NGHIÊN CỨU TÍNH ĐA DẠNG CỦA VIRUS Y TRÊN KHOAI TÂY TRỒNG TẠI THÁI NGUYÊN

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM VŨ THỊ BƯỞI Cơng trình hoàn thành tại: Khoa Sinh -Trường Đại học Sư phạm-Đại học Thái Nguyên Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Chu Hồng Mậu NGHIÊN CỨU TÍNH ĐA DẠNG CỦA VIRUS Y TRÊN KHOAI TÂY TRỒNG TẠI THÁI NGUYÊN Phản biện 1:…………………………………… Phản biện 2:…………………………………… Chuyên ngành: Di truyền học Mã số: 60.42.70 Luận văn bảo vệ trước hội đồng chấm luận văn họp tại: Trường Đại học Sư phạm-Đại học Thái Nguyên Ngày…….tháng………năm 2009 TÓM TẮT LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Có thể tìm hiểu luận văn thư viện Đại học Thái Nguyên Thái Nguyên-2009 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.Lrc-tnu.edu.vn Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.Lrc-tnu.edu.vn LỜI CẢM ƠN ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn tới PGS.TS Chu Hồng Mậu, Phó Giám đốc Đại học Thái Nguyên, tận tình hƣớng dẫn, bảo giúp đỡ tơi hồn thành luận văn Tôi xin gửi lời cảm ơn tới TS Nguyễn Vũ Thanh Thanh (trƣờng VŨ THỊ BƢỞI Đại học Khoa học), thầy cô giáo, cán khoa sau đại học khoa Sinh (trƣờng Đại học Sƣ phạm-Đại học Thái Nguyên) hƣớng dẫn, tạo điều kiện cho tơi suốt q trình học tập nghiên cứu Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn tới TS Chu Hồng Hà, chị Phạm Thị Vân, Phịng Cơng nghệ Tế bào Thực vật-Viện Công nghệ Sinh học cán NGHIÊN CỨU TÍNH ĐA DẠNG CỦA VIRUS Y phịng thí nghiệm Di truyền học, khoa Sinh-Trƣờng Đại học Sƣ phạm; phịng TRÊN KHOAI TÂY TRỒNG TẠI THÁI NGUN thí nghiệm thuộc khoa Sinh-Trƣờng Đại học Khoa học, Đại học Thái Nguyên nhiệt tình hƣớng dẫn, giúp đỡ để tơi hồn thành luận văn Cuối cùng, xin dành cho ngƣời thân yêu gia đình bạn bè lời biết ơn sâu sắc LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Thái Nguyên-2009 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.Lrc-tnu.edu.vn Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên ii http://www.Lrc-tnu.edu.vn LỜI CAM ĐOAN NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT Tơi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng Các số aa Acid amine liệu, kết nghiên cứu luận văn trung thực chƣa có cơng bố DNA DeoxyribonucleicvAcid cơng trình khác RNA Ribonuleic Acid bp Basepair cDNA Complementary DNA CP Coat protein cs Cộng DEPC Diethyl pyrocarbonate NXB Nhà xuất IPTG Isopropylthio-β-D-galactosidase Kb Kilobase LB Luria and Bertani RT-PCR Reverse Transcriptase – Polymerase Chain Reaction PVY Potato virus Y Thái Nguyên, tháng 9, năm 2009 Tác giả Vũ Thị Bƣởi Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên iii http://www.Lrc-tnu.edu.vn PVYN Potato virus Y strain N PVY C Potato virus Y strain C PVY O Potato virus Y strain O PVY NTN Potato virus Y strain (variant) NTN RNase Ribonuclease X-gal 5-brom-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactosidase Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên iv http://www.Lrc-tnu.edu.vn DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH Tên hình Trang Tên bảng Trang Hình 1.1 Các gen kháng (màu xanh) với virus chủ yếu (PVY, PLRV, PVX, PVA) 13 Hình 1.2 Những đốm (mottle) điển hình thuốc N tabacum Bảng 1.1 Một số virus khoai tây thuộc nhóm cv Xanthi gây PVY khoai tây sau 15 ngày tiêm 16 Bảng 1.2 Một số virus khoai tây thuộc nhóm Hình 1.3 Hình dạng PVY 16 Bảng 1.3 Một số virus khoai tây thuộc nhóm Bảng 1.4 Ảnh hƣởng bệnh virus đến củ khoai tây 10 Bảng 2.1 Danh sách mẫu thu điểm nghiên cứu 28 Bảng 2.2 Thành phần phản ứng PCR 32 O N Hình 1.4 Sơ đồ mơ tả hệ gen chủng PVY , PVY biến thể PVYNTN, PVYNW 17 Hình 1.5 Lồi rệp có cánh truyền PVY (Aphis nasturtii) 19 Hình 1.6 Dấu hiệu so sánh PVY Nicotiana tabacum cv Xanthi (sau 15 ngày tiêm) 21 Bảng 2.3 Chu kì nhiệt cho phản ứng PCR 32 Hình 1.7 Triệu chứng nhiễm lần với PVY cánh đồng khoai tây 22 Hình 1.8 Triệu chứng bệnh đốm chết hoại củ khoai tây (PTNRD) Bảng 2.4 Thành phần phản ứng gắn gen vào vector tách dịng 33 23 Hình 1.9 Vị trí gen kháng PVY genome khoai tây 24 Bảng 2.5 Thành phần phản ứng PCR đọc trình tự 35 Hình 2.1 Sơ đồ thí nghiệm tổng quát 29 Bảng 2.6 Chu kì nhiệt cho phản ứng PCR đọc trình tự 36 Hình 3.1 Một số hình ảnh khoai tây vùng nghiên cứu 39 Bảng 3.1 Tỉ lệ có triệu chứng bị bệnh cánh đồng khoai tây Hình 3.2 Kết RT-PCR từ RNA mẫu khoai tây nghi nghiên cứu 39 Bảng 3.2 Trình tự mồi đặc hiệu nhân gen CP 40 45 Bảng 3.3 Trình tự mồi để thực colony-PCR 45 Hình 3.5 Kết colony-PCR số dòng khuẩn lạc với mẫu Phú Bình 46 Bảng 3.4 19 trình tự ngân hàng gen đƣợc sử dụng để đƣa Hình 3.6 Kết điện di tách plasmid mang gen CP 46 so sánh nhiễm bệnh 41 Hình 3.3 Kết điện di DNA thu đƣợc từ kỹ thuật gel agarose 1% 43 Hình 3.4 Kết colony-PCR số dịng khuẩn lạc với mẫu Phổ Yên Hình 3.7 So sánh trình tự nucleotide gen CP-PVY mẫu nghiên cứu Bảng 3.5 Hệ số giống khác trình tự nucleotide 49 Hình 3.8 So sánh trình tự acid amine gen CP-PVY mẫu nghiên cứu 51 50 vùng mã hoá gen CP mẫu nghiên cứu với mẫu ngân hàng gen NCBI 54 Hình 3.9 Biểu đồ hình biểu diễn mối quan hệ di truyền CPPVY phân lập đƣợc từ Phổ Yên Phú Bình với 19 trình tự ngân hàng gen Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên v 52 http://www.Lrc-tnu.edu.vn Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên vi http://www.Lrc-tnu.edu.vn MỤC LỤC 2.3.3 Phƣơng pháp RT-PCR 31 MỞ ĐẦU 2.3.4 Phƣơng pháp tinh sản phẩm PCR 33 Chƣơng TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.3.5 Phƣơng pháp gắn gen vào vector tách dòng 33 1.1 Cây khoai tây 2.3.6 Biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào khả biến E.coli DH5α 34 1.1.1 Nguồn gốc, phân loại giá trị khoai tây 2.3.7 Phƣơng pháp PCR trực tiếp từ khuẩn lạc (colony-PCR) 34 1.1.2 Một số đặc điểm sinh học khoai tây 2.3.8 Tách chiết plasmid 34 1.1.3 Tình hình sản xuất khoai tây giới Việt Nam 2.3.9 Phƣơng pháp xác định trình tự nucleotide 35 1.2 Virus gây bệnh khoai tây 2.3.10 Phƣơng pháp xử lí trình tự gen thu đƣợc 36 1.2.1 Các loại virus khoai tây Chƣơng KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 38 1.2.2 Đặc điểm bệnh virus khoai tây 3.1 Kết khảo sát tỉ lệ nhiễm PVY 38 1.3 Virus Y khoai tây 14 3.2 Kết nhân gen, tách dòng cDNA 40 1.3.1 Phân loại 14 3.2.1 Kết nhân gen kỹ thuật RT-PCR 40 1.3.2 Cây chủ 14 3.2.2 Kết tinh sản phẩm PCR 42 1.3.3 Hình dạng cấu trúc phân tử 16 3.2.3 Kết biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào khả biến E.coli DH5α 43 1.3.4 Quan hệ họ hàng với potyvirus khác 17 3.2.4 Kết chọn lọc plasmid tái tổ hợp colony-PCR 44 1.3.5 Lan truyền PVY 18 3.2.5 Kết tách plasmid từ khuẩn lạc mẫu nghiên cứu 46 1.3.6 Một số đặc điểm PVY khoai tây 20 3.3 Kết so sánh trình tự gen CP-PVY phân lập từ mẫu nghiên 1.4 Tình hình nghiên cứu PVY giới Việt Nam 24 cứu với số trình tự ngân hàng gen 1.4.1 Tình hình nghiên cứu PVY giới 24 3.3.1 So sánh trình tự nucleotide acid amine gen CP-PVY 1.4.2 Tình hình nghiên cứu PVY Việt Nam 27 mẫu nghiên cứu Chƣơng VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 28 2.1 Vật liệu nghiên cứu 28 2.2 Hóa chất, thiết bị, địa điểm nghiên cứu 28 2.2.1 Hóa chất 28 2.2.2 Thiết bị 28 2.2.3 Địa điểm nghiên cứu 29 2.3 Phƣơng pháp nghiên cứu 29 2.3.1 Phƣơng pháp thống kê 29 2.3.2 Phƣơng