Chương 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
3.1. KẾT QUẢ KHẢO SÁT TỈ LỆ NHIỄM PVY Ở MỘT SỐ ĐỊA PHƯƠNG
+ Cánh đồng khoai tây thuộc thôn Hành Lạc, thị trấn Nhƣ Quỳnh, huyện Văn Lâm, tỉnh Hƣng Yên.
+ Cánh đồng khoai tây thuộc làng Khả Lý Hạ, xã Quảng Minh, huyện Việt Yên, tỉnh Bắc Giang.
+ Cánh đồng khoai tây tại thôn Thùa Lâm, xã Tiên Phong, huyện Phổ Yên, tỉnh Thái Nguyên.
+ Cánh đồng khoai tây thuộc huyện Phú Bình, tỉnh Thái Nguyên.
+ Cánh đồng khoai tây thuộc xã Thụy Ninh, huyện Thái Thụy, tỉnh Thái Bình.
Trong đó, chỉ cánh đồng ở Phổ Yên-Thái Nguyên trồng khoai tây Hà Lan còn các cánh đồng khác trồng khoai tây Trung Quốc. Thời điểm khảo sát là khi khoai tây đã trồng đƣợc 1 tháng rƣỡi đến 2 tháng.
Ở mỗi vùng, chúng tôi đã tiến hành phát hiện và xác định tỉ lệ khoai tây có triệu chứng nhiễm PVY. Việc chẩn đoán cây bị bệnh đƣợc tiến hành theo phương pháp quan sát bằng mắt thường. Trên từng cánh đồng, chúng tôi lấy 3 lô ngẫu nhiên, mỗi lô 100 khóm. Xác định số khóm có triệu chứng nhiễm PVY trên từng lô. Tỉ lệ khoai tây có triệu chứng nhiễm PVY trên mỗi cánh đồng đƣợc tính bằng giá trị trung bình tỉ lệ nhiễm ở 3 lô. Kết quả thu đƣợc nhƣ sau:
Bảng 3.1. Tỉ lệ có triệu chứng bị bệnh ở các cánh đồng khoai tây nghiên cứu Cánh đồng khoai tây Ký hiệu Triệu chứng nhiễm PVY (%) Phổ Yên-Thái Nguyên Phổ Yên 14,23 ± 2,56 Phú Bình-Thái Nguyên Phú Bình 28,07 ± 3,03 Thái Thụy-Thái Bình Thái Bình 20,03 ± 3,13
Văn Lâm-Hƣng Yên Hƣng Yên 22,56 ± 2,85
Việt Yên-Bắc Giang Bắc Giang 31,71 ± 2,15
Nhƣ vậy, tỷ lệ khoai tây có triệu chứng nhiễm PVY dao động từ 14,23±2,56% đến 31,71±2,15%. Kết quả này phù hợp với kết quả điều tra của Trương Văn Hộ và cs (1990) [4]. Trong đó, cánh đồng ở Bắc Giang có tỷ lệ khoai tây mang triệu chứng nhiễm PVY cao nhất (31,71±2,85%) và ở Phổ Yên-Thái Nguyên có tỷ lệ khoai tây mang triệu chứng nhiễm PVY thấp nhất (14,23±2,56%).
Cánh đồng khoai tây khảo sát ở Bắc Giang Mẫu có triệu chứng nhiễm bệnh ở Bắc Giang
Cánh đồng khoai tây khảo sát ở Hưng Yên Mẫu có triệu chứng bị bệnh ở Hưng Yên Hình 3.1. Một số hình ảnh về khoai tây ở các vùng nghiên cứu
Tuy vậy, phương pháp chuẩn đoán bằng mắt thường dễ có sự nhầm lẫn với các bệnh khác nhƣ bệnh do tuyến trùng, các bệnh sinh lí do dinh dƣỡng hay điều kiện khí hậu gây ra. Ngoài ra, dễ nhầm lẫn virus này với những virus khác do có sự xâm nhiễm hỗn hợp của các virus trên cùng một cây. Do đó, chuẩn đoán chính xác khoai tây nhiễm PVY cần kết hợp với các phương pháp khác như sử dụng kính hiển vi điện tử, phương pháp huyết thanh hay sinh học phân tử.
