Nghiên cứu nâng cấp tiêu chuẩn dược liệu rễ ba kích (radix morindae officinalis) của việt nam

Quy trình phân tích mã vạch ADN cho thực vật Mã vạch ADN DNA barcoding, chỉ thị ADN là một hoặc nhiều đoạn gen ngắn, chuẩn của các loài sinh vật đã được xác định nằm trong ngân hàng gen,[r]

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI PHẠM VĂN KIỀN NGHIÊN CỨU NÂNG CẤP TIÊU CHUẨN DƯỢC LIỆU RỄ BA KÍCH (RADIX MORINDAE OFFICINALIS) CỦA VIỆT NAM LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC HỌC HÀ NỘI, NĂM 2021 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI PHẠM VĂN KIỀN NGHIÊN CỨU NÂNG CẤP TIÊU CHUẨN DƯỢC LIỆU RỄ BA KÍCH (RADIX MORINDAE OFFICINALIS) CỦA VIỆT NAM LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC HỌC CHUYÊN NGÀNH: KIỂM NGHIỆM THUỐC VÀ ĐỘC CHẤT MÃ SỐ: 62720410 Người hướng dẫn khoa học: PGS TS Đoàn Cao Sơn PGS TS Bùi Hồng Cường HÀ NỘI, NĂM 2021 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng tơi Các số liệu, kết trình bày luận án trung thực phần đề tài cấp nhà nước “Nghiên cứu thành phần hóa học, tạo chế phẩm có tác dụng sinh học rễ Ba kích Việt Nam (Radix Morindae officinalis)”, mã số CNHD.ĐT.075/16- 18, thuộc Chương trình “Khoa học cơng nghệ trọng điểm quốc gia phát triển cơng nghiệp hóa dược đến năm 2020” mà tơi có tham gia đồng ý Chủ nhiệm đề tài NCS PhạmVăn Kiền LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành luận án này, tơi nhận giúp đỡ tận tình có hiệu nhiều cá nhân, tập thể, thầy cô giáo, đồng nghiệp, bạn bè gia đình Với lịng kính trọng biết ơn sâu sắc, tơi xin cảm ơn PGS TS Đồn Cao Sơn – Viện trưởng Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương PGS TS Bùi Hồng Cường – Phó trưởng Bộ mơn Dược học Cổ truyền, Trường Đại học Dược Hà Nội, người thầy tận tình hướng dẫn tơi suốt q trình thực hồn thành luận án Tơi xin trân trọng cảm ơn Ban Giám hiệu Trường Đại học Dược Hà Nội, Phòng Đào tạo Sau đại học, GS TS Thái Nguyễn Hùng Thu, thầy, cô Bộ mơn Hóa phân tích – Độc chất, Trường Đại học Dược Hà Nội tạo điều kiện, tận tình giúp đỡ chia sẻ kinh nghiệm để tơi hồn thành luận án Tơi xin trân trọng cảm ơn Bộ Cơng thương cấp kinh phí cho Đề tài cấp nhà nước “Nghiên cứu thành phần hóa học, tạo chế phẩm có tác dụng sinh học rễ Ba kích Việt Nam (Radix Morindae officinalis)”, mã số CNHD.ĐT.075/16-18 PGS TS Trần Việt Hùng – Viện trưởng Viện Kiểm nghiệm thuốc Tp Hồ Chí Minh, chủ nhiệm đề tài cho phép tham gia sử dụng kết đề tài Tôi xin trân trọng cảm ơn Ban lãnh đạo Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương anh, chị, em đồng nghiệp Khoa Kiểm nghiệm Đông dược dược liệu, Khoa Thiết lập chất chuẩn chất đối chiếu – Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương, Khoa Vi sinh – Viện Kiểm nghiệm thuốc Tp Hồ Chí Minh hỗ trợ, giúp đỡ tạo điều kiện cho tơi q trình thực nghiệm để tơi hồn thành luận án Cuối cùng, tơi xin chân thành cảm ơn gia đình tơi người bạn, đồng nghiệp ln ủng hộ, động viên khích lệ tơi hồn thành cơng trình nghiên cứu Hà Nội, ngày 11 tháng năm 2021 NCS Phạm Văn Kiền MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT i DANH MỤC CÁC BẢNG, BIỂU iv DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, SƠ ĐỒ viii ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Dược