pháp tách chiết RNA tổng số 30 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên vii http://www.Lrc-tnu.edu.vn 47 47 3.3.2 So sánh trình tự nucleotide gen CP-PVY mẫu nghiên cứu với trình tự gen CP-PVY khoai tây đƣợc công bố ngân hàng gen 50 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 55 CƠNG TRÌNH ĐÃ CƠNG BỐ 56 TÀI LIỆU THAM KHẢO 57 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên viii http://www.Lrc-tnu.edu.vn Gần đây, với việc áp dụng kĩ thuật tiên tiến sinh học phân tử MỞ ĐẦU vào nghiên cứu chọn tạo giống trồng, đặc biệt sử dụng vật liệu di ĐẶT VẤN ĐỀ Khoai tây (Solanum tuberosum L.) lƣơng thực chủ lực đứng đầu loại lấy củ giới đứng thứ số lƣơng thực nói chung (chỉ sau lúa mì, gạo, ngơ, đậu tƣơng) Củ khoai tây có giá trị dinh dƣỡng cao, đƣợc chế biến thành hàng trăm ăn đặc sắc, ngon miệng có lợi cho sức khoẻ ngƣời Củ khoai tây nguyên liệu quan trọng ngành công nghiệp, chế biến thức ăn cho gia súc Ngồi ra, khoai tây cịn dƣợc phẩm dùng để chữa trị nhiều bệnh nhƣ khó tiêu, đau bụng, viêm loét dày, say nắng…Với lợi ích to lớn đó, khoai tây đƣợc trồng 130 quốc gia nguồn thu lớn cho hàng triệu nông dân [5] Ở khoai tây, bệnh virus trở thành hiểm họa Ngƣời ta thấy có 38 loại virus khoai tây đƣợc phát mô tả, phổ biến là: PVY truyền từ virus gây bệnh để tạo trồng chuyển gen kháng virus thu đƣợc kết đáng khích lệ nhƣ khoai tây chuyển gen Nib kháng PVY Tạo khoai tây chuyển gen kháng virus đƣợc coi biện pháp hữu hiệu để ngăn chặn hạn chế tác hại virus gây Nhƣng vấn đề đặt phổ kháng bệnh chuyển gen phụ thuộc vào độ tƣơng đồng mặt di truyền chủng virus có gen đƣợc sử dụng để tạo chuyển gen dịng virus gây bệnh tự nhiên Vì khảo sát tính đa dạng di truyền gen mã hố cho protein vỏ virus (coat protein- CP) có ý nghĩa quan trọng việc nghiên cứu tạo chuyển gen kháng virus Xuất phát từ lí trên, lựa chọn đề tài cho luận văn thạc sĩ là: “Nghiên cứu tính đa dạng virus Y khoai tây trồng Thái Nguyên” MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU (potato virus Y), PLRV (potato leafroll virus), PVX (potato virus X), PVA Xác định đa dạng cấu trúc gen mã hoá protein vỏ (CP- coat (potato virus A), PVS (potato virus S)…Trong đó, PVY gần đƣợc xem protein) PVY phân lập từ mẫu khoai tây thu số địa phƣơng virus gây bệnh nghiêm trọng (Kerlan, 2008) [40] Chúng làm giảm kích thuộc tỉnh Thái Nguyên thƣớc, số lƣợng nhƣ chất lƣợng củ khoai tây, gây thiệt hại kinh tế tới NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 80% chí (Kerlan cs, 2008) [41] 3.1 Khảo sát, thống kê xác định tỉ lệ nhiễm PVY khoai tây Thái Mặc dù vậy, nhận thức nơng dân nhƣ nghiên cứu Bình, Thái Nguyên, Hƣng Yên, Bắc Giang làm sở cho việc thu mẫu xác bệnh virus khoai tây nƣớc ta hạn chế so với nƣớc Bắc Mĩ định có mặt virus PVY Châu Âu Do đó, việc chẩn đốn nhanh, xác nhằm đƣa biện 3.2 Tách chiết RNA virus từ mẫu khoai tây thu thập đƣợc pháp phịng trừ bệnh thích hợp để hạn chế tối đa thiệt hại bệnh virus 3.3 Nhân gen CP, tách dịng đọc trình tự gen CP PVY mẫu gây cần thiết Hơn nữa, biện pháp truyền thống sử dụng để khoai tây ngăn cản lan truyền PVY mang tính chất phịng trừ khơng thể 3.4 So sánh trình gen CP PVY phân lập đƣợc với số trình tự cơng chống lại đƣợc bệnh này, lại tốn nhiều thời gian công sức Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.Lrc-tnu.edu.vn bố ngân hàng gen NCBI Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.Lrc-tnu.edu.vn Khoai tây đƣợc chế biến thành hàng trăm ăn ngon phục vụ nhu cầu Chƣơng ẩm thực ngƣời Không vậy, khoai tây cịn đƣợc coi cơng cụ làm TỔNG QUAN TÀI LIỆU đẹp hiệu dễ sử dụng Ngoài ra, củ khoai tây nguyên 1.1 CÂY KHOAI TÂY liệu quan trọng ngành công nghiệp, chế biến thức ăn chăn nuôi 1.1.1 Nguồn gốc, phân loại giá trị khoai tây Cây khoai tây có tên khoa học Solanum tuberosum L., thuộc họ cà (Solanaceae) Trong công nghiệp sản xuất bánh kẹo, khoai tây đƣợc chế biến thành nhiều sản phẩm thơm ngon, có giá trị dinh dƣỡng cao Khoai tây đƣợc sử dụng công nghiệp sản xuất cồn, cao su nhân tạo (Hồ Hữu An cs, 2005) [1] Khoai tây có nguồn gốc từ vùng núi Andes Bolivia Peru Vào kỉ XVI, ngƣời Tây Ban Nha xâm chiếm Peru họ đem khoai tây nƣớc trồng Đến cuối kỉ XVI, khoai tây đƣợc trồng rộng rãi nhiều nƣớc Châu Âu (Vũ Hƣớng Văn, 2007) [12], (Macdec, 1963) [45] Khoai tây đƣợc du nhập vào nƣớc ta ngƣời Pháp giám đốc vƣờn bách thảo Hà Nội đem vào trồng thử, nhanh chóng đƣợc trồng nhiều địa phƣơng Do ngƣời Pháp ngƣời đem nƣớc ta phổ biến cách trồng nên nhân dân ta gọi “khoai tây” (Vũ Hƣớng Văn, 2007) [12], (Macdec, 1963) [45] Đặc biệt, khoai tây dƣợc phẩm Củ khoai tây có vị ngọt, tính bình, có tác dụng bổ khí, kiện tỳ, tiêu viêm Nó dùng để chữa chứng khó tiêu, đau bụng, viêm loét dày, viêm tuyến nƣớc bọt, say nắng, sốt, bỏng nhẹ, eczema, vết thƣơng…Hoa khoai tây chữa bệnh tăng huyết áp nguyên liệu chiết rutin để chữa bệnh Quả mầm củ khoai tây đƣợc dùng làm thuốc dễ gây độc Trong công nghiệp dƣợc phẩm, chúng đƣợc chiết lấy solanin để làm thuốc giảm đau, chữa đau bụng, đau nhức xƣơng khớp, chữa dị ứng, chống hen, viêm phế quản, động kinh (Hƣơng Tú, 2008) [11] Trong củ khoai tây có nhiều chất chống oxi hố, có khả ngăn Khoai tây vừa lƣơng thực vừa thực phẩm có giá trị dinh dƣỡng cao Củ khoai tây chứa trung bình 19% hydratcacbon (trong 15% tinh bột; 2,2% chất xơ); 0,1% chất béo; 2-3% protein 79% nƣớc Ngồi ra, khoai tây cịn chứa nhiều loại vitamin chất khống Ngƣời ta tính khoảng 200g khoai tây nƣớng vỏ cung cấp 844mg kali; 28% phần sắt hàng ngày; 43% phần vitamin C; 35% phần vitamin B6 nhiều chất khác nhƣ niacin, thiamin, folat… (Vũ Hƣớng Văn, 2007) [12] Còn theo Bill Dean (1992), sử dụng 100g khoai tây đảm bảo 8% nhu cầu protein; 3% nhu cầu lƣợng; 10% nhu cầu sắt; 19% nhu cầu vitamin B1; 20-50% nhu cầu vitamin C ngƣời ngày (Bill cs, ngừa q trình lão hố, hạn chế phát triển ung thƣ số bệnh khác Các nhà nghiên cứu trƣờng Đại học Y Harvard-Mỹ phát rằng: ngƣời thƣờng xuyên ăn khoai tây có khả giảm ung thƣ tuyến tiền liệt (Vũ Hƣớng Văn, 2007) [12] Những nghiên cứu gần cho thấy củ khoai tây giàu sterol, giúp tăng cƣờng khả miễn dịch thể Có nghiên cứu cho thấy, khoai tây có tác dụng làm chậm cơng HIV/ AIDS Theo dõi nhóm bệnh nhân HIV thấy ngƣời ăn khoai tây có khả sống thêm đƣợc năm so với bệnh nhân không ăn (Vũ Hƣớng Văn, 2007) [12] 1992) [18] Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.Lrc-tnu.edu.vn Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.Lrc-tnu.edu.vn Trong năm gần đây, nƣớc ta diện tích trồng khoai tây ngày 1.1.2 Một số đặc điểm sinh học khoai tây Cây khoai tây thuộc loại thân thảo, bao gồm phận thân, lá, rễ, tăng, nhƣng tốc độ tăng không cao Năng suất khoai tây nƣớc ta hoa, quả, hạt Thân khoai tây có nhiều lơng, kép lơng chim khơng đối 61,3% suất bình quân chung giới, 62,9% suất khoai xứng Hoa cân đối, cánh hoa có gốc dính liền Nhị đực kết dính thành tây Châu Âu (FAO, 2005) [30] ống chóp cụt, nhị dễ rụng Cây khoai tây chủ yếu tự thụ, Nhƣ vậy, khoai tây nƣớc ta phát triển nhƣng tốc độ mở số trƣờng hợp giao phấn Cánh hoa có màu: trắng, tím- đỏ, tím xanh, rộng diện tích tăng suất năm khơng cao, khơng ổn đinh Có thể xanh thẫm Quả có hai ơ, hạt nhỏ có mầm uốn cong Khoai tây thƣờng đƣa nguyên nhân quan trọng dẫn