3.2.1. Kết quả nhân gen bằng kỹ thuật RT-PCR
Chúng tôi đã thu thập một số mẫu lá khoai tây có triệu chứng nhiễm PVY từ 5 cánh đồng khoai tây: Phổ Yên, Phú Bình, Thái Bình, Hƣng Yên, Bắc Giang. Sau đó, tiến hành phân lập gen CP của PVY từ các mẫu lá khoai tây này.
Trƣớc tiên, chúng tôi tiến hành tách chiết RNA tổng số từ mẫu lá có triệu chứng nhiễm bệnh (theo quan sát bằng mắt thƣờng) và tổng hợp cDNA từ RNA tổng số này. Gen CP đƣợc nhân lên bằng phƣơng pháp PCR với cặp mồi đặc hiệu đƣợc cung cấp bởi Phòng Công nghệ Tế bào Thực vật - Viện Công nghệ Sinh học:
Bảng 3.2. Trình tự mồi đặc hiệu nhân gen CP
Mồi Trình tự
PVYCPF1 5‟ GCYTTCACTGAAATGATGGT 3‟
Để kết quả nhân gen đƣợc chính xác, chúng tôi đã lặp lại thí nghiệm 3 lần và có đối chứng dƣơng (+), đối chứng âm (-) khi làm thí nghiệm. Sản phẩm PCR đƣợc điện di kiểm tra trên gel agarose 1%. Kết quả đƣợc thể hiện ở hình 3.2.
Có rất nhiều yếu tố có thể ảnh hƣởng tới chất lƣợng của phản ứng RT- PCR nhƣ: Lƣợng RNA quá ít hoặc quá nhiều, nồng độ mồi quá cao hoặc quá thấp, nhiệt độ gắn mồi chƣa phù hợp…Vì vậy trong quá trình tiến phản ứng cần điều chỉnh hàm lƣợng các thành phần phản ứng (lƣợng mẫu, nồng độ mồi, Mg2+…), nhiệt độ gắn mồi, thời gian đối với mỗi bƣớc của chu kì nhiệt…để phản ứng RT-PCR xảy ra đặc hiệu nhất.
Hình 3.2. Kết quả RT-PCR từ RNA của các mẫu lá khoai tây nghi nhiễm bệnh M: Marker DNA 1Kb
1: Hƣng Yên; 2: Bắc Giang; 3: Thái Bình1; 4: Thái Bình2; 5: Phổ Yên; 6: Phú Bình
(+) : Đối chứng dƣơng - plasmid pTZ57R/T/CP-PVY (-) : Đối chứng âm-thành phần PCR không có RNA
Hình 3.2 cho thấy, chỉ mẫu lá khoai tây ở Phổ Yên-Thái Nguyên, Phú Bình-Thái Nguyên và plasmid mang gen PVY là có đoạn gen đƣợc nhân lên với kích thƣớc khoảng 1200bp. Kích thƣớc này phù hợp với tính toán khi thiết
kế mồi nhân gen. Vì vậy, chúng tôi kết luận đã nhân thành công đoạn gen có kích thƣớc tƣơng ứng với gen CP của PVY trên khoai tây từ 2 mẫu Phổ Yên và Phú Bình.
Từ kết quả RT-PCR chúng tôi kết luận:
- Các mẫu lá đƣợc nghi có triệu chứng bị bệnh PVY thu thập từ Hƣng Yên, Bắc Giang, Thái Bình không chứa PVY. Điều này có thể do khi thu thập mẫu quan sát bằng mắt thƣờng nên nhầm lẫn với các bệnh hay loại virus khác. Nhƣ vậy, phƣơng pháp quan sát bằng mắt thƣờng để xác định bệnh do PVY gây ra ở khoai tây sẽ không chính xác.
- Đã phân lập thành công đoạn gen có kích thƣớc tƣơng ứng với gen CP của PVY từ mẫu khoai tây ở Phổ Yên-Thái Nguyên và Phú Bình-Thái Nguyên. Để đƣa ra kết luận chính xác đoạn gen nhân đƣợc là gen CP từ PVY cần tiến hành tách dòng và đọc trình tự đoạn gen này.