Trong nghiên cứu này, để xác định các mẫu lá khoai tây có triệu chứng nhiễm PVY thu đƣợc từ 5 cánh đồng khoai tây trên có chính xác là bị nhiễm PVY hay không, chúng tôi tiến hành phân lập và xác định trình tự gen CP của PVY.
3.2. KẾT QUẢ NHÂN GEN, TÁCH DÒNG cDNA 3.2.1. Kết quả nhân gen bằng kỹ thuật RT-PCR
Chúng tôi đã thu thập một số mẫu lá khoai tây có triệu chứng nhiễm PVY từ 5 cánh đồng khoai tây: Phổ Yên, Phú Bình, Thái Bình, Hƣng Yên, Bắc Giang. Sau đó, tiến hành phân lập gen CP của PVY từ các mẫu lá khoai tây này.
Trước tiên, chúng tôi tiến hành tách chiết RNA tổng số từ mẫu lá có triệu chứng nhiễm bệnh (theo quan sát bằng mắt thường) và tổng hợp cDNA từ RNA tổng số này. Gen CP được nhân lên bằng phương pháp PCR với cặp mồi đặc hiệu đƣợc cung cấp bởi Phòng Công nghệ Tế bào Thực vật - Viện Công nghệ Sinh học:
Bảng 3.2. Trình tự mồi đặc hiệu nhân gen CP
Mồi Trình tự
PVYCPF1 5‟ GCYTTCACTGAAATGATGGT 3‟
PVYCPR1 5‟GTCTCCTGATTGAAGTTTACA3‟
Để kết quả nhân gen đƣợc chính xác, chúng tôi đã lặp lại thí nghiệm 3 lần và có đối chứng dương (+), đối chứng âm (-) khi làm thí nghiệm. Sản phẩm PCR đƣợc điện di kiểm tra trên gel agarose 1%. Kết quả đƣợc thể hiện ở hình 3.2.
Có rất nhiều yếu tố có thể ảnh hưởng tới chất lượng của phản ứng RT- PCR nhƣ: Lƣợng RNA quá ít hoặc quá nhiều, nồng độ mồi quá cao hoặc quá thấp, nhiệt độ gắn mồi chƣa phù hợp…Vì vậy trong quá trình tiến phản ứng cần điều chỉnh hàm lƣợng các thành phần phản ứng (lƣợng mẫu, nồng độ mồi, Mg2+…),nhiệt độ gắn mồi, thời gian đối với mỗi bước của chu kì nhiệt…để phản ứng RT-PCR xảy ra đặc hiệu nhất.
Hình 3.2. Kết quả RT-PCR từ RNA của các mẫu lá khoai tây nghi nhiễm bệnh M: Marker DNA 1Kb
1: Hƣng Yên; 2: Bắc Giang; 3: Thái Bình1;
4: Thái Bình2; 5: Phổ Yên; 6: Phú Bình
(+) : Đối chứng dương - plasmid pTZ57R/T/CP-PVY (-) : Đối chứng âm-thành phần PCR không có RNA
Hình 3.2 cho thấy, chỉ mẫu lá khoai tây ở Phổ Yên-Thái Nguyên, Phú Bình-Thái Nguyên và plasmid mang gen PVY là có đoạn gen đƣợc nhân lên với kích thước khoảng 1200bp. Kích thước này phù hợp với tính toán khi thiết
kế mồi nhân gen. Vì vậy, chúng tôi kết luận đã nhân thành công đoạn gen có kích thước tương ứng với gen CP của PVY trên khoai tây từ 2 mẫu Phổ Yên và Phú Bình.
Từ kết quả RT-PCR chúng tôi kết luận:
- Các mẫu lá đƣợc nghi có triệu chứng bị bệnh PVY thu thập từ Hƣng Yên, Bắc Giang, Thái Bình không chứa PVY. Điều này có thể do khi thu thập mẫu quan sát bằng mắt thường nên nhầm lẫn với các bệnh hay loại virus khác.
Như vậy, phương pháp quan sát bằng mắt thường để xác định bệnh do PVY gây ra ở khoai tây sẽ không chính xác.