đến tƣợng là: đƣợc nhân giống củ Củ phần phình to phần thân nằm dƣới đất chứa nhiều chất dinh dƣỡng (Hồ Hữu An cs, 2005) [1], (Đƣờng Hồng Dật, 2005) [3], (Trƣơng Quang Vinh, 2007) [14] Ở nƣớc ta, khoai tây địa phƣơng trồng phổ biến phía Bắc giống Thƣờng Tín, phía Nam giống Đà Lạt Các giống nhập nội Trung + Thiếu giống có chất lƣợng tốt, phù hợp với điều kiện khí hậu + Chƣa có biện pháp phịng trừ bệnh đặc biệt bệnh virus có hiệu (Trƣơng Quang Vinh, 2007) [14] 1.2 VIRUS GÂY BỆNH Ở KHOAI TÂY Quốc, Đức, Pháp, Hà Lan…hiện đƣợc trồng nhiều nơi (Nguyễn Mạnh Hiện tƣợng thoái hoá khoai tây, virus gây ra, đƣợc mô tả phát Chinh, 2005) [2] Ở đồng sông Hồng, khoai tây chủ yếu trồng vụ đông từ kỉ XVIII, nhƣng tác nhân gây phải đến tận kỉ XX vào tháng 10, 11, thu hoạch tháng 1, năm sau Ở tỉnh miền núi phía Bắc đƣợc xác định Virus (potato leafroll virus viết tắt PLRV) Đà Lạt trồng muộn chút khoảng tháng 1, để tránh sƣơng giá vào tháng virus đƣợc phát vào năm 1916 Quanfer, Vanderlek O 11, 12 (Nguyễn Mạnh Chinh, 2005) [2] Botfes Những virus chủ yếu gây khảm khoai tây (potato virus M, potato 1.1.3 Tình hình sản xuất khoai tây giới Việt Nam virus X, potato virus Y, potato virus A) đƣợc xác định năm 1920 Khoai tây đƣợc trồng phổ biến 130 nƣớc giới Do điều kiện 1930 Những virus quan trọng khác đƣợc phám phá năm sinh thái, mức độ thâm canh trình độ sản xuất khác nên suất 1950 (tobacco rattle virus, potato virus S) năm 1960 (potato khoai tây chênh lệch lớn, từ tấn/ha đến 65 tấn/ha Tính đến năn 2005, mop-top virus) (Vũ Triệu Mân, 1986) [6], (Kerlan, 2008) [40] Trong thập giới trồng đƣợc 18,57 triệu khoai tây, sản lƣợng đạt 320,15 triệu kỉ gần đây, ngƣời ta phát thấy số lƣợng virus ngày gia tăng (bằng 60-70% tổng sản lƣợng lúa hay mì) châu Mỹ La Tinh, đặc biệt châu thổ Andean, nơi đƣợc xem khởi Diện tích khoai tây giới năm gần có xu hƣớng nguồn khoai tây Nhiều virus phổ biến chủ khác, đơi lại giảm nhẹ Năm 2005, diện tích khoai tây giảm 0,37 triệu so với năm 2003; nhiễm vào khoai tây Một số chúng, ví dụ nhƣ virus đốm héo cà chua (tomato giảm 1,37% triệu so với năm 2000 Tuy vậy, suất khoai tây trung bình spotted wilt virus), gây bệnh cho khoai tây trở nên nghiêm trọng lại có xu hƣớng tăng Năm 2005, suất khoai tây tăng 0,79 tấn/ha so với tƣơng lai Nhiều tác giả lƣu ý rằng, virus truyền qua năm 2000 tăng 1,32 tấn/ha so với năm 2001 (FAO, 2005) [30] đƣờng tiếp xúc, nhƣ pepino mosaic virus, chƣa đƣợc phát Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.Lrc-tnu.edu.vn Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.Lrc-tnu.edu.vn khoai tây, có khả nhiễm vào nhiều khoai tây quan Bảng 1.1 Một số virus khoai tây thuộc nhóm trọng trở thành hiểm họa tƣơng lai Những ngƣời trồng khoai tây nhiều quốc gia thừa nhận khoai tây giống ảnh hƣởng lớn tới hiệu sản xuất Chƣơng trình sản xuất khoai tây giống phát triển năm 1940 1950 Khoai tây giống đƣợc chứng nhận với mức độ nhiễm virus thấp trở thành nhân tố chiến chống virus Nhân giống kháng mạnh với virus cuộn (potato leafroll virus) đƣợc sử dụng từ năm 1925 khả kháng virus nhiều dại họ cà đƣợc khai thác Ba kiểu kháng đƣợc Năm đƣợc nói đến Thiệt hại kinh tế Phân bố Potyvirus 1931 Rất cao Rộng khắp Potato leafroll virus (PLRV) Polerovirus 1916 Rất cao Rộng khắp Potato virus X (PVX) Potexvirus 1931 Cao Rộng khắp Potato virus A (PVA) Potyvirus 1932 Vừa phải Rộng khắp Potato virus S (PVS) Carlavirus 1952 Vừa phải Rộng khắp Potato virus M (PVM) Carlavirus 1923 Vừa phải Rộng khắp Loài Chi Potato virus Y (PVY) mô tả từ năm 1950 thông tin di truyền yếu tố quy định khả Tobacco rattle Tobravirus 1946 Cao Rộng khắp kháng đƣợc xác định từ năm 1970 Hiện nay, nhiều gen chống chịu Potato mop-top virus (PMTV) Pomovirus 1966 Khá cao Chủ yếu khí hậu lạnh đƣợc xác định vị trí genome khoai tây, tạo điều kiện cho công tác nhân giống kháng virus dựa thị phân tử Hàng loạt biện pháp mạnh đƣợc xác lập để tránh xâm nhập virus kiểm dịch (Kerlan, + Nhóm 2: Gồm virus xuất Châu Mỹ La Tinh, hay không gây thiệt hại kinh tế Bảng 1.2 Một số virus khoai tây thuộc nhóm 2008) [40] Sử dụng vật liệu di truyền từ virus gây bệnh để tạo chuyển gen kháng virus đƣợc xem biện pháp hữu hiệu thu đƣợc kết khả quan 1.2.1 Các loại virus khoai tây Ở khoai tây có 38 virus đƣợc mô tả (Kerlan, 2008) [40] Dựa mức độ thiệt hại phạm vi phân bố, virus khoai tây đƣợc phân chia thành nhóm: + Nhóm 1: Gồm virus gây thiệt hại đáng kể, phân bố tƣơng đối http://www.Lrc-tnu.edu.vn Phân bố Chi Andean potato latent virus (APLV) Tymovirus 1966 Rất thấp Bolivia, Colombia, Ecuador, Peru Andean potato mottle virus (APMoV) Comovirus 1977 Chƣa biết Chili, Ecuador, Peru, Brazil Arracacha virus Boca strain (AVB-O) Nepovirus 1981 Chƣa biết Bolivia, Peru 1985 Cao Bắc Brazil Begomovirus Potato deforming mosaic virus (PDMV) rộng giới Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên Năm đầu Thiệt hại tiên đƣợc kinh nói đến tế Lồi Potato rough dwart virus (PRDV) Carlavirus 1995 Rất thấp Argentina, Uruguay Potato virus T (PVT) Trichovirus 1977 Chƣa biết Bolivia, Peru Potato virus U (PVU) Nepovirus 1983 Khơng có Peru Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.Lrc-tnu.edu.vn + Nhóm 3: Gồm virus xuất vùng khác cánh đồng, nhƣng thực kho bảo quản bệnh gây thiệt giới, mức độ thiệt hại không đáng kể hay cục hại Một số điều tra cho thấy, củ khoai tây thuộc giống Ackersegen bị nhiễm Bảng 1.3 Một số virus khoai tây thuộc nhóm Lồi Chi Alfalfa mosaic virus (AMV) Alfamovirus Eggplant mottled Dwarf virus (EMDV) Thiệt hại bệnh virus khoai tây gây đƣợc ý nhiều virus Y, X, S, M virus (PLRV) đƣa vào bảo quản tăng Năm đƣợc nói đến Thiệt hại kinh tế Phân bố 1940 Chỉ cục Hiếm thấy lƣợng củ thối giảm khả nảy mầm (Vũ Triệu Mân, 1986) [6] Bảng 1.4 Ảnh hƣởng bệnh virus đến củ khoai tây (tính bình qn 20 khóm loại hình bệnh) (Theo Vũ Triệu Mân, 1973 -1977) Nucleorhabdovirus Potato aucuba Mosaic Virus (PAMV) Potexvirus Potato latent virus (PotLV) Carlavirus Potato virus V (PVV) Potyvirus 1987 Rất thấp Iran 1961 Thấp Hiếm thấy 1996 Chƣa biết Bắc Mỹ 1986 Thấp Bolivia, Peru, Bắc châu Âu Chỉ tiêu theo dõi Loại hình khóm bệnh Khóm khoẻ Xoăn lùn Cuốn Khảm Trọng lƣợng củ (g/khóm) 30,0 225,0 240,0 295,0 Tỉ lệ % củ lớn (%) 0,0 9,2 7,7 10,4 Tỉ lệ % củ trung bình(%) 38,0 42,4 56,3 55,8 Tỉ lệ củ nhỏ(%) 62,0 48,4 36,0 30,8 1.2.2 Đặc điểm bệnh virus khoai tây Tác hại bệnh virus phụ thuộc vào nhiều yếu tố: điều kiện sống (khí 1.2.2.1 Triệu chứng thiệt hại Virus gây triệu chứng chủ yếu là: khảm, đốm hay đổi màu, hậu, thổ nhƣỡng, biện pháp chăm sóc), trồng có khả chống chịu khác bị quăn cuộn hay méo mó, rụng lá, còi cọc hay biến dạng (Vũ loại, chủng virus gây bệnh Có vùng Tây Âu, virus Triệu Mân, 2007) [7] Các kiểu chết hoại khác xuất lá, làm giảm tới 90% sản lƣợng dự thu bệnh nặng Trong đó, thiệt hại thân củ ngồi Kích thƣớc, số lƣợng, diện mạo chất lƣợng củ bị ảnh hƣởng (Kerlan, 2008) [40] Theo Vũ Triệu Mân, Việt Nam, bệnh virus ảnh hƣởng lớn tới suất củ khoai tây Trọng lƣợng củ khóm giảm, tỉ lệ củ lớn thấp khơng có, tỉ lệ củ nhỏ tăng cao Nhiều củ không sử dụng để làm lƣơng thực hay thực phẩm đƣợc mà phải dùng làm thức ăn gia súc hay loại bỏ Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.Lrc-tnu.edu.vn Đông Âu