3.2.2. Tinh sạch sản phẩm RT-PCR
Quá trình tách dòng đƣợc thực hiện bằng cách gắn sản phẩm PCR vào vector tách dòng. Tuy nhiên, sản phẩm PCR ngoài đoạn gen mong muốn ra còn rất nhiều sản phẩm phụ, các nucleotide dƣ thừa sau phản ứng, mồi, enzyme, đệm…Vì vậy để phản ứng ghép nối đạt đƣợc hiệu quả cao nhất cần thiết phải có quá trình tinh sạch sản phẩm PCR để loại bỏ các thành phần không mong muốn. Quy trình tinh sạch sản phẩm PCR (thôi gel) đƣợc thực hiện theo hƣớng dẫn của bộ kit QIAquick Gel Extraction.
Khi nâng nhiệt độ 500C thì agarose tan chảy, DNA đƣợc hoà vào dung dịch QG. Sau khi cho dung dịch vào cột tinh sạch QIAquick spin, DNA đƣợc giữ lại bởi các phân tử có ái lực cao với DNA cố định trên màng lọc của cột tinh sạch, dịch đệm QG và agarose bị loại đi nhờ li tâm. Để loại bỏ hết agarose còn bám trên màng lọc, cần thiết phải bổ sung QG vào cột lần thứ 2. DNA đƣợc làm sạch bằng đệm rửa PE chứa 80% ethanol và đƣợc hoà tan
trong dịch đệm EB hoặc nƣớc deion khử trùng. Bằng phƣơng pháp này đã giữ lại với hiệu suất 85% trở lên.
Hình 3.3. Kết quả điện di DNA thu đƣợc từ kỹ thuật thôi gel trên agarose 1% (M: Marker DNA 1Kb; 1: Phổ Yên; 2: Phú Bình)
Hình 3.3 cho thấy, sản phẩm thôi gel có hàm lƣợng cao, không bị đứt gẫy đảm bảo cho việc tiến hành các thí nghiệm tiếp theo.
3.2.3. Kết quả biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào khả biến E.coli DH5α
Chúng tôi sử dụng vector tách dòng pBT do Phòng Công nghệ Tế bào Thực vật, Viện Công nghệ Sinh học cung cấp để tiến hành phản ứng ghép nối và biến nạp.
Sản phẩm RT-PCR sau khi tinh sạch đƣợc gắn vào vector pBT bởi enzyme T4 ligase. Phản ứng ghép nối dựa trên nguyên tắc bổ sung giữa hai đầu nucleotide A thò ra ở sản phẩm PCR với Taq polymerase và hai đầu nucleotide T trên vector tách dòng. Hỗn hợp phản ứng đƣợc ủ ở nhiệt độ phòng trong 2 giờ để phản ứng xảy ra hoàn toàn. Vector tái tổ hợp sau đó đƣợc biến nạp vào tế bào khả biến E.coli chủng DH5α và đƣợc cấy trải trên môi trƣờng LB đặc có bổ sung ampicillin 100mg/l, X-gal 40mg/ml và IPTG 100M. Ủ đĩa petri ở 370C trong 16 giờ.
Thành công của thí nghiệm này phụ thuộc vào rất nhiều yếu tố, nhƣng có 2 yếu tố quan trọng nhất:
+ Sản phẩm PCR phải đặc hiệu, chất lƣợng tốt.
+ Tế bào khả biến phải đƣợc chuẩn bị tốt mới đạt đƣợc hiệu suất biến nạp cao nhất.
