của PVY 1.3.6 Một số đặc điểm của PVY trên khoai t y 1.3.6.1 Thiệt hại PVY g y ra trên khoai t y Ở khoai t y, hiện... nhiễm virus nhƣ một chỉ tiêu đánh giá sự nhiễm bệnh nấm của c y khoai t y Bệnh thối trong kho do nấm Fusarium sẽ tăng lên gấp 5 lần khi củ khoai t y bị nhiễm virus X và tăng gấp 6 lần khi củ khoai t y bị nhiễm nhiều virus cùng lúc (X, S, M) (Vũ Triệu Mân, 1986) [6] 1.2.2.2 Lan truyền của virus khoai t y Các virus khoai t y đƣợc truyền có hiệu quả bởi rệp Rệp có thể định cƣ ở khoai t y hay di cƣ từ c y trồng, ... vào nghiên cứu chọn tạo giống c y trồng, đặc biệt là sử dụng các vật liệu di truyền từ các virus g y bệnh để tạo c y trồng chuyển gen kháng virus đã thu đƣợc kết quả đáng khích lệ nhƣ c y khoai t y chuyển gen Nib kháng PVY Tạo c y khoai t y chuyển gen kháng virus đƣợc coi là một biện pháp hữu hiệu để ngăn chặn và hạn chế tác hại do virus g y ra Nhƣng vấn đề đặt ra là phổ kháng bệnh của những c y chuyển... chứng của bệnh do PVY trên khoai t y Ba chủng (PVYO, PVYN, PVYC) g y ra các triệu chứng khác nhau ở c y khoai t y: + PVYO: Khi l y nhiễm lần đầu (primer), phản ứng của c y với chủng virus n y phụ thuộc vào giống khoai t y Lá c y có thể chết hoại, tạo đốm hay ngả vàng, lá rũ xuống, đôi khi c y non bị chết Lúc đầu các lá non xuất hiện Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 21 http://www.Lrc-tnu.edu.vn... loại và giá trị của khoai t y C y khoai t y có tên khoa học là Solanum tuberosum L., thuộc họ cà (Solanaceae) Khoai t y có nguồn gốc từ vùng núi Andes của Bolivia và Peru Vào thế kỉ XVI, ngƣời T y Ban Nha xâm chiếm Peru và họ đã đem c y khoai t y về nƣớc trồng Đến cuối thế kỉ XVI, khoai t y đã đƣợc trồng rộng rãi ở nhiều nƣớc Châu Âu (Vũ Hƣớng Văn, 2007) [12], (Macdec, 1963) [45] Khoai t y đƣợc du nhập... triển của ung thƣ và một số bệnh khác Các nhà nghiên cứu tại trƣờng Đại học Y Harvard-Mỹ đã phát hiện ra rằng: những ngƣời thƣờng xuyên ăn khoai t y có khả năng giảm ung thƣ tuyến tiền liệt (Vũ Hƣớng Văn, 2007) [12] Những nghiên cứu gần đ y còn cho th y củ khoai t y rất giàu sterol, giúp tăng cƣờng khả năng miễn dịch của cơ thể Có nghiên cứu cho th y, khoai t y có tác dụng làm chậm sự tấn công của HIV/... truyền PVY lớn nhất Ở khoai t y, loài n y cùng những loài định cƣ ở khoai t y trong thời gian dài trên cánh đồng là tác nhân truyền virus chủ y u Tuy v y, những loài di cƣ từ những cánh đồng khác cũng có vai trò đáng kể trong việc truyền PVY Rệp ngũ cốc, rệp đậu hà lan đƣợc cho là liên quan tới dịch bệnh x y ra trên cánh đồng khoai t y ở Châu Âu, Bắc Mỹ (Kerlan và cs, 2008) [41] PVY có phạm vi c y chủ... VIRUS Y 1.3.1 Phân loại Potato virus Y (PVY) thuộc chi potyvirus và họ potyviridae Đ y đƣợc xem là một họ lớn nhất và g y thiệt hại nghiêm trọng về kinh tế nhất của virus thực vật (Dimitre và cs, 2004) [28], (Tetsuji Ogawa và cs, 2008) [66] 1.3.2 C y chủ Phạm vi c y chủ tự nhiên của PVY gồm những c y thuộc 9 họ Có thể kể đến các c y sau: Khoai t y (S tuberosum ssp.tuberosum); một vài loài khoai tây . NGHIÊN CỨU TÍNH ĐA DẠNG CỦA VIRUS Y TRÊN KHOAI T Y TRỒNG TẠI THÁI NGUYÊN LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Thái Nguyên- 2009 Số hóa. TÍNH ĐA DẠNG CỦA VIRUS Y TRÊN KHOAI T Y TRỒNG TẠI THÁI NGUYÊN Chuyên ngành: Di truyền học Mã số: 60.42.70 TÓM TẮT LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Thái