liệu rễ Ba kích (Radix Morindae officinalis) 1.1.1 Vị trí phân loại Ba kích 1.1.2 Đặc điểm hình thái 1.1.3 Phân bố, thu hái, chế biến 1.1.4 Thành phần hoá học 1.1.5 Tác dụng dược lý 1.1.6 Tiêu chuẩn chất lượng dược liệu rễ Ba kích 1.2 Monotropein nystose 1.2.1 Monotropein 1.2.2 Nystose 1.3 Tình hình thiết lập chất chuẩn monotropein nystose 13 1.3.1 Tình hình thiết lập chất chuẩn monotropein, nystose giới Việt Nam 13 1.3.2 Phân lập, tinh chế monotropein nystose từ Ba kích 15 1.4 Phương pháp phân tích trình tự ADN định danh loài Morinda officinalis How 16 1.4.1 Quy trình phân tích mã vạch ADN cho thực vật 17 1.4.2 Phương pháp khuếch đại gen (PCR) 17 1.4.3 Các trình tự gen thường dùng cho thực vật 20 1.4.4 Nghiên cứu đa dạng di truyền lồi Morinda officinalis How 24 1.6 Tính cấp thiết luận án 25 CHƯƠNG II ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 27 2.1 Đối tượng nghiên cứu 27 2.2 Phương tiện nghiên cứu 27 2.2.1 Chất chuẩn dược liệu chuẩn 27 2.2.2 Hóa chất thuốc thử 28 2.2.3 Thiết bị, dụng cụ 28 2.3 Phương pháp nghiên cứu 29 2.3.1 Thẩm định phương pháp định tính, định lượng monotropein nystose 29 2.3.2 Chiết xuất, phân lập, tinh chế monotropein nystose từ dược liệu rễ Ba kích 37 2.3.3 Thiết lập chất chuẩn monotropein nystose 38 2.3.4 Định danh dược liệu rễ Ba kích Việt Nam dựa số thị ADN 44 2.3.5 Nâng cấp chuyên luận dược liệu rễ Ba kích Dược điển Việt Nam số tiêu định tính, định lượng 49 CHƯƠNG III KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 50 3.1 Xây dựng, thẩm định phương pháp định tính, định lượng monotropein nystose 50 3.1.1 Xây dựng, thẩm định phương pháp định tính, định lượng monotropein 50 3.1.2 Thẩm định phương pháp định tính, định lượng nystose 58 3.1.3 Thẩm định phương pháp định tính nystose dược liệu rễ Ba kích phương pháp sắc ký lớp mỏng 66 3.2 Chiết xuất, phân lập, tinh chế monotropein nystose từ dược liệu rễ Ba kích68 3.2.1 Chiết xuất cao chiết tồn phần chứa monotropein nystose 68 3.2.2 Phân lập tinh chế monotropein 69 3.2.3 Phân lập tinh chế nystose 71 3.2.4 Xác định liệu nhận dạng nguyên liệu thiết lập chất chuẩn 73 3.3 Thiết lập chất chuẩn monotropein nystose 75 3.3.1 Thiết lập chất chuẩn monotropein 76 3.3.2 Thiết lập chất chuẩn nystose 84 3.3.3 Định tính, định lượng monotropein nystose dược liệu rễ Ba kích 92 3.4 Định danh dược liệu rễ Ba kích Việt Nam dựa số thị ADN 96 3.4.1 Chiết tách ADN toàn phần từ dược liệu 96 3.4.2 Nhân đoạn gen 97 3.4.3 Giải trình tự gen định danh dược liệu 98 3.5 Nâng cấp chuyên luận dược liệu rễ Ba kích Dược điển Việt Nam số tiêu định tính định lượng 101 3.5.1 Bổ sung tiêu định tính, định lượng vào chuyên luận dược liệu rễ Ba kích Dược điển Việt Nam 101 3.5.2 Dự thảo chuyên luận dược liệu rễ Ba kích Dược điển Việt Nam VI 102 CHƯƠNG BÀN LUẬN 109 4.1 Thẩm định phương pháp định tính, định lượng monotropein nystose 109 4.1.1 Phương pháp định tính, định lượng monotropein nguyên liệu dược liệu rễ Ba kích 109 4.1.2 Phương pháp định tính, định lượng nystose nguyên liệu dược liệu rễ Ba kích 111 4.1.3 Thẩm định phương pháp định tính nystose dược liệu TLC 113 4.2 Chiết xuất, phân lập tinh chế monotropein nystose từ dược liệu rễ Ba kích 113 4.2.1 Chiết cao toàn phần 