Chúng tôi đã thu đƣợc một lƣợng lớn khuẩn lạc gồm cả khuẩn lạc xanh và khuẩn lạc trắng. Các khuẩn lạc xanh có thể mọc lên từ tế bào nhận đƣợc plasmid tự đóng vòng trở lại nên gen lac-operon hoạt động tổng hợp enzyme β-galactosidase. Enzyme này sẽ chuyển hoá cơ chất X-gal thành hợp chất có màu xanh dƣới sự cảm ứng của IPTG. Còn những khuẩn lạc trắng xuất hiện là do vi khuẩn nhận đƣợc plasmid mang lac-operon không hoạt động, enzyme β- galactosidase không đƣợc tạo nên không có quá trình chuyển hoá X-gal thành dạng màu xanh. Lac-operon bị bất hoạt có thể do đoạn gen ngoại lai xen vào giữa promotor của operon gen LacZ làm cho lac-promotor không thể điều khiển quá trình tổng hợp enzyme. Đoạn gen ngoại lai có thể là đoạn gen CP- PVY nguyên vẹn hoặc cũng có thể là những đoạn bị đứt gãy. Các khuẩn lạc trắng có thể là những khuẩn lạc vệ tinh không mang plasmid. Khuẩn lạc vệ tinh có kích thƣớc nhỏ, đƣợc mọc lên xung quanh các khuẩn lạc có plasmid chứa đoạn gen xen vào sau khi khuẩn lạc này đã phân huỷ đáng kể lƣợng kháng sinh trong môi trƣờng xung quanh.
Để nhân đƣợc dòng tế bào mang plasmid tái tổ hợp chứa đoạn gen CP cần phải tiến hành chọn lọc plasmid tái tổ hợp bằng cách PCR trực tiếp từ khuẩn lạc (colony-PCR) để loại bỏ các trƣờng hợp không mong muốn.
3.2.4. Kết quả chọn lọc plasmid tái tổ hợp bằng colony-PCR
Tiến hành PCR trực tiếp từ một số khuẩn lạc trắng với cặp mồi pUC18- F1/pUC18-R1 để xác định khuẩn lạc có thể mang gen CP. Chỉ sử dụng cặp mồi này chứ không sử dụng cặp mồi đặc hiệu nằm trong gen vì trong phản
ứng gắn gen vào vector, một lƣợng lớn gen không đƣợc gắn vào vector vẫn tồn tại trong hỗn hợp phản ứng, do đó khi cấy trải lên đĩa thạch các gen này nằm rải rác trên đĩa thạch và có thể nằm ngay dƣới hoặc xung quanh các khuẩn lạc. Do đó, phản ứng colony-PCR sẽ bị gây nhiễm và kết quả không chính xác
Hình 3.4. Kết quả colony-PCR một số dòng khuẩn lạc với mẫu Phổ Yên M: Marker DNA 1Kb
1-7: Dòng khuẩn lạc số 1-7
(+) : Đối chứng dƣơng - plasmid pTZ57R/T/CP-PVY (-1) : Đối chứng âm – dòng khuẩn lạc xanh
(-2) : Đối chứng âm – Thành phần PCR không có khuẩn lạc Bảng 3.3. Trình tự mồi để thực hiện colony-PCR
Tên mồi Trình tự
pUC18-F1 5‟ - GAGGGTTTTCCCAGTCACGA – 3‟
Hình 3.5. Kết quả colony-PCR một số dòng khuẩn lạc với mẫu Phú Bình M: Marker DNA 1Kb
8-9: Dòng khuẩn lạc số 8-9
Từ kết quả điện di cho thấy, sản phẩm colony PCR từ 9 dòng khuẩn lạc trắng có 7 dòng cho kết quả dƣơng tính đó là các dòng 1, 2, 4, 5, 6, 8, 9.
3.2.5. Kết quả tách plasmid từ các khuẩn lạc của 2 mẫu nghiên cứu
A B
Hình 3.6. Kết quả điện di tách plasmid mang gen CP (A: Mẫu Phổ Yên; B: Mẫu Phú Bình)
Chúng tôi chọn khuẩn lạc trắng của dòng 1 và dòng 2 với mẫu Phổ Yên; dòng 8 của mẫu Phú Bình để tách plasmid theo bộ kit của hãng Bioneer. Sản phẩm DNA plasmid đƣợc điện di trên gel agarose 1%. Kết quả đƣợc thể hiện ở hình 3.6.