- Đã phân lập thành công đoạn gen có kích thước tương ứng với gen CP của PVY từ mẫu khoai tây ở Phổ Yên-Thái Nguyên và Phú Bình-Thái Nguyên. Để đƣa ra kết luận chính xác đoạn gen nhân đƣợc là gen CP từ PVY cần tiến hành tách dòng và đọc trình tự đoạn gen này.
3.2.2. Tinh sạch sản phẩm RT-PCR
Quá trình tách dòng đƣợc thực hiện bằng cách gắn sản phẩm PCR vào vector tách dòng. Tuy nhiên, sản phẩm PCR ngoài đoạn gen mong muốn ra còn rất nhiều sản phẩm phụ, các nucleotide dƣ thừa sau phản ứng, mồi, enzyme, đệm…Vì vậy để phản ứng ghép nối đạt đƣợc hiệu quả cao nhất cần thiết phải có quá trình tinh sạch sản phẩm PCR để loại bỏ các thành phần không mong muốn. Quy trình tinh sạch sản phẩm PCR (thôi gel) đƣợc thực hiện theo hướng dẫn của bộ kit QIAquick Gel Extraction.
Khi nâng nhiệt độ 500C thì agarose tan chảy, DNA đƣợc hoà vào dung dịch QG. Sau khi cho dung dịch vào cột tinh sạch QIAquick spin, DNA đƣợc giữ lại bởi các phân tử có ái lực cao với DNA cố định trên màng lọc của cột tinh sạch, dịch đệm QG và agarose bị loại đi nhờ li tâm. Để loại bỏ hết agarose còn bám trên màng lọc, cần thiết phải bổ sung QG vào cột lần thứ 2.
DNA đƣợc làm sạch bằng đệm rửa PE chứa 80% ethanol và đƣợc hoà tan
trong dịch đệm EB hoặc nước deion khử trùng. Bằng phương pháp này đã giữ lại với hiệu suất 85% trở lên.
Hình 3.3. Kết quả điện di DNA thu đƣợc từ kỹ thuật thôi gel trên agarose 1%
(M: Marker DNA 1Kb; 1: Phổ Yên; 2: Phú Bình)
Hình 3.3 cho thấy, sản phẩm thôi gel có hàm lƣợng cao, không bị đứt gẫy đảm bảo cho việc tiến hành các thí nghiệm tiếp theo.
3.2.3. Kết quả biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào khả biến E.coli DH5α Chúng tôi sử dụng vector tách dòng pBT do Phòng Công nghệ Tế bào Thực vật, Viện Công nghệ Sinh học cung cấp để tiến hành phản ứng ghép nối và biến nạp.
Sản phẩm RT-PCR sau khi tinh sạch đƣợc gắn vào vector pBT bởi enzyme T4 ligase. Phản ứng ghép nối dựa trên nguyên tắc bổ sung giữa hai đầu nucleotide A thò ra ở sản phẩm PCR với Taq polymerase và hai đầu nucleotide T trên vector tách dòng. Hỗn hợp phản ứng đƣợc ủ ở nhiệt độ phòng trong 2 giờ để phản ứng xảy ra hoàn toàn. Vector tái tổ hợp sau đó đƣợc biến nạp vào tế bào khả biến E.coli chủng DH5α và đƣợc cấy trải trên môi trường LB đặc có bổ sung ampicillin 100mg/l, X-gal 40mg/ml và IPTG 100M. Ủ đĩa petri ở 370C trong 16 giờ.
Thành công của thí nghiệm này phụ thuộc vào rất nhiều yếu tố, nhƣng có 2 yếu tố quan trọng nhất:
+ Sản phẩm PCR phải đặc hiệu, chất lƣợng tốt.
+ Tế bào khả biến phải đƣợc chuẩn bị tốt mới đạt đƣợc hiệu suất biến nạp cao nhất.
