Chương 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
3.3. KẾT QUẢ SO SÁNH TRÌNH TỰ GEN CP CỦA PVY TỪ HAI MẪU
Trình tự nucleotide của gen CP đƣợc xác định trên máy đọc tự động ABI PRISM® 3100 Avant Genetic Analyzer theo hai chiều xuôi và ngƣợc.
Khi so sánh 2 trình tự này trong BLAST của NCBI, kết quả cho biết đây là các trình tự gen mã hoá CP của PVY ở khoai tây. Chiều dài gen CP ở 2 mẫu Phổ Yên và Phú Bình đều có kích thước 1201 nucleotide, đoạn mã hóa dài 801 nucleotide, protein dài 267 acid amine. Chúng tôi kết luận đã nhân, tách dòng và đọc trình tự thành công đoạn gen mã hoá CP của PVY trên khoai tây.
3.3.1. So sánh trình tự nuclotide và acid amine của gen CP-PVY trên 2 mẫu nghiên cứu
....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
10 20 30 40 50 Pho Yen GGAAATGACA CAATCGATGC AGGAGGAAGC ACTAAGAAGG ATGCAAAACA
Phu Binh GCAAATGACA CAATTGATGC AGGAGAAAGC AACAAGAAAG ATGCAAAACC ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
60 70 80 90 100 Pho Yen AGAGCAAGGT AGCATTCAAC CAAATCTCAA CAAGGAAAAG GAAAAGGACG
Phu Binh AGAGCAAGGC AGCATCCAGT CAAACCTGAA CAAAGGAAAA GATAAGGATG ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
110 120 130 140 150 Pho Yen TGAATGTTGG AACATCTGGA ACTCATACTG TGCCACGAAT TAAAGCTATC Phu Binh TGAATGCTGG TACATCTGGG ACACATACTG TGCCGAGAAT CAAGGCTATC
....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
160 170 180 190 200 Pho Yen ACGTCCAAAA TGAGAATGCC CAAGAGTAAA GGTGCAACTG TACTAAATTT Phu Binh ACGTCCAAAA TGAGAATGCC CAAAAGCAAG GGAGCAACCG TGCTAAATTT
....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
210 220 230 240 250 Pho Yen GGAACACTTA CTCGAGTATG CTCCACAGCA AATTGACATC TCAAATACTC Phu Binh AGAACACTTG CTTGAGTACG CTCCACAACA AATTGATATT TCAAATACTC
....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
260 270 280 290 300 Pho Yen GAGCAACTCA ATCACAGTTT GATACGTGGT ATGAAGCGGT ACAACCTGCA Phu Binh GGGCAACTCA ATCACAGTTT GATGCGTGGT ATGAGGCAGT GCGGATGGCA
....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
310 320 330 340 350 Pho Yen TACGACATAG GAGAAACTGA AATGCCAACT GTGATGAATG GGCTTATGGT Phu Binh TACGACATAG GAGAAACTGA GATGCCAACT GTGATGAATG GGCTTATGGT
....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
360 370 380 390 400 Pho Yen TTGGTGCATT GAAAATGGAA CCTCGCCAAA CATCAACGGA GTTTGGGTTA Phu Binh TTGGTGCATT GAAAATGGAA CCTCGCCAAA TGTCAACGGA GTTTGGGTTA
....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
410 420 430 440 450 Pho Yen TGATGGATGG AGATGAACAA GTCGAATACC CACTGAAACC AATCGTTGAG Phu Binh TGATGGATGA GAATGAACAA GTTGAGTACC CGTTGAAACC AATCGTTGAG
....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
460 470 480 490 500 Pho Yen AATGCAAAAC CAACACTTAG GCAAATCATG GCACATTTCT CAGATGTTGC Phu Binh AATGCAAAAC CAACCCTTAG GCAAATCATG GCACATTTCT CAGATGTTGC
....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
510 520 530 540 550 Pho Yen AGAAGCGTAT ATAGAAATGC GCAACAAAAA GGAACCATAT ATGCCACGAT Phu Binh AGAAGCGTAT ATAGAAATGC GCAACAAAAA GGAACCATAT ATGCCACGAT
....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
560 570 580 590 600 Pho Yen ATGGTTTAGT TCGTAATCTG CGCGATGGAA GTTTGGCTCG CTATGCTTTT Phu Binh ATGGTTTAAT TCGAAATCTG CGGGATGTGG GTTTAGCGCG TTATGCCTTT ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
610 620 630 640 650 Pho Yen GACTTTTATG AGGTCACATC ACGAACACCA GTGAGGGCTA GGGAAGCGCA Phu Binh GACTTTTATG AAGTCACATC ACGAACACCA GTGAGGGCTA GGGAAGCGCA ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
660 670 680 690 700 Pho Yen CATTCAAATG AAGGCCGCAG CATTGAAATC AGCCCAACCT CGACTTTTCG Phu Binh CATTCAAATG AAGGCCGCAG CATTGAAATC AGCCCAACCT CGACTTTTCG ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
710 720 730 740 750 Pho Yen GGTTGGACGG TGGCATCAGT ACACAAGAGG AGAACACAGA GAGGCACACC Phu Binh GGTTGGACGG TGGCATCAGT ACACAAGAGG AGAACACAGA GAGGCACACC ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
760 770 780 790 800 Pho Yen ACCGAGGATG TCTCTCCAAG TATGCATACT CTACTTGGAG TCAAGAACAT Phu Binh ACCGAGGATG TCTCTCCAAG TATGCATACT CTACTTGGAG TCAAGAACAT .