Kết quả điện di trên hình 3.6 cho thấy, sản phẩm tách plasmid sạch, đảm bảo chất lƣợng và số lƣợng để tiến hành đọc trình tự nucleotide của gen CP.
3.3. KẾT QUẢ SO SÁNH TRÌNH TỰ GEN CP CỦA PVY TỪ HAI MẪU NGHIÊN CỨU
Trình tự nucleotide của gen CP đƣợc xác định trên máy đọc tự động ABI PRISM® 3100 Avant Genetic Analyzer theo hai chiều xuôi và ngƣợc. Khi so sánh 2 trình tự này trong BLAST của NCBI, kết quả cho biết đây là các trình tự gen mã hoá CP của PVY ở khoai tây. Chiều dài gen CP ở 2 mẫu Phổ Yên và Phú Bình đều có kích thƣớc 1201 nucleotide, đoạn mã hóa dài 801 nucleotide, protein dài 267 acid amine. Chúng tôi kết luận đã nhân, tách dòng và đọc trình tự thành công đoạn gen mã hoá CP của PVY trên khoai tây.
3.3.1. So sánh trình tự nuclotide và acid amine của gen CP-PVY trên 2 mẫu nghiên cứu
....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
10 20 30 40 50
Pho Yen GGAAATGACA CAATCGATGC AGGAGGAAGC ACTAAGAAGG ATGCAAAACA
Phu Binh GCAAATGACA CAATTGATGC AGGAGAAAGC AACAAGAAAG ATGCAAAACC ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
60 70 80 90 100
Pho Yen AGAGCAAGGT AGCATTCAAC CAAATCTCAA CAAGGAAAAG GAAAAGGACG
Phu Binh AGAGCAAGGC AGCATCCAGT CAAACCTGAA CAAAGGAAAA GATAAGGATG ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
110 120 130 140 150
Pho Yen TGAATGTTGG AACATCTGGA ACTCATACTG TGCCACGAAT TAAAGCTATC
....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
160 170 180 190 200
Pho Yen ACGTCCAAAA TGAGAATGCC CAAGAGTAAA GGTGCAACTG TACTAAATTT
Phu Binh ACGTCCAAAA TGAGAATGCC CAAAAGCAAG GGAGCAACCG TGCTAAATTT ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
210 220 230 240 250
Pho Yen GGAACACTTA CTCGAGTATG CTCCACAGCA AATTGACATC TCAAATACTC
Phu Binh AGAACACTTG CTTGAGTACG CTCCACAACA AATTGATATT TCAAATACTC ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
260 270 280 290 300
Pho Yen GAGCAACTCA ATCACAGTTT GATACGTGGT ATGAAGCGGT ACAACCTGCA
Phu Binh GGGCAACTCA ATCACAGTTT GATGCGTGGT ATGAGGCAGT GCGGATGGCA ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
310 320 330 340 350
Pho Yen TACGACATAG GAGAAACTGA AATGCCAACT GTGATGAATG GGCTTATGGT
Phu Binh TACGACATAG GAGAAACTGA GATGCCAACT GTGATGAATG GGCTTATGGT ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
360 370 380 390 400
Pho Yen TTGGTGCATT GAAAATGGAA CCTCGCCAAA CATCAACGGA GTTTGGGTTA
Phu Binh TTGGTGCATT GAAAATGGAA CCTCGCCAAA TGTCAACGGA GTTTGGGTTA ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
410 420 430 440 450
Pho Yen TGATGGATGG AGATGAACAA GTCGAATACC CACTGAAACC AATCGTTGAG
Phu Binh TGATGGATGA GAATGAACAA GTTGAGTACC CGTTGAAACC AATCGTTGAG ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
460 470 480 490 500
Pho Yen AATGCAAAAC CAACACTTAG GCAAATCATG GCACATTTCT CAGATGTTGC
Phu Binh AATGCAAAAC CAACCCTTAG GCAAATCATG GCACATTTCT CAGATGTTGC ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
510 520 530 540 550
Pho Yen AGAAGCGTAT ATAGAAATGC GCAACAAAAA GGAACCATAT ATGCCACGAT
