Tách và xác định β-Lactam trong đối tượng sinh học bằng phương pháp điện di mao quản

Tách và xác định β-Lactam trong đối tượng sinh học bằng phương pháp điện di mao quản

MỤC LỤC

Bảng 1.1 Phân loại và cấu trúc một số penicillin 3Bảng 1.2 Phân loại và cấu trúc một số cephalosporin 5Bảng 1.3 Hằng số axit của các kháng sinh nghiên cứu 6

1.2 Tình hình lạm dụng kháng sinh ở Việt Nam và trên thế giới hiện nay 7Hình 2.1 Sơ đồ nguyên tắc cấu tạo của hệ điện di mao quản 16

Hình 2.2 Cấu trúc của các Mixen và dòng EOF trong MEKC 20

Từ phương trình Hi = k1.Ci khi tăng nồng độ chất phân tích thì chiều cao pic sắc ký cũng tăng lên, song lý thuyết chỉ ra rằng tỉ lê đó chỉ đúng

trong một khoảng nhất định Vì vậy chúng tôi phải khảo sát khoảng tuyến tính của chất phân tích 48

Bảng 3.8 Chiều cao pic β-Lactam tại các nồng độ khác nhau 48Bảng 3.9 Giới hạn phát hiện của phương pháp 51

Bảng 3.13: Đánh giá độ lặp lại của phương pháp phân tích 55MỞ ĐẦU

Ngày nay, khi xã hội ngày càng phát triển thì vấn đề sức khỏe của con người ngày càng được chú trọng đặc biệt là các sản phẩm liên quan trực tiếp đến sức khỏe

β-Lactam là thuốc kháng sinh tổng hợp quan trọng chữa bệnh cho con người, thú y từ khi chúng được giới thiệu trên thị trường vào năm 1938 và là loại kháng sinh được dùng nhiều nhất hiện nay Liều lượng và cách dùng kháng sinh không đúng sẽ dễ bị vi khuẩn nhờn thuốc, kháng thuốc, từ đó việc chữa trị bệnh càng khó khăn Ngoài ra còn gây lãng phí cho người bệnh vì có các bệnh do virut không chữa được bằng kháng sinh nhưng vẫn dùng kháng sinh, gây khó khăn cho việc chuẩn đoán các bệnh và ảnh hưởng sức khỏe của người bệnh Hàm lượng lớn kháng sinh trong máu gây ra các bệnh về thận,

đặc biệt ở người cao tuổi Vì vậy kiểm soát và phân tích thuốc kháng sinh đối với người bệnh là biện pháp cần thiết để nâng cao hiệu quả sử dụng chúng.

Ở Việt Nam đã có rất nhiều công trình nghiên cứu tách và xác định đồng thời các kháng sinh β-Lactam trong các mẫu dược phẩm, sinh học, thực phẩm và môi trường chủ yếu là các công trình phân tích bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC Phương pháp HPLC là phương pháp tách chọn lọc, độ nhạy cao, lượng mẫu bơm ít thời gian phân tích ngắn Tuy nhiên phương pháp cũng có một số nhược điểm là phải sử dụng một lượng lớn dung môi để rửa cột, giá thành phân tích cao Ngược lại, phương pháp điện di mao quản điện động học kiểu Mixen (MEKC) lại sử dụng một lượng hóa chất không đáng kể, tiết kiệm chi phí từ 3 – 4 lần, lượng mẫu bơm nhỏ hơn trong HPLC hàng trăm lần, cỡ nl, cho độ tin cậy cao.