Chúng tôi đã thu đƣợc một lƣợng lớn khuẩn lạc gồm cả khuẩn lạc xanh và khuẩn lạc trắng. Các khuẩn lạc xanh có thể mọc lên từ tế bào nhận đƣợc plasmid tự đóng vòng trở lại nên gen lac-operon hoạt động tổng hợp enzyme β-galactosidase. Enzyme này sẽ chuyển hoá cơ chất X-gal thành hợp chất có màu xanh dưới sự cảm ứng của IPTG. Còn những khuẩn lạc trắng xuất hiện là do vi khuẩn nhận đƣợc plasmid mang lac-operon không hoạt động, enzyme β- galactosidase không đƣợc tạo nên không có quá trình chuyển hoá X-gal thành dạng màu xanh. Lac-operon bị bất hoạt có thể do đoạn gen ngoại lai xen vào giữa promotor của operon gen LacZ làm cho lac-promotor không thể điều khiển quá trình tổng hợp enzyme. Đoạn gen ngoại lai có thể là đoạn gen CP- PVY nguyên vẹn hoặc cũng có thể là những đoạn bị đứt gãy. Các khuẩn lạc trắng có thể là những khuẩn lạc vệ tinh không mang plasmid. Khuẩn lạc vệ tinh có kích thước nhỏ, được mọc lên xung quanh các khuẩn lạc có plasmid chứa đoạn gen xen vào sau khi khuẩn lạc này đã phân huỷ đáng kể lƣợng kháng sinh trong môi trường xung quanh.
Để nhân đƣợc dòng tế bào mang plasmid tái tổ hợp chứa đoạn gen CP cần phải tiến hành chọn lọc plasmid tái tổ hợp bằng cách PCR trực tiếp từ khuẩn lạc (colony-PCR) để loại bỏ các trường hợp không mong muốn.
3.2.4. Kết quả chọn lọc plasmid tái tổ hợp bằng colony-PCR
Tiến hành PCR trực tiếp từ một số khuẩn lạc trắng với cặp mồi pUC18- F1/pUC18-R1 để xác định khuẩn lạc có thể mang gen CP. Chỉ sử dụng cặp mồi này chứ không sử dụng cặp mồi đặc hiệu nằm trong gen vì trong phản
ứng gắn gen vào vector, một lƣợng lớn gen không đƣợc gắn vào vector vẫn tồn tại trong hỗn hợp phản ứng, do đó khi cấy trải lên đĩa thạch các gen này nằm rải rác trên đĩa thạch và có thể nằm ngay dưới hoặc xung quanh các khuẩn lạc. Do đó, phản ứng colony-PCR sẽ bị gây nhiễm và kết quả không chính xác
Hình 3.4. Kết quả colony-PCR một số dòng khuẩn lạc với mẫu Phổ Yên M: Marker DNA 1Kb
1-7: Dòng khuẩn lạc số 1-7
(+) : Đối chứng dương - plasmid pTZ57R/T/CP-PVY (-1) : Đối chứng âm – dòng khuẩn lạc xanh (-2) : Đối chứng âm – Thành phần PCR không có khuẩn lạc
Bảng 3.3. Trình tự mồi để thực hiện colony-PCR
Tên mồi Trình tự
pUC18-F1 5‟ - GAGGGTTTTCCCAGTCACGA – 3‟ pUC18-R1 5‟ - GCGGATAACAATTTCACACA – 3‟
Hình 3.5. Kết quả colony-PCR một số dòng khuẩn lạc với mẫu Phú Bình M: Marker DNA 1Kb
8-9: Dòng khuẩn lạc số 8-9
Từ kết quả điện di cho thấy, sản phẩm colony PCR từ 9 dòng khuẩn lạc trắng có 7 dòng cho kết quả dương tính đó là các dòng 1, 2, 4, 5, 6, 8, 9.
3.2.5. Kết quả tách plasmid từ các khuẩn lạc của 2 mẫu nghiên cứu
A B
Hình 3.6. Kết quả điện di tách plasmid mang gen CP (A: Mẫu Phổ Yên; B: Mẫu Phú Bình)
Chúng tôi chọn khuẩn lạc trắng của dòng 1 và dòng 2 với mẫu Phổ Yên;
dòng 8 của mẫu Phú Bình để tách plasmid theo bộ kit của hãng Bioneer. Sản phẩm DNA plasmid đƣợc điện di trên gel agarose 1%. Kết quả đƣợc thể hiện ở hình 3.6.
Kết quả điện di trên hình 3.6 cho thấy, sản phẩm tách plasmid sạch, đảm bảo chất lƣợng và số lƣợng để tiến hành đọc trình tự nucleotide của gen CP.