phần lớn lại virus Y gây Ở Việt Nam, virus gây hại nhẹ, nhƣng virus Y lại gây hại nặng Nhìn chung, nơi có khí hậu ẩm lạnh suất khoai tây giảm so với nơi có khí hậu nóng khơ bị bệnh virus Giống khoai tây kháng virus gồm nhiều loại: kháng cao, kháng trung bình, chịu bệnh Virus có giống chịu bệnh nhƣng khơng có triệu chứng, chúng nguồn lây nhiễm cho khác Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 10 http://www.Lrc-tnu.edu.vn - Loại dịch nổi, rửa tủa lần cồn 700 Bảng 2.6 Chu kì nhiệt cho phản ứng PCR đọc trình tự - Làm khô plasmid máy Speed Vac Bƣớc Phản ứng Nhiệt độ (0C) Thời gian Chu kì Biến tính 96 phút - Bổ sung 0,1µl Rnase, ủ 37 C Biến tính 96 10 giây - Tinh plasmid để đọc trình tự Gắn mồi 55 giây Kéo dài chuỗi 60 phút Hoàn tất kéo dài 72 phút Kết thúc phản ứng 30 phút - Hoà tan plasmid 40µl nƣớc cất khử ion, khử trùng Quy trình tinh plasmid: - Bổ sung PB theo tỉ lệ Vmẫu:VPB=1:5, mix nhẹ - Cho hỗn hợp dung dịch vào cột tinh sạch, ly tâm 13000 vòng/phút 25 phút - Bổ sung 0,75ml dung dịch NW, ly tâm 13000 vòng/phút phút - Loại dịch, ly tâm bổ sung phút để loại NW Cho cột tinh Sản phẩm PCR đƣợc tinh cách bổ sung 5µl EDTA 125mM, 60µl cồn 100% ủ nhiệt độ phòng 15 phút Tiếp ly tâm 12000 vịng/phút 15 phút để tủa đoạn DNA, sau loại bỏ cồn Bổ sung vào ống eppendorf 1,5ml - Bổ sung 30µl H2O deion khử trùng, để nhiệt độ phòng 1-2 phút, ly DNA, bổ sung 10µl Hi-DiTM Formamide biến tính 950C phút tâm 13000 vịng/phút phút Các mẫu đƣợc tra vào giếng khay đựng mẫu, sau điện di ống 2.3.9 Phƣơng pháp xác định trình tự nucleotide Trình tự gen CP đƣợc xác định máy đọc tự động ABI PRISM ® 3100 Avant Genetic Analyzer theo kit BigDye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing Thành phần chu trình nhiệt phản ứng PCR đọc trình tự ® máy luân nhiệt GeneAmp PCR System 9700 nhƣ sau: STT Thành phần Thể tích (µl) Dung dịch đệm (5X) Mồi 1,275 DNA mẫu (~200ng) 7,725 BigDye Tổng 15 35 mao quản với polymer PoP-4TM hãng ABI, Mỹ Kết đƣợc xử lí phần mềm DNAstar 2.3.10 Phƣơng pháp xử lí trình tự gen thu đƣợc Hiện nay, có nhiều phần mềm chuyên dụng xử lí trình tự gen nhƣ PC Bảng 2.5 Thành phần phản ứng PCR đọc trình tự Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 60µl cồn 70% li tâm 10000 vòng/phút 10 phút Làm khô kết tủa http://www.Lrc-tnu.edu.vn GENE, Clustal, DNAstar, BioEdit, Chromas… Trong phần mềm kể trên, DNAstar hệ thống phần mềm tiện dụng nhất, đƣợc tạo nhóm nhà khoa học Mỹ Phần mềm bao gồm nhiều chƣơng trình với chức khác dùng để phân tích xử lí số liệu sinh học phân tử Việc so sánh xử lí trình tự gen CP đƣợc tiến hành theo trình tự sau: - So sánh trình tự gen đƣợc đọc từ hai đầu xi ngƣợc để xác định trình tự đầy đủ gen Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 36 http://www.Lrc-tnu.edu.vn - So sánh trình tự đầy đủ gen với trình tự gen BLAST Chƣơng NCBI để xác định gen đƣợc tách dòng PVY KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU - Giải mã trình tự nucleotide sang trình tự acid amine theo khung đọc mở, xác định vị trí mở đầu kết thúc dịch mã - Lập phân loại bảng hệ số đồng dạng so sánh mức độ tƣơng đồng di truyền trình tự nucleotide dịng gen CP thu đƣợc với với trình tự gen CP PVY từ nhiều khu vực khác giới đƣợc công bố ngân hàng liệu gen (Gen Bank) 3.1 KẾT QUẢ KHẢO SÁT TỈ LỆ NHIỄM PVY Ở MỘT SỐ ĐỊA PHƢƠNG Chúng tiến hành điều tra vùng trồng khoai tây số tỉnh miền bắc Việt Nam tiến hành khảo sát địa điểm sau: + Cánh đồng khoai tây thuộc thôn Hành Lạc, thị trấn Nhƣ Quỳnh, huyện Văn Lâm, tỉnh Hƣng Yên + Cánh đồng khoai tây thuộc làng Khả Lý Hạ, xã Quảng Minh, huyện Việt Yên, tỉnh Bắc Giang + Cánh đồng khoai tây thôn Thùa Lâm, xã Tiên Phong, huyện Phổ Yên, tỉnh Thái Nguyên + Cánh đồng khoai tây thuộc huyện Phú Bình, tỉnh Thái Nguyên + Cánh đồng khoai tây thuộc xã Thụy Ninh, huyện Thái Thụy, tỉnh Thái Bình Trong đó, cánh đồng Phổ Yên-Thái Nguyên trồng khoai tây Hà Lan cánh đồng khác trồng khoai tây Trung Quốc Thời điểm khảo sát khoai tây trồng đƣợc tháng rƣỡi đến tháng Ở vùng, tiến hành phát xác định tỉ lệ khoai tây có triệu chứng nhiễm PVY Việc chẩn đốn bị bệnh đƣợc tiến hành theo phƣơng pháp quan sát mắt thƣờng Trên cánh đồng, lấy lơ ngẫu nhiên, lơ 100 khóm Xác định số khóm có triệu chứng nhiễm PVY lơ Tỉ lệ khoai tây có triệu chứng nhiễm PVY cánh đồng đƣợc tính giá trị trung bình tỉ lệ nhiễm lô Kết thu đƣợc nhƣ sau: Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 37 http://www.Lrc-tnu.edu.vn Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 38 http://www.Lrc-tnu.edu.vn Tuy vậy, phƣơng pháp chuẩn đoán mắt thƣờng dễ có nhầm lẫn Bảng 3.1 Tỉ lệ có triệu chứng bị bệnh cánh đồng khoai tây nghiên cứu với bệnh khác nhƣ bệnh tuyến trùng, bệnh sinh lí dinh dƣỡng Cánh đồng khoai tây Ký hiệu Triệu chứng nhiễm PVY (%) Phổ Yên-Thái Nguyên Phổ Yên 14,23 ± 2,56 hay điều kiện khí hậu gây Ngoài ra, dễ nhầm lẫn virus với virus Phú Bình-Thái Nguyên Phú Bình 28,07 ± 3,03 khác có xâm nhiễm hỗn hợp virus Do đó, Thái Thụy-Thái Bình Thái Bình 20,03 ± 3,13 chuẩn đốn xác khoai tây nhiễm PVY cần kết hợp với phƣơng pháp Văn Lâm-Hƣng Yên Hƣng Yên 22,56 ± 2,85 khác nhƣ sử dụng kính hiển vi điện tử, phƣơng pháp huyết hay sinh học Việt Yên-Bắc Giang Bắc Giang 31,71 ± 2,15 phân tử Nhƣ vậy, tỷ lệ khoai tây có triệu chứng nhiễm PVY dao động từ Trong nghiên cứu này, để xác định mẫu khoai tây có triệu chứng 14,23±2,56% đến 31,71±2,15% Kết phù hợp với kết điều tra nhiễm PVY thu đƣợc từ cánh đồng khoai tây có xác bị nhiễm Trƣơng Văn Hộ cs (1990) [4] Trong đó, cánh đồng Bắc Giang có tỷ lệ PVY hay không, tiến hành phân lập xác định trình tự gen CP khoai tây mang triệu chứng nhiễm PVY cao (31,71±2,85%) Phổ PVY Yên-Thái Nguyên có tỷ lệ khoai tây mang triệu chứng nhiễm PVY thấp 3.2 KẾT QUẢ NHÂN GEN, TÁCH DÒNG cDNA (14,23±2,56%) 3.2.1 Kết nhân gen kỹ thuật RT-PCR Chúng thu thập số mẫu khoai tây có triệu chứng nhiễm PVY từ cánh đồng khoai tây: Phổ Yên, Phú Bình, Thái Bình, Hƣng n, Bắc Giang Sau đó, tiến hành phân lập gen CP PVY từ mẫu khoai tây Trƣớc tiên, tiến hành tách chiết RNA tổng số từ mẫu có triệu chứng nhiễm bệnh (theo quan sát mắt thƣờng) tổng hợp cDNA Cánh đồng khoai tây khảo sát Bắc Giang Mẫu có triệu chứng nhiễm bệnh Bắc Giang từ RNA tổng số Gen CP đƣợc nhân lên phƣơng pháp PCR với cặp mồi đặc hiệu đƣợc cung cấp Phịng Cơng nghệ Tế bào Thực vật - Viện Cơng nghệ Sinh học: Bảng 3.2 Trình tự mồi đặc hiệu nhân gen CP Cánh đồng khoai tây khảo sát Hưng Yên Mẫu có triệu chứng bị bệnh Hưng Yên Hình 3.1 Một số hình ảnh khoai tây vùng nghiên cứu Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 39 http://www.Lrc-tnu.edu.vn Mồi Trình tự PVYCPF1 5‟ GCYTTCACTGAAATGATGGT 3‟ PVYCPR1 5‟GTCTCCTGATTGAAGTTTACA3‟ Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 40 http://www.Lrc-tnu.edu.vn Để kết nhân gen đƣợc xác, chúng tơi lặp lại thí nghiệm lần kế mồi nhân gen Vì vậy, chúng tơi kết luận nhân thành cơng đoạn gen có có đối chứng dƣơng (+), đối chứng âm (-) làm thí nghiệm Sản phẩm PCR kích thƣớc tƣơng ứng với gen CP PVY khoai tây từ mẫu Phổ Yên đƣợc điện di kiểm tra gel agarose 1% Kết đƣợc thể hình 3.2 Phú Bình Có nhiều yếu tố ảnh hƣởng tới chất lƣợng phản ứng RT- Từ kết RT-PCR kết luận: PCR nhƣ: Lƣợng RNA quá nhiều, nồng độ mồi cao - Các mẫu đƣợc nghi có triệu chứng bị bệnh PVY thu thập từ Hƣng thấp, nhiệt độ gắn mồi chƣa phù hợp…Vì trình tiến phản ứng Yên, Bắc Giang, Thái Bình khơng chứa PVY Điều thu thập cần điều chỉnh hàm lƣợng thành phần phản ứng (lƣợng mẫu, nồng độ mồi, mẫu quan sát mắt thƣờng nên nhầm lẫn với bệnh hay loại virus khác 2+ Mg …), nhiệt độ gắn mồi, thời gian bƣớc chu kì nhiệt…để Nhƣ vậy, phƣơng pháp quan sát mắt thƣờng để xác định bệnh PVY phản ứng RT-PCR xảy đặc hiệu gây khoai tây khơng xác - Đã phân lập thành cơng đoạn gen có kích thƣớc tƣơng ứng với gen CP PVY từ mẫu khoai tây Phổ Yên-Thái Nguyên Phú Bình-Thái Nguyên Để đƣa kết luận xác đoạn gen nhân đƣợc gen CP từ PVY cần tiến hành tách dịng đọc trình tự đoạn gen 3.2.2 Tinh sản phẩm RT-PCR Q trình tách dịng đƣợc thực cách gắn sản phẩm PCR vào vector tách dịng Tuy nhiên, sản phẩm PCR ngồi đoạn gen mong muốn nhiều sản phẩm phụ, nucleotide dƣ thừa sau phản ứng, mồi, enzyme, đệm…Vì để phản ứng ghép nối đạt đƣợc hiệu cao cần Hình 3.2 Kết RT-PCR từ RNA mẫu khoai tây nghi nhiễm bệnh thiết phải có q trình tinh sản phẩm PCR để loại bỏ thành phần M: Marker DNA 1Kb không mong muốn Quy trình tinh sản phẩm PCR (thơi gel) đƣợc thực 1: Hƣng Yên; 2: Bắc Giang; 3: Thái Bình1; theo hƣớng dẫn kit QIAquick Gel Extraction Khi nâng nhiệt độ 500C agarose tan chảy, DNA đƣợc hồ vào dung 4: Thái Bình2; 5: Phổ Yên; 6: Phú Bình (+) : Đối chứng dƣơng - plasmid pTZ57R/T/CP-PVY dịch QG Sau cho dung dịch vào cột tinh QIAquick spin, DNA đƣợc (-) : Đối chứng âm-thành phần PCR khơng có RNA giữ lại phân tử có lực cao với DNA cố định màng lọc cột Hình 3.2 cho thấy, mẫu khoai tây Phổ Yên-Thái Nguyên, Phú tinh sạch, dịch đệm QG agarose bị loại nhờ li tâm Để loại bỏ hết Bình-Thái Nguyên plasmid mang gen PVY có đoạn gen đƣợc nhân lên agarose bám màng lọc, cần thiết phải bổ sung QG vào cột lần thứ với kích thƣớc khoảng 1200bp Kích thƣớc phù hợp với tính toán thiết DNA đƣợc làm đệm rửa PE chứa 80% ethanol đƣợc hồ tan Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 41 http://www.Lrc-tnu.edu.vn Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 42 http://www.Lrc-tnu.edu.vn dịch đệm EB nƣớc deion khử trùng Bằng phƣơng pháp giữ lại với hiệu suất 85% trở lên Thành công thí nghiệm phụ thuộc vào nhiều yếu tố, nhƣng có yếu tố quan trọng nhất: + Sản phẩm PCR phải đặc hiệu, chất lƣợng tốt + Tế bào khả biến phải đƣợc chuẩn bị tốt đạt đƣợc hiệu suất biến nạp cao Chúng thu đƣợc lƣợng lớn khuẩn lạc gồm khuẩn lạc xanh khuẩn lạc trắng Các khuẩn lạc xanh mọc lên từ tế bào nhận đƣợc plasmid tự đóng vịng trở lại nên gen lac-operon hoạt động tổng hợp enzyme β-galactosidase Enzyme chuyển hoá chất X-gal thành hợp chất có màu xanh dƣới cảm ứng IPTG Còn khuẩn lạc trắng xuất vi khuẩn nhận đƣợc plasmid mang lac-operon khơng hoạt động, enzyme β- Hình 3.3 Kết điện di DNA thu đƣợc từ kỹ thuật gel agarose 1% (M: Marker DNA 1Kb; 1: Phổ Yên; 2: Phú Bình) Hình 3.3 cho thấy, sản phẩm thơi gel có hàm lƣợng cao, khơng bị đứt galactosidase khơng đƣợc tạo nên khơng có q trình chuyển hố X-gal thành dạng màu xanh Lac-operon bị bất hoạt đoạn gen ngoại lai xen vào promotor operon gen LacZ làm cho lac-promotor điều khiển q trình tổng hợp enzyme Đoạn gen ngoại lai đoạn gen CP- gẫy đảm bảo cho việc tiến hành thí nghiệm 3.2.3 Kết biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào khả biến E.coli DH5α Chúng tơi sử dụng vector tách dịng pBT Phịng Cơng nghệ Tế bào Thực vật, Viện Công nghệ Sinh học cung cấp để tiến hành phản ứng ghép nối biến nạp Sản phẩm RT-PCR sau tinh đƣợc gắn vào vector pBT enzyme T4 ligase Phản ứng ghép nối dựa nguyên tắc bổ sung hai đầu nucleotide A thò sản phẩm PCR với Taq polymerase hai đầu nucleotide T vector tách dòng Hỗn hợp phản ứng đƣợc ủ nhiệt độ phòng để phản ứng xảy hoàn toàn Vector tái tổ hợp sau PVY nguyên vẹn đoạn bị đứt gãy Các khuẩn lạc trắng khuẩn lạc vệ tinh không mang plasmid Khuẩn lạc vệ tinh có kích thƣớc nhỏ, đƣợc mọc lên xung quanh khuẩn lạc có plasmid chứa đoạn gen xen vào sau khuẩn lạc phân huỷ đáng kể lƣợng kháng sinh môi trƣờng xung quanh Để nhân đƣợc dòng tế bào mang plasmid tái tổ hợp chứa đoạn gen CP cần phải tiến hành chọn lọc plasmid tái tổ hợp cách PCR trực tiếp từ khuẩn lạc (colony-PCR) để loại bỏ trƣờng hợp không mong muốn 3.2.4 Kết chọn lọc plasmid tái tổ hợp colony-PCR đƣợc biến nạp vào tế bào khả biến E.coli chủng DH5α đƣợc cấy trải Tiến hành PCR trực tiếp từ số khuẩn lạc trắng với cặp mồi pUC18- mơi trƣờng LB đặc có bổ sung ampicillin 100mg/l, X-gal 40mg/ml IPTG F1/pUC18-R1 để xác định khuẩn lạc mang gen CP Chỉ sử dụng cặp 100M Ủ đĩa petri 370C 16 mồi không sử dụng cặp mồi đặc hiệu nằm gen phản Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 43 http://www.Lrc-tnu.edu.vn Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 44 http://www.Lrc-tnu.edu.vn ứng gắn gen vào vector, lƣợng lớn gen không đƣợc gắn vào vector tồn hỗn hợp phản ứng, cấy trải lên đĩa thạch gen nằm rải rác đĩa thạch nằm dƣới xung quanh khuẩn lạc Do đó, phản ứng colony-PCR bị gây nhiễm kết không xác Hình 3.5 Kết colony-PCR số dịng khuẩn lạc với mẫu Phú Bình M: Marker DNA 1Kb 8-9: Dòng khuẩn lạc số 8-9 Từ kết điện di cho thấy, sản phẩm colony PCR từ dòng khuẩn lạc trắng có dịng cho kết dƣơng tính dịng 1, 2, 4, 5, 6, 8, 3.2.5 Kết tách plasmid từ khuẩn lạc mẫu nghiên cứu Hình 3.4 Kết colony-PCR số dòng khuẩn lạc với mẫu Phổ Yên M: Marker DNA 1Kb 1-7: Dòng khuẩn lạc số 1-7 (+) : Đối chứng dƣơng - plasmid pTZ57R/T/CP-PVY (-1) : Đối chứng âm – dòng khuẩn lạc xanh (-2) : Đối chứng âm – Thành phần PCR khơng có khuẩn lạc Bảng 3.3 Trình tự mồi để thực colony-PCR Tên mồi Trình tự pUC18-F1 5‟ - GAGGGTTTTCCCAGTCACGA – 3‟ pUC18-R1 5‟ - GCGGATAACAATTTCACACA – 3‟ A B Hình 3.6 Kết điện di tách plasmid mang gen CP (A: Mẫu Phổ n; B: Mẫu Phú Bình) Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 45 http://www.Lrc-tnu.edu.vn Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 46 http://www.Lrc-tnu.edu.vn | | | | | | | | | | Chúng chọn khuẩn lạc trắng dòng dòng với mẫu Phổ n; 160 dịng mẫu Phú Bình để tách plasmid theo kit hãng Bioneer Sản phẩm DNA plasmid đƣợc điện di gel agarose 1% Kết đƣợc thể 190 200 ACGTCCAAAA TGAGAATGCC CAAGAGTAAA GGTGCAACTG TACTAAATTT Phu Binh ACGTCCAAAA TGAGAATGCC CAAAAGCAAG GGAGCAACCG TGCTAAATTT | | | | | | | | | | Kết điện di hình 3.6 cho thấy, sản phẩm tách plasmid sạch, đảm bảo chất lƣợng số lƣợng để tiến hành đọc trình tự nucleotide gen CP 3.3 KẾT QUẢ SO SÁNH TRÌNH TỰ GEN CP CỦA PVY TỪ HAI MẪU 210 ABI PRISM® 3100 Avant Genetic Analyzer theo hai chiều xuôi ngƣợc Phổ Yên Phú Bình có kích thƣớc 1201 nucleotide, đoạn mã hóa dài 250 AGAACACTTG CTTGAGTACG CTCCACAACA AATTGATATT TCAAATACTC | | | | | | | | | | 270 280 290 300 Pho Yen GAGCAACTCA ATCACAGTTT GATACGTGGT ATGAAGCGGT ACAACCTGCA Phu Binh GGGCAACTCA ATCACAGTTT GATGCGTGGT ATGAGGCAGT GCGGATGGCA | | | | | | | | | | 310 320 330 340 350 Pho Yen TACGACATAG GAGAAACTGA AATGCCAACT GTGATGAATG GGCTTATGGT Phu Binh TACGACATAG GAGAAACTGA GATGCCAACT GTGATGAATG GGCTTATGGT 801 nucleotide, protein dài 267 acid amine Chúng kết luận nhân, tách | | | | | | | | | | 360 dòng đọc trình tự thành cơng đoạn gen mã hố CP PVY khoai tây 3.3.1 So sánh trình tự nuclotide acid amine gen CP-PVY 