Tách và xác định đồng thời kháng sinh β-Lactam bằng phương pháp điện di mao quản điện động học kiểu Mixen (MEKC) trong mẫu dược phẩm và sinh học là một hướng nghiên cứu mới, song với ưu điểm của nó thì phương pháp sẽ ngày càng thông dụng được áp dụng nhiều trong phòng thí nghiệm và phân tích mẫu dịch vụ Vì vậy

chúng tôi quyết định chọn đề tài là “ Tách và xác định β-Lactam trong đối tượng sinh học bằng phương pháp điện di mao quản”

CHƯƠNG 1 - TỔNG QUAN

1.1 Giới thiệu về chất kháng sinh β-lactam [1,2,10,25]

Là các kháng sinh mà phân tử chứa vòng β-Lactam Gồm các nhóm: penicillin, cephalosporin, monobactam, cacbapenem trong đó hai nhóm sử dụng phổ biến và lớn nhất là penicillin và cephalosporin

Các penicillin thu được từ môi trường nuôi cấy nấm Penicilium notatum và Penicillium chryrogenum, bán tổng hợp từ axit 6-amino penicillanic (6APA).

Các cephalosporin tự nhiên được phân lập từ môi trường nuôi cấy nấm Cephalosporium acremonium và bán tổng hợp từ axit 7-amino cephalosporinic (7ACA) xuất phát từ các kháng sinh thiên nhiên

Cấu trúc và phân loại:* Các penicillin

Các penicillin đều có cấu trúc cơ bản gồm 2 vòng: vòng thiazolidin, vòng Lactam

Hình 1.1 Công thức cấu tạo các kháng sinh penicillin

3,3-dimethyl-7-oxo-4-thia-1-azabicyclo[3.2.0]heptane-2-carboxylic acid

Khi thay thế R bằng các gốc khác nhau, những cacbon bất đối có cấu hình 2S, 5R, 6R ta có các penicilin có độ bền, dược động học và phổ kháng khuẩn khác nhau Với M là gốc cation thường là: K, Na, H

Nhóm kháng sinh penicillin được chia thành 3 nhóm chính với hoạt tính khác nhau.

Bảng 1.1 Phân loại và cấu trúc một số penicillin

Gồm các Penicillin tự nhiên và dẫn chất.Phổ hẹp: vi khuẩn gram(+) Không kháng β-lactamase

Cloxacillin (CLO)

Cl N O

6-{[3-(2-chlorophenyl carbonyl]amino}

)-5-methyl-oxazole-4-Là các Penicillin bán tổng hợp Phổ hẹp như nhóm I Kháng penicilliiase, không tác động vào vòng β – Lactam được.

HO hydroxyphenyl)-acetyl]amino}

6-{[(2R)-2-amino-2-(4-Phổ rộng, tác dụng cả khuẩn gram (+) và (-) Không kháng β-

12345678

Hình 1.2 Công thức cấu tạo các kháng sinh cephalosporin

Tên gọi chung của các cephalosporin khi chưa có gốc R là: (6R,7R)

8-oxo-5-thia-1-azabicyclo[4.2.0]oct-2-ene-2-carboxylic acid

Khi thay đổi các gốc R, những cacbon bất đối có cấu hình 6R, 7R được các

cephalosporin có độ bền, tính kháng khuẩn và dược động học khác nhau.

Dựa vào khổ kháng khuẩn, chia các cephalosporin thành 4 thế hệ Các cephalosporin thế hệ trước tác dụng trên vi khuẩn gram dương mạnh hơn, nhưng trên gram âm yếu hơn thế hệ sau Trong bản luận văn này, chúng tôi chỉ trình bày thế hệ I (CEP) và thế hệ III (CEF)

Bảng 1.2 Phân loại và cấu trúc một số cephalosporin

III: Tác dụng tốt trên vi khuẩn gram

(-), trên vi khuẩn gram (+) thì tác dụng kém penicillin và cephalosporin thế hệ I Bền với β-

Cefixim (CEF)

NN

Cực đại hấp phụ chủ yếu do nhân phenyl, tùy vào cấu trúc khác làm dạng phổ thay đổi (đỉnh phụ, vai, sự dịch chuyển sang bước sóng ngắn hoặc dài, giảm độ hấp thụ).

tử Trong môi trường axit, kiềm, β-lactamase có tác dụng phân cắt khung phân tử, mở vòng β-lactam làm kháng sinh mất tác dụng.

Bảng 1.3 Hằng số axit của các kháng sinh nghiên cứu

Ngăn cản xây dựng và giảm độ bền của mang tế bào vi khuẩn nên chủ yếu kìm hãm sự tồn tại và phát triển của vi khuẩn Các kháng sinh β-lactam có hoạt phổ rộng.