....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
560 570 580 590 600
Pho Yen ATGGTTTAGT TCGTAATCTG CGCGATGGAA GTTTGGCTCG CTATGCTTTT
Phu Binh ATGGTTTAAT TCGAAATCTG CGGGATGTGG GTTTAGCGCG TTATGCCTTT ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
610 620 630 640 650
Pho Yen GACTTTTATG AGGTCACATC ACGAACACCA GTGAGGGCTA GGGAAGCGCA
Phu Binh GACTTTTATG AAGTCACATC ACGAACACCA GTGAGGGCTA GGGAAGCGCA ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
660 670 680 690 700
Pho Yen CATTCAAATG AAGGCCGCAG CATTGAAATC AGCCCAACCT CGACTTTTCG
Phu Binh CATTCAAATG AAGGCCGCAG CATTGAAATC AGCCCAACCT CGACTTTTCG ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
710 720 730 740 750
Pho Yen GGTTGGACGG TGGCATCAGT ACACAAGAGG AGAACACAGA GAGGCACACC
Phu Binh GGTTGGACGG TGGCATCAGT ACACAAGAGG AGAACACAGA GAGGCACACC ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
760 770 780 790 800
Pho Yen ACCGAGGATG TCTCTCCAAG TATGCATACT CTACTTGGAG TCAAGAACAT
Phu Binh ACCGAGGATG TCTCTCCAAG TATGCATACT CTACTTGGAG TCAAGAACAT .
Pho Yen G
Phu Binh G
Hình 3.7. So sánh trình tự nucleotide của gen CP-PVY trên 2 mẫu nghiên cứu
....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
10 20 30 40 50
Pho Yen GNDTIDAGGS TKKDAKQEQG SIQPNLNKEK EKDVNVGTSG THTVPRIKAI
Phu Binh ANDTIDAGES NKKDAKPEQG SIQSNLNKGK DKDVNAGTSG THTVPRIKAI ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
60 70 80 90 100
Pho Yen TSKMRMPKSK GATVLNLEHL LEYAPQQIDI SNTRATQSQF DTWYEAVQPA
Phu Binh TSKMRMPKSK GATVLNLEHL LEYAPQQIDI SNTRATQSQF DAWYEAVRMA ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
Pho Yen YDIGETEMPT VMNGLMVWCI ENGTSPNING VWVMMDGDEQ VEYPLKPIVE
Phu Binh YDIGETEMPT VMNGLMVWCI ENGTSPNVNG VWVMMDENEQ VEYPLKPIVE ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
160 170 180 190 200
Pho Yen NAKPTLRQIM AHFSDVAEAY IEMRNKKEPY MPRYGLVRNL RDGSLARYAF
Phu Binh NAKPTLRQIM AHFSDVAEAY IEMRNKKEPY MPRYGLIRNL RDVGLARYAF ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
210 220 230 240 250
Pho Yen DFYEVTSRTP VRAREAHIQM KAAALKSAQP RLFGLDGGIS TQEENTERHT
Phu Binh DFYEVTSRTP VRAREAHIQM KAAALKSAQP RLFGLDGGIS TQEENTERHT ....|....| ....|..
260
Pho Yen TEDVSPSMHT LLGVKNM
Phu Binh TEDVSPSMHT LLGVKNM
Hình 3.8. So sánh trình tự acid amine của gen CP-PVY trên 2 mẫu nghiên cứu Trình tự gen CP-PVY từ 2 mẫu nghiên cứu có sự sai khác ở 71 vị trí nuleotide. Do đó có thể thấy, mức độ tƣơng đồng giữa 2 trình tự này tƣơng đối thấp (91,1%). So sánh protein suy diễn từ 2 trình tự gen này cho thấy mức độ sai khác là 6,4%. Sự biến động về trình tự nucleotide giữa 2 gen không đồng đều, trong khi có những vùng biến động lớn (nhƣ vùng 2 đến 144) thì có những vùng không biến động một nuleotide nào (nhƣ vùng từ 613 đến 801). Sự sai khác về nucleotide dẫn đến sự sai khác về acid amin, tuy vậy có những vùng có sự sai khác về nuleotide không dẫn tới sự sai khác vế acid amin (nhƣ vùng nucleotide từ 108 đến 273).