240 Phu Binh Khi so sánh trình tự BLAST NCBI, kết cho biết trình tự gen mã hố CP PVY khoai tây Chiều dài gen CP mẫu 230 GGAACACTTA CTCGAGTATG CTCCACAGCA AATTGACATC TCAAATACTC 260 Trình tự nucleotide gen CP đƣợc xác định máy đọc tự động 220 Pho Yen NGHIÊN CỨU 370 380 390 400 Pho Yen TTGGTGCATT GAAAATGGAA CCTCGCCAAA CATCAACGGA GTTTGGGTTA Phu Binh TTGGTGCATT GAAAATGGAA CCTCGCCAAA TGTCAACGGA GTTTGGGTTA mẫu nghiên cứu | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | 10 20 30 40 50 Pho Yen GGAAATGACA CAATCGATGC AGGAGGAAGC ACTAAGAAGG ATGCAAAACA Phu Binh GCAAATGACA CAATTGATGC AGGAGAAAGC AACAAGAAAG ATGCAAAACC 410 60 70 80 90 100 Pho Yen AGAGCAAGGT AGCATTCAAC CAAATCTCAA CAAGGAAAAG GAAAAGGACG Phu Binh AGAGCAAGGC AGCATCCAGT CAAACCTGAA CAAAGGAAAA GATAAGGATG 120 130 140 TGAATGCTGG TACATCTGGG ACACATACTG TGCCGAGAAT CAAGGCTATC Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 47 http://www.Lrc-tnu.edu.vn 440 450 Phu Binh TGATGGATGA GAATGAACAA GTTGAGTACC CGTTGAAACC AATCGTTGAG | | | | | | | | | | 460 470 480 490 500 Pho Yen AATGCAAAAC CAACACTTAG GCAAATCATG GCACATTTCT CAGATGTTGC Phu Binh AATGCAAAAC CAACCCTTAG GCAAATCATG GCACATTTCT CAGATGTTGC | | | | | | | | | | 510 150 TGAATGTTGG AACATCTGGA ACTCATACTG TGCCACGAAT TAAAGCTATC 430 TGATGGATGG AGATGAACAA GTCGAATACC CACTGAAACC AATCGTTGAG | | | | | | | | | | 110 420 Pho Yen | | | | | | | | | | Phu Binh 180 Pho Yen hình 3.6 Pho Yen 170 520 530 540 550 Pho Yen AGAAGCGTAT ATAGAAATGC GCAACAAAAA GGAACCATAT ATGCCACGAT Phu Binh AGAAGCGTAT ATAGAAATGC GCAACAAAAA GGAACCATAT ATGCCACGAT Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 48 http://www.Lrc-tnu.edu.vn | | | | | | | | | | 560 570 580 590 600 Pho Yen ATGGTTTAGT TCGTAATCTG CGCGATGGAA GTTTGGCTCG CTATGCTTTT Phu Binh ATGGTTTAAT TCGAAATCTG CGGGATGTGG GTTTAGCGCG TTATGCCTTT | | | | | | | | | | 610 620 630 640 650 Pho Yen GACTTTTATG AGGTCACATC ACGAACACCA GTGAGGGCTA GGGAAGCGCA Phu Binh GACTTTTATG AAGTCACATC ACGAACACCA GTGAGGGCTA GGGAAGCGCA | | | | | | | | | | 660 670 680 690 700 Pho Yen CATTCAAATG AAGGCCGCAG CATTGAAATC AGCCCAACCT CGACTTTTCG Phu Binh CATTCAAATG AAGGCCGCAG CATTGAAATC AGCCCAACCT CGACTTTTCG | | | | | | | | | | 710 720 730 740 GGTTGGACGG TGGCATCAGT ACACAAGAGG AGAACACAGA GAGGCACACC Phu Binh GGTTGGACGG TGGCATCAGT ACACAAGAGG AGAACACAGA GAGGCACACC | | | | | | | | | | 770 780 790 YDIGETEMPT VMNGLMVWCI ENGTSPNING VWVMMDGDEQ VEYPLKPIVE Phu Binh YDIGETEMPT VMNGLMVWCI ENGTSPNVNG VWVMMDENEQ VEYPLKPIVE | | | | | | | | | | 160 170 180 190 200 Pho Yen NAKPTLRQIM AHFSDVAEAY IEMRNKKEPY MPRYGLVRNL RDGSLARYAF Phu Binh NAKPTLRQIM AHFSDVAEAY IEMRNKKEPY MPRYGLIRNL RDVGLARYAF | | | | | | | | | | 210 220 230 240 250 Pho Yen DFYEVTSRTP VRAREAHIQM KAAALKSAQP RLFGLDGGIS TQEENTERHT Phu Binh DFYEVTSRTP VRAREAHIQM KAAALKSAQP RLFGLDGGIS TQEENTERHT | | | 260 Pho Yen TEDVSPSMHT LLGVKNM Phu Binh TEDVSPSMHT LLGVKNM 750 Pho Yen 760 Pho Yen 800 Hình 3.8 So sánh trình tự acid amine gen CP-PVY mẫu nghiên cứu Trình tự gen CP-PVY từ mẫu nghiên cứu có sai khác 71 vị trí nuleotide Do thấy, mức độ tƣơng đồng trình tự tƣơng Pho Yen ACCGAGGATG TCTCTCCAAG TATGCATACT CTACTTGGAG TCAAGAACAT đối thấp (91,1%) So sánh protein suy diễn từ trình tự gen cho thấy mức Phu Binh ACCGAGGATG TCTCTCCAAG TATGCATACT CTACTTGGAG TCAAGAACAT độ sai khác 6,4% Sự biến động trình tự nucleotide gen khơng đồng đều, có vùng biến động lớn (nhƣ vùng đến 144) có Pho Yen G Phu Binh G vùng không biến động nuleotide (nhƣ vùng từ 613 đến 801) Hình 3.7 So sánh trình tự nucleotide gen CP-PVY mẫu nghiên cứu | | | | | | | | | | 10 20 30 40 50 Pho Yen GNDTIDAGGS TKKDAKQEQG SIQPNLNKEK EKDVNVGTSG THTVPRIKAI Phu Binh ANDTIDAGES NKKDAKPEQG SIQSNLNKGK DKDVNAGTSG THTVPRIKAI | | | | | | | | | | 60 70 80 90 100 Pho Yen TSKMRMPKSK GATVLNLEHL LEYAPQQIDI SNTRATQSQF DTWYEAVQPA Phu Binh TSKMRMPKSK GATVLNLEHL LEYAPQQIDI SNTRATQSQF DAWYEAVRMA | | | | | | | | | | 110 120 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 130 49 140 150 http://www.Lrc-tnu.edu.vn Sự sai khác nucleotide dẫn đến sai khác acid amin, có vùng có sai khác nuleotide không dẫn tới sai khác vế acid amin (nhƣ vùng nucleotide từ 108 đến 273) 3.3.2 So sánh trình tự nuclotide gen CP-PVY mẫu nghiên cứu với trình tự gen CP-PVY khoai tây đƣợc công bố ngân hàng gen Để thấy đƣợc đa dạng di truyền mức phân tử PVY, chúng tơi tiến hành so sánh trình tự gen PVY phân lập từ Phú Bình Phổ Yên với số trình tự gen PVY khác Ngân hàng gen quốc tế NCBI Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 50 http://www.Lrc-tnu.edu.vn Bảng 3.4 19 trình tự ngân hàng gen đƣợc đƣa so sánh Mã số Chủng (biến thể) DQ925437 PVYNTN M95491 PVYNTN X79305 Nƣớc Hà Nội-Việt Mã số Chủng (biến thể) Nƣớc U91747 PVYN USA Hungary X97895 PVYN Switzerland PVYNTN Austria Z70237 PVYN Polan X92078 PVYNTN Lebanon AF118153 PVYO India AJ890345 PVYNTN Germany AY792597 PVYO China EF016294 PVYNTN UK D12539 PVYO Japan AB205416 PVYN Japan U09509 PVYO Canada AF255660 PVYN Brazil X14136 PVYO Argentina AM268435 PVYN New Zealand X68222 PVYO USA Z70239 PVYO Poland Nam Hình 3.9 Biểu đồ hình biểu diễn mối quan hệ di truyền CP-PVY phân lập đƣợc từ Phổ Yên Phú Bình với 19 trình tự ngân hàng gen Kết phân tích cho thấy, trình tự gen CP-PVY mẫu Phổ n, Phú Bình có độ tƣơng đồng cao (từ 89,3% đến 99,6%) so với trình tự CP-PVY chủng PVY cơng bố Nhƣ vậy, đƣa kết luận: Sử dụng phần mềm DNAstar BioEdit để so sánh trình tự gen, lập bảng hệ số tƣơng đồng biểu đồ hình biểu diễn quan hệ di truyền gen CP-PVY mẫu nghiên cứu với 19 trình tự phân lập đƣợc thành công gen CP PVY khơng phải loại virus khác Trình tự CP-PVY mẫu Phổ Yên có độ tƣơng đồng từ 89,9% đến 91,6% so với trình tự thuộc chủng PVYO; từ 96,4% đến 97,4% so với trình tự thuộc chủng PVYN; từ 98,6% đến 99,6% so với trình tự thuộc chủng PVYNTN Nhƣ vậy, trình tự CP-PVY phân lập từ Phổ Yên có độ tƣơng đồng với trình tự CP chủng PVYNTN cao so với trình tự thuộc chủng khác Trong đó, có độ tƣơng đồng cao (99,6%) với trình Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 51 http://www.Lrc-tnu.edu.vn Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 52 http://www.Lrc-tnu.edu.vn tự có mã số EF016294 Điều chứng tỏ PVY phân lập Phổ Yên-Thái Nguyên thuộc chủng PVYNTN Trình tự CP-PVY phân lập từ Phú Bình có độ tƣơng đồng từ 94,6% đến 98,5% so với trình tự thuộc chủng PVY O; 90,8% đến 91,5% so với trình tự thuộc chủng PVYNTN; 89,3% đến 89,6% so với trình tự thuộc chủng PVYN Nhƣ vậy, trình tự CP-PVY mẫu Phú Bình có độ tƣơng đồng với trình tự thuộc chủng PVYO cao so với trình tự thuộc chủng khác Trong đó, có độ tƣơng đồng cao (98/5%) với trình tự có mã số Z70239 Điều chứng tỏ PVY phân lập Phú Bình-Thái Nguyên Hệ số giống (%) O thuộc chủng PVY quan hệ di truyền gen CP-PVY phân lập từ Phổ Yên, Phú Bình với 19 trình tự ngân hàng gen Biểu đồ cho thấy 21 trình tự đƣợc chia thành nhóm lớn Nhóm I lại đƣợc chia thành nhóm phụ Nhóm phụ I1 gồm trình tự thuộc chủng PVYNTN Phổ n Nhóm phụ I2 gồm trình tự Hệ số khác (%) Kết phù hợp với phân tích biểu đồ hình biểu diễn chủng PVYO Phú Bình Theo nghiên cứu Mohamad Chikh Ali cs , vị trí acid amine thứ 29 gen CP-PVY Gly29 bảo thủ cho chủng PVYO, PVYC, PVYNW Trong Gln17 Glu31 lại bảo thủ gen CP PVYN/PVYNTN (Chikh Ali cs, 2007) [24] Trình tự acid