Kháng thuốc:

Vi khuẩn sinh ra các β-lactamase, là enzim có tác dụng mở vòng β-lactam, theo phản ứng ái nhân vào nhóm C=O, làm kháng sinh mất tác dụng Tất cả các cách kháng không sinh ra β-lactamase để thực hiện gọi là kháng gián tiếp (được gọi là kháng methicillin).

Độc tính:

Các kháng sinh β-lactam độc tính thấp, nhưng cũng dễ gây dị ứng thuốc: dị ứng, mày đay, vàng da, gây độc với thận, rối loạn tiêu hóa…nguy hiểm nhất là sốc phản vệ

Thuốc không dùng cho trẻ sơ sinh và trong thời kỳ cho con bú Chống chỉ định dị ứng với thành phần của thuốc.

1.2 Tình hình lạm dụng kháng sinh ở Việt Nam và trên thế giới hiện nay

Như trên cho thấy, có nhiều loại kháng sinh khác nhau, tác động bằng các cơ chế khác nhau đối với các vi trùng khác nhau Kháng sinh chỉ có tác dụng với các bệnh do vi trùng (bacteria), không có tác dụng với các bệnh do siêu vi (virus) Để điều trị bệnh nhiễm trùng cần biết loại vi trùng gây bệnh để chọn kháng sinh thích hợp Vì thiếu hiểu biết và vì tin tưởng sai lầm, nên ở khắp nơi trên thế giới, nhất là ở các nước đang phát triển, người ta đã dùng kháng sinh quá nhiều, cả khi không cần thiết, không đúng chỉ định và không đúng cách.

Năm 2000, các bác sĩ Hoa kỳ viết 160 triệu toa thuốc kháng sinh cho 275 triệu người dân, một nửa đến 2/3 số toa đó được coi là không cần thiết.Theo R Gonzales [6,26], 3/4 số kháng sinh dùng ở ngoại chẩn là cho viêm đường hô hấp trên trong khi 60% các trường hợp viêm đường hô hấp trên là do siêu vi, không cần và không điều trị được bằng kháng sinh Dùng cephalosporins bừa bãi khiến enterococus trở nên đề kháng và cũng đã xuất hiện các vi trùng enterococus kháng vancomycin Theo báo cáo của A.W McCormick [13] năm 2003, tỉ lệ pneumococus kháng penicillin tăng nhanh ở Hoa kỳ, tác giả dự tính đến năm 2004, 41% pneumococcus sẽ đề kháng penicillin Tỉ lệ vi trùng lao kháng thuốc tăng cao khiến phải dùng 4 thứ thuốc kết hợp để điều trị bệnh lao

Các vi trùng kháng thuốc không khu trú ở một địa phương nào vì với phương tiện giao thông mau lẹ, vi trùng có thể di chuyển đến khắp nơi trên thế giới trong vòng 24 giờ D.P Raymond [17] mỗi năm ở Hoa kỳ có 2 triệu người bị nhiễm trùng vì lây lan trong bệnh viện, hơn một nửa số này là do vi trùng kháng thuốc, gây tử vong cho 70 ngàn người và làm tốn của ngân sách từ 5 đến 10 tỉ đô-la

Tại Việt Nam, theo báo cáo của Nguyễn Kim Phượng và J Chalker [4], năm 1997 tại 23 trạm y tế ở Hải phòng, 69% bệnh nhân được cho kháng sinh, 71% bệnh nhân không dùng kháng sinh đúng liều lượng và đúng thời gian (dưới 5 ngày)

Theo [4] Qua thống kê tại khoa Dị ứng - Miễn dịch lâm sàng Bệnh viện Bạch Mai cho thấy, hơn 70% bệnh nhân dị ứng do dùng kháng sinh, trong đó có không ít trẻ em Sốc phản vệ do dùng kháng sinh là tai biến nghiêm trọng nhất, dễ gây tử vong Nhiều trường hợp dị ứng thuốc gây giảm hồng cầu, bạch cầu, thiếu máu huyết tán, xuất huyết giảm tiểu cầu, tổn thương tế bào gan Phó giám đốc Bệnh viện Nhi Trung ương Nguyễn Văn Lộc thừa nhận, tiền mua kháng sinh đang chiếm tới 60% tổng kinh phí mua thuốc