3.3.2. So sánh trình tự nuclotide gen CP-PVY trên 2 mẫu nghiên cứu với các trình tự gen CP-PVY trên khoai tây đã đƣợc công bố trong ngân hàng gen
Để thấy đƣợc sự đa dạng di truyền ở mức phân tử của PVY, chúng tôi tiến hành so sánh 2 trình tự gen PVY phân lập từ Phú Bình và Phổ Yên với một số trình tự gen PVY khác trên Ngân hàng gen quốc tế NCBI.
Bảng 3.4. 19 trình tự trong ngân hàng gen đƣợc đƣa ra so sánh
Sử dụng phần mềm DNAstar và BioEdit để so sánh các trình tự gen, lập bảng hệ số tƣơng đồng và biểu đồ hình cây biểu diễn quan hệ di truyền của gen CP-PVY ở 2 mẫu nghiên cứu với 19 trình tự trên.
Mã số Chủng
(biến thể) Nƣớc Mã số
Chủng
(biến thể) Nƣớc
DQ925437 PVYNTN Hà Nội-Việt
Nam U91747 PVY
N
USA
M95491 PVYNTN Hungary X97895 PVYN Switzerland
X79305 PVYNTN Austria Z70237 PVYN Polan
X92078 PVYNTN Lebanon AF118153 PVYO India
AJ890345 PVYNTN Germany AY792597 PVYO China
EF016294 PVYNTN UK D12539 PVYO Japan
AB205416 PVYN Japan U09509 PVYO Canada
AF255660 PVYN Brazil X14136 PVYO Argentina
AM268435 PVYN New Zealand X68222 PVYO USA
Hình 3.9. Biểu đồ hình cây biểu diễn mối quan hệ di truyền của CP-PVY phân lập đƣợc từ Phổ Yên và Phú Bình với 19 trình tự trong ngân hàng gen
Kết quả phân tích cho thấy, trình tự gen CP-PVY của 2 mẫu Phổ Yên, Phú Bình có độ tƣơng đồng khá cao (từ 89,3% đến 99,6%) so với các trình tự CP-PVY của các chủng PVY đã công bố. Nhƣ vậy, có thể đƣa ra kết luận: đã phân lập đƣợc thành công gen CP của PVY chứ không phải của một loại virus nào khác.
Trình tự CP-PVY của mẫu ở Phổ Yên có độ tƣơng đồng từ 89,9% đến 91,6% so với các trình tự thuộc chủng PVYO; từ 96,4% đến 97,4% so với các trình tự thuộc chủng PVYN; từ 98,6% đến 99,6% so với các trình tự thuộc chủng PVYNTN. Nhƣ vậy, trình tự CP-PVY phân lập từ Phổ Yên có độ tƣơng đồng với các trình tự CP của các chủng PVYNTN
cao hơn so với các trình tự thuộc chủng khác. Trong đó, nó có độ tƣơng đồng cao nhất (99,6%) với trình
tự có mã số EF016294. Điều này chứng tỏ PVY phân lập tại Phổ Yên-Thái Nguyên thuộc chủng PVYNTN
.
Trình tự CP-PVY phân lập từ Phú Bình có độ tƣơng đồng từ 94,6% đến 98,5% so với các trình tự thuộc chủng PVYO; 90,8% đến 91,5% so với các trình tự thuộc chủng PVYNTN; 89,3% đến 89,6% so với các trình tự thuộc chủng PVYN. Nhƣ vậy, trình tự CP-PVY của mẫu ở Phú Bình có độ tƣơng đồng với các trình tự thuộc chủng PVYO