113 4.2.2 Phân lập, tinh chế monotropein 114 4.2.3 Phân lập, tinh chế nystose 115 4.2.4 Xác minh cấu trúc monotropein nystose tinh chế 116 4.3 Thiết lập chất chuẩn monotropein nystose 117 4.4 Định danh dược liệu rễ Ba kích Việt Nam dựa số thị ADN 120 4.5 Nâng cấp chuyên luận dược liệu rễ Ba kích Dược điển Việt Nam số tiêu định tính, định lượng 126 4.5.1 Bổ sung tiêu định tính 126 4.5.2 Bổ sung tiêu định lượng 128 4.6 Những đóng góp luận án 130 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 131 Kết luận 131 Kiến nghị 131 TÀI LIỆU THAM KHẢO 133 DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT ADN : Acid Deoxyribo Nucleic ARN : Acid ribonucleic AFLP APG II : Amplified Fragment Length Polymorphism – Đa hình độ dài đoạn nhân chọn lọc : Angiosperm Phylogeny Group II - Nhóm phát sinh chủng lồi thực vật hạt kín ARS : ASEAN Reference Standards - Chất chuẩn khu vực ASEAN CBOL : Consortium for the Barcode of Life cpDNA : Chloroplast Deoxyribo Nucleic Acid - Bộ gen lục lạp ptDNA : Plasma tumor Deoxyribo Nucleic Acid - Bộ gen lạp thể DĐVN : Dược điển Việt Nam DNA : Deoxyribo Nucleic Acid dNTP : Deoxynucleoside triphosphate dATP : Deoxyadenosine triphosphate dCTP : Deoxycytidine triphosphate dGTP : Deoxyguanosine triphosphate EDTA : Ethylenediaminetetraacetic acid ELSD : Evaporative light scattering detector - Detector tán xạ bay EPRS : EP Reference Standards - Chất chuẩn Dược điển Châu Âu EtOH : Ethanol ETS : External transcribed spacer – Vùng mã ngồi gene FHH HPLC-DAD : Diễn đàn hịa hợp thuốc thảo dược nước Tây Thái Bình Dương : Sắc ký lỏng hiệu cao detector mảng diod i HPLC-ELSD : Sắc ký lỏng hiệu cao detector tán xạ bay FOS : Fructo Oligo Saccharid ICRS : Chất chuẩn Dược điển Quốc tế IGS : Intergenic spacer – vùng chen gene IR : Vùng gen lặp lại đảo ngược (inverted repeat - IR) ISSR : Inter-Simple Sequence Repeats – Chuỗi lặp lại đơn giản ITS : Internal transcribed spacer KNV : Kiểm nghiệm viên LDL : Low density lipoprotein LSC : large single copy – vùng đơn gen lớn matK : Maturase K MeOH : Methanol mRNA : Messenger Ribonucleic acid NCBI : National Center for Biotechnology Information PTN : Phòng thử nghiệm PCR : Polymerase chain reaction – Kỹ thuật khuếch đại gen QTL : Quantiative Trait loci RAPD : Random Amplified Polymorphic DNA rbcL : Rubisco large subunit gene SKLM : Sắc ký lớp mỏng SSC : Small single copy - Vùng đơn gen nhỏ TBE : Tris/Borate/EDTA TCCL : Tiêu chuẩn chất lượng TLC : Thin layer chromatography – Sắc ký lớp mỏng TIS : Transcription start site – Điểm khởi đầu chép TRIS : Tris(hydroxymethyl)aminomethane ii ... Ba kích Định danh dược liệu rễ Ba kích Việt Nam dựa số thị ADN Nâng cấp chuyên luận dược liệu rễ Ba kích Dược điển Việt Nam số tiêu định tính định lượng CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Dược liệu rễ Ba kích. .. chuẩn từ nước Về tiêu chuẩn chất lượng dược liệu rễ Ba kích, Dược điển Trung Quốc, Bộ tiêu chuẩn dược liệu Hồng Kông Dược điển Việt Nam có chun luận dược liệu rễ Ba kích Trong đó, chun luận Ba. .. năm gần đây, nhu cầu sử dụng dược liệu rễ Ba kích chế phẩm từ dược liệu rễ Ba kích ngày tăng Thị trường dược liệu rễ Ba kích đa dạng, bao gồm nguồn cung cấp dược liệu nhập từ Trung Quốc, trồng