E.coli (gây bệnh tiêu chảy, viêm phổi, nhiễm trùng huyết), tỉ lệ kháng thuốc ở Ampiciline là 88%, Amoxiciline là 38,9% Đối với vi khuẩn Klebsiella (gây bệnh nhiễm trùng huyết và viêm phổi), tỉ lệ kháng thuốc của Ampiciline gần 97% và Amoxiciline là 42%

Các nhà chuyên môn đã báo động về hậu quả nguy hiểm của sự lạm dụng kháng sinh từ nhiều chục năm nay Năm 1981, sau hội nghị ở Santa Domingo, các nhà chuyên môn đã thành lập “Liên Hiệp vì sự Sử Dụng Kháng Sinh Hợp Lý” (Alliance for the Prudent use of Antibiotics) có thành viên thuộc 93 quốc gia nhằm chống lại sự lan tràn của các bệnh do vi trùng kháng thuốc tại các nước đang phát triển

Năm 2001, Tổ Chức Y Tế Thế Giới đã đề ra “Kế Hoạch Toàn Cầu để Kiểm Soát Sự Đề Kháng Kháng Sinh” Kế hoạch đề cập đến mọi hoạt động y tế của tất cả các quốc gia đã phát triển cũng như đang phát triển: Phòng thí nghiệm phải tăng cường khả năng chẩn đoán các bệnh nhiễm trùng, giúp chẩn đoán nhanh chóng và chính xác, đo lường độ nhạy của kháng sinh, đo nồng độ kháng sinh trong máu Ngành dược cần cung cấp đầy đủ thuốc thiết yếu, ngăn ngứa sự lưu hành của các thuốc giả, 5% lượng thuốc lưu hành tại các nước đang phát triển là thuốc giả mạo, không đúng phẩm chất, hàm lượng hoặc không có hoạt chất……

Nếu ngăn ngừa được sự phát triển của các vi trùng kháng thuốc chúng ta sẽ bảo vệ được môi trường sống, duy trì được sự hữu hiêu của kháng sinh, hạn chế được chi phí về y tế và cứu đươc nhiều sinh mạng

1.3 Các phương pháp phân tích định lượng β-lactam 1.3.1 Phương pháp quang học

Phương pháp đo quang là phương pháp phân tích dựa trên tính chất quang học của chất cần phân tích như tính hấp thụ quang, tính phát quang… Các phương pháp này đơn giản, dễ tiến hành, thông dụng, được ứng dụng nhiều khi xác định β-lactam, đặc biệt trong dược phẩm.

Các β-lactam hấp thụ UV nhưng không nhiều cực đại hấp thụ, chúng cũng tạo phức với một số ion kim loại giúp nâng cao độ nhạy của phép đo Trong nhiều trường hợp, các β-lactam được thủy phân thành các chất đơn giản hơn để phân tích.

Các phương pháp phát quang có thể dùng xác định các β-lactam với độ nhạy khá cao dựa trên đặc tính tạo phức với ion kim loại hay phản ứng quang hóa của các β-lactam

AMP, với bước sóng kích thích 343nm, phát xạ 420nm có giới hạn phát hiện thu được

tốc độ phân tích cao, sử dụng để phân tích AMP trong thuốc uống, huyết thanh…

Theo [18], F Belal và cộng sự xác định AMO và AMP trong thuốc uống bằng

phương pháp phổ hấp thụ phân tử Phương pháp cải tiến sự thủy phân của kháng sinh

được đo tại bước sóng 335 nm Khoảng tuyến tính từ 8- 40 mg/l và giới hạn phát hiện của AMP là 0.73 mg/l, AMP 0.76 mg/l