amine CP-PVY mẫu Phổ Yên Bảng 3.5 Hệ số giống khác trình tự nucleotide vùng mã hố gen CP mẫu nghiên cứu so với mẫu ngân hàng NCBI Phú Bình hồn tồn phù hợp với nhận định Chikh Ali Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 53 http://www.Lrc-tnu.edu.vn 54 http://www.Lrc-tnu.edu.vn KẾT LUẬN VÀ ĐỂ NGHỊ CƠNG TRÌNH ĐÃ CƠNG BỐ KẾT LUẬN 1.1 Đã tiến hành khảo sát, thống kê tỉ lệ khoai tây có triệu chứng nhiễm Chu Hồng Mậu, Nguyễn Vũ Thanh Thanh, Vũ Thị Bƣởi (2009), “Xác PVY theo phƣơng pháp quan sát mắt thƣờng Kết nghiên cứu cho định trình tự gen mã hố protein vỏ virus Y khoai tây đánh giá thấy phƣơng pháp có độ tin cậy thấp dễ nhầm lẫn với bệnh khác đa dạng di truyền virus này”, Tạp chí Khoa học Cơng nghệ, 56(8), Nxb hay phản ứng trƣớc điều kiện sinh thái khác Đại học Thái Nguyên 1.2 Đã nhân đƣợc gen CP phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu từ mẫu khoai tây Phổ Yên-Thái Nguyên Phú Bình-Thái Nguyên Sản phẩm PCR đƣợc dịng hố nhờ vector pBT Đoạn mã hóa dài 801 nucleotide protein gồm 267 acid amine 1.3 Trình tự gen CP-PVY mẫu Phổ Yên-Thái Nguyên Phú Bình-Thái Ngun có sai khác 8,9% 1.4 So sánh trình tự đoạn mã hố gen CP-PVY mẫu nghiên cứu với mẫu công bố Ngân hàng gen quốc tế NCBI cho thấy hệ số sai khác dao động từ 0,04% đến 10,7% 1.5 Đã xác định đƣợc PVY phân lập từ Phổ Yên thuộc chủng PVYNTN, PVY phân lập từ Phú Bình thuộc chủng PVYO ĐỀ NGHỊ Tiếp tục đánh giá đa dạng cấu trúc gen CP PVY phân lập từ khu vực khác để tạo nguồn nguyên liệu phục vụ cho thiết kế vector chuyển gen kháng PVY khoai tây Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 55 http://www.Lrc-tnu.edu.vn Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 56 http://www.Lrc-tnu.edu.vn [14] Phạm Thị Vân, Nguyễn Minh Hùng, Lê Trần Bình, Chu Hồng Hà TÀI LIỆU THAM KHẢO (2009), “Phân lập so sánh trình tự gen mã hoá cho protein (CP) Tài liệu tiếng việt [1] Hồ Hữu An, Đinh Thế Lộc (2005), Cây có củ kĩ thuật thâm canh, NXB PVY số tỉnh thuộc đồng sông hồng, Việt Nam”, Tạp chí Sinh học, 1(31), tr 85-91 Lao động Xã hội, tr 12- 13 [2] Nguyễn Mạnh Chinh (2005), Khoai tây (Solanum tuberosum), http://longdinh.com [3] Đƣờng Hồng Dật (2005), Cây khoai tây kĩ thuật thâm canh tăng suất, NXB Lao động Xã hội [4] Trƣơng Văn Hộ, Trịnh Quốc Mỵ, Nguyễn Văn Đĩnh, P Vander Zaag (1990), [14] Trƣơng Quang Vinh (2007), Phân tích đa hình ADN ứng dụng kĩ thuật nuôi cấy mô thực vật vào việc nhân giống khoai tây củ bi bệnh, Luận văn thạc sĩ khoa học sinh học, Trƣờng Đại học Sƣ phạm-Đại học Thái Nguyên Tài liệu nƣớc [15] Abdelmaksoud H.M., Gamal Eldin A.S (2002), The complete nucleotide “Điều tra bảo quản khoai tây giống đồng Bắc Bộ”, Một số kết sequence of the Potato virus Y strain N-Egypt, unpublished (GenBank nghiên cứu khoai tây (1986- 1990), NXB Nông nghiệp, Hà Nội, tr 77- 82 Accession number: AF522296) [16] Berckx R (1967), “Methodische untersuchungen uber den serologischen [5] Http://old.netmode.com.vn [7] Vũ Triệu Mân (1986), Bệnh virus khoai tây, Nxb Khoa học Kĩ thuật [8] Vũ Triệu Mân (2007), Giáo trình bệnh chuyên khoa, NXB Nông nghiệp I, Hà Nội [9] Vũ Triệu Mân (2007), Giáo trình bệnh đại cương, NXB Nơng nghiệp I, Hà Nội [10] Nguyễn Thị Kim Thanh, Hoàng Minh Tấn, Nguyễn Quang Thạch (1994), “Một số kết việc tạo củ giống khoai tây ống nghiệm in vitro”, Kết nghiên cứu khoa học trồng trọt 1992- 1993, NXB Nông nghiệp, Hà Nội [11] Trần Thanh Thu, Lê Trần Bình, Lê Thị Muội (1988), “Tạo củ bi khoai tây virus kĩ thuật nuôi cấy mô in vitro” , Tạp chí Khoa học Kĩ thuật Nơng nghiệp [12] Hƣơng Tú ( 2008), Vị thuốc từ củ khoai tây, http:// www.ykhoanet.com [13] Vũ Hƣớng Văn (2007), Khoai tây đâu thực phẩm, http:// nachweis pflanzenpathogener viren mit dem bentonitflockungstest, den latextext und dem bariumsulfat test”, Phytopathologische Zeitschrift, 58, 1–17 [17] Bhat A.I., Varma A., Pappu H.R., Rajamannar M., Jain R.K., Praveen S (2004), Accession AF118153, Potato virus Y polyprotein gene, partial cds http://www ncbi.nlm.nih.gov [18] Bill B., Dean (1992), “Managing the potato production system”, Food product press, An impuin of Haworth pess, New York, London, Nozwood (Australia), pp 31-32 [19] Boonham N., Barker I (1998), “Strain-specific recombinant antibodies to potato virus Y potyvirus”, J Virol Methods, 74 (2), 193–199 [20] Boonham N., Walsh K., Preston S., North J., Smith P., Barker I (2002), “The detection of tuber necrotic isolates of Potato virus Y, and the accurate discrimination of PVY(O) PVYN and PVYC strains using RT-PCR”, J Virol Methods, 102 (1–2), 103–112 www.suckhoe360.com Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 57 http://www.Lrc-tnu.edu.vn Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 58 http://www.Lrc-tnu.edu.vn [21] Bravo-Almonacid F., Mentaberry,A.N (2006), Accession X14136, Potato [32] Gow L.J., Boonham N., Barker I., Foster G.D (2006), Accession virus Y (PVY) mRNA for viral coat protein http://www ncbi.nlm.nih.gov EF016294, Potato virus Y strain NTN isolate v942490, complete genome [22] Chachulska A.M., Chrzanowska M., Robaglia C., Zagorski W (1996), http://www ncbi.nlm.nih.gov Accession Z70237, Potato virus Y mRNA for coat protein http://www [33] Gugerli P., Fries P (1983), “Characterization of monoclonal antibodies to ncbi.nlm.nih.gov potato virus Y and their use for virus detection”, J Gen Virol, 64, 2471–2477 [23] Chachulska,A.M., Chrzanowska,M., Robaglia,C., Zagorski,W (1996), [34] Ha C., Revill P., Harding R.M., Vu M., Dale J.L (2008), Accession Accession Z70239, Potato virus Y mRNA for coat protein http://www DQ925437, Potato virus Y isolate PVY-VN/P2 polyprotein gene, partial cds ncbi.nlm.nih.gov http://www ncbi.nlm.nih.gov [24] Chikh Ali M et al., (2001), Virus gense, 35 : 359-367 [35] Health R., Sward R.J., Moran J.R., Mason A.J., Hallam N.D (1987), [25] Chrzanowska M (1991), “New isolates of the necrotic strain of potato “Biological characterization of six Australian isolates of potato virus Y and virus Y (PVYN) found recently in Poland”, Potato Res, 34, 179–182 their serological detection by ELISA”, Aust J Agric Res, 38, 395–402 [26] Clark M.F., Adams A.N (1977), “Characteristics of the microplate [36] Hidaka M., Yoshida Y., Masaki H., Namba S., Yamashita S., Tsuchizaki T., method of enzyme-linked immunoassay for the detection of plant viruses”, J Uozumi T (2008), Accession D12539, Potato virus Y gene for polyprotein, partial Gen Virol, 34, 475–783 cds http://www ncbi.nlm.nih.gov [27] Dhar A.K., Singh R.P., Boucher A (2002), Accession U91747, Potato [37] Inoue-Nagata A.K., Fonseca M.E.N., Lobo T.O.T.A., de Avila A.C., virus Y polyprotein gene, partial cds, coat protein region http://www Monte D.C (2001), Accession AF255660, Potato virus Y isolate PVY-NBR ncbi.nlm.nih.gov polyprotein gene, partial cds http://www ncbi.nlm.nih.gov [28] Dimitre S Mollov, Christian A Thill* (2004), “Evidence of Potato Virus [38] Jakab G., Droz E., Brigneti G., Baulcombe D., Malnoe P (1997), “Infectious Y Asymptomatic Clones in Diploid and Tetraploid Potato-breeding in vivo and in vitro transcripts from a full-length cDNA clone of PVY-N605: a Populations”, Potato Res (2004), 81:317-326 317 Swiss necrotic isolate of potato virus Y”, J