Pho Yen G Phu Binh G
Hình 3.7. So sánh trình tự nucleotide của gen CP-PVY trên 2 mẫu nghiên cứu
....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
10 20 30 40 50 Pho Yen GNDTIDAGGS TKKDAKQEQG SIQPNLNKEK EKDVNVGTSG THTVPRIKAI
Phu Binh ANDTIDAGES NKKDAKPEQG SIQSNLNKGK DKDVNAGTSG THTVPRIKAI ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
60 70 80 90 100 Pho Yen TSKMRMPKSK GATVLNLEHL LEYAPQQIDI SNTRATQSQF DTWYEAVQPA
Phu Binh TSKMRMPKSK GATVLNLEHL LEYAPQQIDI SNTRATQSQF DAWYEAVRMA ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
110 120 130 140 150
Pho Yen YDIGETEMPT VMNGLMVWCI ENGTSPNING VWVMMDGDEQ VEYPLKPIVE Phu Binh YDIGETEMPT VMNGLMVWCI ENGTSPNVNG VWVMMDENEQ VEYPLKPIVE ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
160 170 180 190 200 Pho Yen NAKPTLRQIM AHFSDVAEAY IEMRNKKEPY MPRYGLVRNL RDGSLARYAF Phu Binh NAKPTLRQIM AHFSDVAEAY IEMRNKKEPY MPRYGLIRNL RDVGLARYAF ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
210 220 230 240 250 Pho Yen DFYEVTSRTP VRAREAHIQM KAAALKSAQP RLFGLDGGIS TQEENTERHT Phu Binh DFYEVTSRTP VRAREAHIQM KAAALKSAQP RLFGLDGGIS TQEENTERHT ....|....| ....|..
260 Pho Yen TEDVSPSMHT LLGVKNM Phu Binh TEDVSPSMHT LLGVKNM
Hình 3.8. So sánh trình tự acid amine của gen CP-PVY trên 2 mẫu nghiên cứu Trình tự gen CP-PVY từ 2 mẫu nghiên cứu có sự sai khác ở 71 vị trí nuleotide. Do đó có thể thấy, mức độ tương đồng giữa 2 trình tự này tương đối thấp (91,1%). So sánh protein suy diễn từ 2 trình tự gen này cho thấy mức độ sai khác là 6,4%. Sự biến động về trình tự nucleotide giữa 2 gen không đồng đều, trong khi có những vùng biến động lớn (nhƣ vùng 2 đến 144) thì có những vùng không biến động một nuleotide nào (nhƣ vùng từ 613 đến 801).
Sự sai khác về nucleotide dẫn đến sự sai khác về acid amin, tuy vậy có những vùng có sự sai khác về nuleotide không dẫn tới sự sai khác vế acid amin (nhƣ vùng nucleotide từ 108 đến 273).
3.3.2. So sánh trình tự nuclotide gen CP-PVY trên 2 mẫu nghiên cứu với các trình tự gen CP-PVY trên khoai tây đã đƣợc công bố trong ngân hàng gen
Để thấy đƣợc sự đa dạng di truyền ở mức phân tử của PVY, chúng tôi tiến hành so sánh 2 trình tự gen PVY phân lập từ Phú Bình và Phổ Yên với một số trình tự gen PVY khác trên Ngân hàng gen quốc tế NCBI.