Wei Liu và cộng sự [28], sử dụng phản ứng quang hóa của β-lactam với hệ

β-lactam (penicillin, cefradine, cefadroxil, CEP ) trong sữa đạt độ nhạy cao: PEN là 0.5

mg/l, cefradine 0.04 mg/l, cefadroxil là 0.08 mg/l, 0.1 mg/l CEP Kết quả được kiểm chứng lại bằng phương pháp HPLC, detector UV-VIS, nồng độ CEP trong mẫu là 0.1 mg/l

Tuy nhiên, nếu không kết hợp với phương pháp chiết pha rắn mắc nối tiếp, các phương pháp quang học chủ yếu chỉ dùng xác định riêng rẽ từng chất kháng sinh và trong các đối tượng có nhiều yếu tố ảnh hưởng hay chất tương tự chất phân tích, việc xác định sẽ kém chính xác Ngoài ra, trong nhiều trường hợp chất phân tích cần thủy phân mới phát hiện được cũng là sự hạn chế của phương pháp này.

1.3.2 Phương pháp điện hóa

Một số phương pháp điện hóa đã được ứng dụng để phân tích các β-lactam nhưng không phổ biến nhiều Theo [7], Daniela P Santos và cộng sự sử dụng sensor điện thế phân tích AMO, đạt giới hạn phát hiện 0.92 μM (0.39 mg/l) trong môi trường đệm axetat 0.1M pH=5.2.

1.3.3 Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)

Trong những năm gần đây, phương pháp HPLC đã đóng một vai trò vô cùng quan trọng trong việc tách và phân tích các chất trong mọi lĩnh vực khác nhau, nhất là trong việc tách và phân tích lượng vết các chất Phương pháp HPLC với cột tách pha đảo được sử dụng rất rộng rãi để xác định các kháng sinh β-lactam trong các loại mẫu khác nhau do có nhiều ưu thế so với các phương pháp khác vì có độ chính xác, độ nhạy, độ lặp lại cao, khoảng tuyến tính rộng…

Detector ghép nối trong máy HPLC cho phép phát hiện sự xuất hiện chất sau khi rửa giải Hiện nay có rất nhiều loại detector được sử dụng cho mục đích này đã mở rộng khả năng phân tích được rất nhiều loại chất bằng phương pháp HPLC Đối với phân tích dư lượng, detector khối phổ (MS) là một sự lựa chọn ưu tiên do có thể phát hiện và phân tích chất trong các đối tượng phức tạp.

Theo [29], Blanchflower WJ và cộng sự dùng HPLC – MS phân tích penicillin V, PENG, OXA, CLO, dicloxacillin trong thịt, thận và sữa Điều kiện chạy sắc ký: cột

Inertsil ODS2(4,6 mm×150 mm, 5 μm); pha động: ACN – (C2H5)3N 0,5% (45/55), dùng nafcillin làm nội chuẩn đạt giới hạn phát hiện trong sữa 2-10 μg/kg, trong thịt 25-100 μg/kg.

J.M Cha và cộng sự [19] dùng phương pháp HPLC – MS để phân tích β-lactam

mm, 2.5 μm); pha động: A = axit focmic 0,1%, B = Metanol (MeOH), C = Acetonitril (ACN); chạy gradient: bắt đầu A/B/C=90:5:5(v/v/v), 8 phút A/B/C=50:40:10, 20 phút A/

dụng phân tích AMO, AMP, oxacillin, CLO, cephapirin có giới hạn phát hiện của phương pháp là 8 – 10 ng/l với nước bề mặt, 13 – 18 ng/l với nước thải trước xử lý, 8 – 15 ng/l với nước thải sau xử lý.

Một detector quan trọng trong phương pháp HPLC là detector huỳnh quang, với ưu điểm tăng độ nhạy, độ chọn lọc cao Như trong [16] C.Y.W Yang và cộng sự dùng cột Spherisorb ODS2 (250 mm x 4,6 mm, 5 μm) phân tích AMO trong sữa bò (pha động: ACN/đệm photphat 10mM pH 5.6 – 24/76; detector huỳnh quang: 346 nm – 422 nm) đạt giới hạn phát hiện lần lượt 0.5 μg/kg và 0.3 μg/kg Tuy vậy, do các β-lactam ít tạo phức phát huỳnh quang và cơ chế phát quang dựa trên phản ứng quang hóa [24, 16] nên chỉ áp dụng với số ít chất hoặc phân tích riêng từng chất chứ không áp dụng phân tích đồng thời nhiều kháng sinh cùng lúc được.