Gen Virol, 78 (12), 31 [29] Ellis P., Stace-Smith R., Bowler G., Mackenzie D.J (1996), “Production [39] Jakab G., Droz E., Brigneti G., Baulcombe D., Malnoe P (2005), of monoclonal antibodies for detection and identification of strains of potato Accession X97895, Potato virus Y genes encoding viral polyprotein virus Y”, Plant Pathol, 18, 64–70 http://www ncbi.nlm.nih.gov [30] FAO (2005), FAO statistic database [40] Kerlan C (2008), Potato Viruses, @ 2008 Elsevier Ltd All rights [31] Glais L., Kerlan C., Robaglia C (2001), “Variability and evolution of potato reserved virus Y, the type species of the Potyvirus genus”, Plant Viruses as Molecular [41] Kerlan C, Moury B (2008), Potato virus Y, @ 2008 Elsevier Ltd All Pathogens, Food Products Press, The Haworth Press Inc., New York rights reserved Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 59 http://www.Lrc-tnu.edu.vn Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 60 http://www.Lrc-tnu.edu.vn [42] Kerlan C., Tribodet M., Glais L., Guillet M (1999), “Variability of [51] Nie X., Singh R.P (2003), “Specific differentiation of recombinant potato virus Y in potato crops in France”, J Phytopathol, 147, 643– 651 PVY(N:O) and PVY(NTN) isolates by multiplex RT-PCR”, J Virol Methods, 113 [43] Le Romancer M., Kerlan C., Nedellec M (1994), “Biological (2),69–77 characterization of various geographical isolates of potato virus Y inducing [52] Ohshima K., Sako K., Hiraishi C., Nakagawa A., Matsuo K., Ogawa T., superficial necrosis on potato tubers”, Plant Pathol, 43, 138–144 Shikata E., Sako N (2008), Accession AB025416, Potato virus Y gene for [44] Maat D.Z., Huttinga H (1987), “Serology”, Viruses of Potatoes and coat protein, partial cds, isolte: TND6 http://www ncbi.nlm.nih.gov Seed-Potato Production, Pudoc, Wageningen, NL [53] Oshima K., Inoue A.K., Ishikawa Y., Shikata E., Takashi H (1990), [45] Macdec P (1963), “Tuber forming substances in the potato”, The Growth “Production and application of monoclonal antibodies specific to ordinary strain and necrotic strain of potato virus Y”, Ann Phytopathol Soc Jpn, 56, of the potato, pp 121- 130 [46] Marie-Jeanne Tordo V., Chachulska A.M., Fakhfakh H., Le Romancer M., Robaglia C., Astier-Manifacier S (1995), “Sequence polymorphism in the NTR and in the P1 coding region of potato virus Y genomic RNA”, J Gen 508–514 [54] Ounouna H., Kerlan C., Lafaye P., Loukili M.J., ElGaaied A (2002), “Production of monoclonal antibodies against synthetic peptides of the Nterminal region of Potato virus Y coat protein and their use in PVY strain Virol, 76, 939–949 [47] Matousek J., Ptacek J., Dedic P., Schubert J (2000), “Analysis of variability of P1 gene region of N strain of potato virus Y using temperaturegradient gel electrophoresis and DNA heteroduplex analysis”, differentiation”, Plant Pathol, 51, 487–494 [55] Revers F., Le Gall O., Candresse T., Le Romancer M., Dunez J (1995), Accession X92078, Potato virus Y mRNA for coat protein http://www ncbi.nlm.nih.gov Acta Virol, 44 (1), 41–46 [48] Mc Donald J.G., Singh R.P (1996), “Host range, symptomatology, and serology of isolates of Potato virus Y (PVY) that share properties with both the PVYN and PVYO strain groups”, Am Potato J, 73, 309–315 [49] Moravec T., Cerovska N., Boonham N (2003), “The detection of recombinant, tuber necrosing isolates of Potato virus Y (PVY NTN) using a [56] Robaglia C., Durand-Tardif M., Tronchet M., Boudazin G., AstierManifacier S., Casse-Delbart F (1989), “Nucleotide sequence of potato virus Y (N strain) genomic RNA”, J Gen Virol, 70, 935–947 [57] Rosner A., Maslenin L (1999), “Differentiating PVYNTN by unique single-restriction cleavage of PCR products”, Potato Res, 42, 215–221 three-primer PCR-based in the coat protein gene”, J Virol Methods, 109 (1), [58] Rosner A., Maslenin L (2001), “Differentiating PVY(NTN) from PVY(N) by 63–68 annealing to reference RNA transcripts”, J Virol Methods, 97 (1–2), 125–131 [50] Nie X., Singh R.P (2002), “A new approach for the simultaneous differentiation of biological and geographical strains of Potato virus Y by uniplex and multiplex RT-PCR”, J Virol Methods, 104 (1), 41–54 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 61 http://www.Lrc-tnu.edu.vn [59] Rosner A., Maslenin L (2003), “Tagging of viral RNA transcripts with strain-specific oligonucleotides: characterization and application”, J Virol Methods, 110 (1), 105–109 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 62 http://www.Lrc-tnu.edu.vn [60] Sanz A., Cambra M., Perez de San Roman C., Miguet J.G., Cort´es E., [69] Vetten H.J., Ehlers U., Paul H.L (1983), “Detection of potato viruses Y Gorris M.T., Vela C (1990), “Preparation of additional monoclonal and A in tubers by enzyme-linked immunosorbent assay after artificial break antibodies for detection and discrimination of potato virus Y isolates infecting of dormancy”, Phytopathologische Zeitschrift, 108, 41–53 potato”, Potato Res, 33, 365–375 [70] Walkey D.G.A., Webb M.J.W (1984), “The use of a simple electron [61] Schubert J., Fomitcheva V., Sztangret-Wisniewska J (2007), Accession microscope serology procedure to observe relationships of seven potyviruses ”, AJ890345, Potato virus Y strain NTN gene for polyprotein, genomic RNA, isolate Linda http://www ncbi.nlm.nih.gov [62] Singh R.P., Boucher A., Somerville T.H., Dhar A.K (1993), “Selection of monoclonal antibody to detect PVYN and its use in ELISA and DIBA Phytopathologische Zeitschrift, 110, 319–327 [71] Walsh K., North J., Barker I., Boonham N (2001), “Detection of different strains of Potato virus Y and their mixed infections using competitive fluorescent RT-PCR”, J Virol Methods, 91 (2), 167–173 assays”, Can J Plant Pathol, 15, 293-300 [63] Singh M., Singh R.P (1997), Accession U09509, Potato virus Y common [72] Wang X., Zhu C., Wen F (2004), Accession AY792597, Potato virus Y coat protein gene, partial cds http://www ncbi.nlm.nih.gov strain, complete genome http://www ncbi.nlm.nih.gov [64] Sudarsono, Woloshuk S.L., Xiong Z., Hellmann G.M., Wernsman E.A., Weissinger A.K., Lommel S.A (1993), Accession X68222, Potato Virus Y (Potato US) genomic RNA of Capsid protein cistron http://www ncbi.nlm.nih.gov [65] Talley J., Warren F.H.J.B., Torrance L., Jones R.A.C (1980), “A simple kit for detection of plant viruses by the latex serological test”, Plant Pathol., 29, 77–79 [66] Tetsuji Ogawaa, Yasuhiro Tomitakab, Akio Nakagawaa,1, Kazusato Ohshimab,∗ (2008), “Genetic structure of a population of Potato virus Y inducing potato tuber necrotic ringspot disease in Japan; comparison with North American and European populations”, Virus Research, 131 (2008) 199–212 [67] Thole V., Dalmay T., Burgyan J., Balazs E (1993), Accession M95491, Potato virus Y polyprotein gene, complete cds http://www ncbi.nlm.nih.gov [68] Van den Heuvel J.F.J.M., van der Vlugt R.A.A., Verbeek M., De Haan P.T., Huttinga H (1995), Accession X79305, Potato Virus Y genomic sequence for coat protein http://www ncbi.nlm.nih.gov Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 63 http://www.Lrc-tnu.edu.vn Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 64 http://www.Lrc-tnu.edu.vn