Bảng 3.4. 19 trình tự trong ngân hàng gen đƣợc đƣa ra so sánh
Sử dụng phần mềm DNAstar và BioEdit để so sánh các trình tự gen, lập bảng hệ số tương đồng và biểu đồ hình cây biểu diễn quan hệ di truyền của gen CP-PVY ở 2 mẫu nghiên cứu với 19 trình tự trên.
Mã số Chủng
(biến thể) Nước Mã số Chủng
(biến thể) Nước
DQ925437 PVYNTN Hà Nội-Việt
Nam U91747 PVYN USA
M95491 PVYNTN Hungary X97895 PVYN Switzerland
X79305 PVYNTN Austria Z70237 PVYN Polan
X92078 PVYNTN Lebanon AF118153 PVYO India
AJ890345 PVYNTN Germany AY792597 PVYO China
EF016294 PVYNTN UK D12539 PVYO Japan
AB205416 PVYN Japan U09509 PVYO Canada
AF255660 PVYN Brazil X14136 PVYO Argentina
AM268435 PVYN New Zealand X68222 PVYO USA
Z70239 PVYO Poland
Hình 3.9. Biểu đồ hình cây biểu diễn mối quan hệ di truyền của CP-PVY phân lập đƣợc từ Phổ Yên và Phú Bình với 19 trình tự trong ngân hàng gen
Kết quả phân tích cho thấy, trình tự gen CP-PVY của 2 mẫu Phổ Yên, Phú Bình có độ tương đồng khá cao (từ 89,3% đến 99,6%) so với các trình tự CP-PVY của các chủng PVY đã công bố. Nhƣ vậy, có thể đƣa ra kết luận: đã phân lập đƣợc thành công gen CP của PVY chứ không phải của một loại virus nào khác.
Trình tự CP-PVY của mẫu ở Phổ Yên có độ tương đồng từ 89,9% đến 91,6% so với các trình tự thuộc chủng PVYO; từ 96,4% đến 97,4% so với các trình tự thuộc chủng PVYN; từ 98,6% đến 99,6% so với các trình tự thuộc chủng PVYNTN. Như vậy, trình tự CP-PVY phân lập từ Phổ Yên có độ tương đồng với các trình tự CP của các chủng PVYNTN cao hơn so với các trình tự thuộc chủng khác. Trong đó, nó có độ tương đồng cao nhất (99,6%) với trình
tự có mã số EF016294. Điều này chứng tỏ PVY phân lập tại Phổ Yên-Thái Nguyên thuộc chủng PVYNTN.
Trình tự CP-PVY phân lập từ Phú Bình có độ tương đồng từ 94,6% đến 98,5% so với các trình tự thuộc chủng PVYO; 90,8% đến 91,5% so với các trình tự thuộc chủng PVYNTN; 89,3% đến 89,6% so với các trình tự thuộc chủng PVYN. Như vậy, trình tự CP-PVY của mẫu ở Phú Bình có độ tương đồng với các trình tự thuộc chủng PVYO cao hơn so với các trình tự thuộc chủng khác. Trong đó, nó có độ tương đồng cao nhất (98/5%) với trình tự có mã số Z70239. Điều này chứng tỏ PVY phân lập tại Phú Bình-Thái Nguyên thuộc chủng PVYO.
Kết quả này cũng phù hợp với phân tích biểu đồ hình cây biểu diễn quan hệ di truyền của gen CP-PVY phân lập từ Phổ Yên, Phú Bình với 19 trình tự trong ngân hàng gen. Biểu đồ này cho thấy 21 trình tự đƣợc chia thành 2 nhóm lớn. Nhóm I lại đƣợc chia thành 2 nhóm phụ. Nhóm phụ I1 gồm các trình tự thuộc chủng PVYNTN và Phổ Yên. Nhóm phụ I2 gồm các trình tự của chủng PVYO và Phú Bình.
Theo nghiên cứu của Mohamad Chikh Ali và cs , vị trí acid amine thứ 29 của gen CP-PVY là Gly29 bảo thủ cho các chủng PVYO, PVYC, PVYNW.
Trong khi Gln17 và Glu31 lại bảo thủ trong gen CP của PVYN/PVYNTN (Chikh Ali và cs, 2007) [24]. Trình tự acid amine của CP-PVY của 2 mẫu Phổ Yên và Phú Bình hoàn toàn phù hợp với nhận định của Chikh Ali.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 54 http://www.Lrc-tnu.edu.vn
Bảng 3.5. Hệ số giống và khác nhau về trình tự nucleotide vùng mã hoá của gen CP ở mẫu nghiên cứu so với các mẫu trên ngân hàng NCBI
Hệ số khác nhau (%)
Hệ số giống nhau (%)