Tác giả Ngô Quang Trung [5] đã xây dựng quy trình phân tích đồng thời 6 kháng sinh β_Lactam gồm: AMO, CEP, AMP, CLO, CEF, PENG trong nước thải bệnh viện tại khu vực Hà Nội Tác giả sử dụng cột tách Supelcosil ODS 250 mm x 4.6 mm, 5 µm, pha động gồm đệm axetat 12 mM pH 4, 70%; ACN 20%, MeOH 10% Detector UV-VIS đo ở bước sóng 212 nm Xây dựng đường chuẩn các kháng sinh trong khoảng 0.1 – 1 mg/l, hệ số tương quan R > 99.8% Giới hạn phát hiện LOD và LOQ là 0.4 và 0.1 mg/l

Ngoài ra, còn dùng các detector khác như detector điện hóa, detector độ dẫn… để phân tích các β-lactam.

Nói chung, khi phân tích kháng sinh trong các đối tượng mẫu phức tạp như thực phẩm, mẫu sinh học, mẫu nước thải, việc xử lý mẫu đối với các phương pháp đều đòi hỏi qui trình xử lý phức tạp do các kháng sinh liên kết chặt chẽ với nền mẫu và có nhiều chất nhiễu cần loại trừ.

1.3.4 Phương pháp điện di mao quản (Capillary electrophoresis - CE)

Gần đây, phương pháp CE được sử dụng rộng rãi do tính chất ưu việt về hiệu quả tách cao, thời gian tách ngắn, lượng mẫu tiêu tốn ít Phương pháp đã được ứng dụng để tách và xác định các kháng sinh β-lactam trong nhiều đối tượng mẫu khác nhau.

L Nozal, L Arce1,A.R´ıos, M Valcárcel [21] sử dụng phương pháp điện di mao quản điện động học kiểu Mixen (MEKC) với thành phần dung dịch đệm điện di gồm 40 mM đệm Borat, 100 mM SDS pH 8.5 Tiến hành phân tích tại thế điện di 10 kV, nhiệt

AMP, PENG, OXA, penicillin V và CLO ứng dụng phân tích trong mẫu nước thải của trang trại chăn nuôi Giới hạn phát hiện từ 0.14 đến 0.27 mg/l, độ lệch chuẩn tương đối thời gian lưu từ 0.25 đến 0.86%, diện tích pic 1.3 đến 4.15% Độ thu hồi trên 96%.

Biyang Deng và cộng sự [15] đã sử dụng phương pháp điện di với detector điện quang hóa xác định AMO trong nước tiểu người với giới hạn phát hiện thấp 0.31 μg/l, khoảng tuyến tính rộng 1 μg/l – 8 mg/l cùng độ thu hồi cao 95.77%, độ lệch chuẩn tương đối không lớn hơn 2.2% và thời gian phân tích ngắn 6 phút/ mẫu.

Attila Gaspar và cộng sự [14] đã tách và xác định thành công 14 kháng sinh họ cephalosporin bằng phương pháp điện di mao quản vùng (capillary zone electrophoresis – CZE) Quá trình tách dùng đệm photphat 25 mM có pH = 6.8 Phương pháp này tách được 14 kháng sinh trong vòng 20 phút, giới hạn phát hiện 14 kháng sinh cefalosporin C, cefoxitin, cefazolin, cefadroxil, cefoperazon, cefamandol, cefaclor, CEP, CEF, ceftibuten, cefuroxim, ceftazidim, cefotaxim, ceftriaxon với giới hạn phát hiện 0.42 – 1.62 mg/l Trong đó CEP và CEF có giới hạn phát hiện tương ứng 1.62 và 0.89 mg/l; khoảng tuyến tính 5 – 200 mg/l Mục đích của phương pháp được ứng dụng để nghiên

cứu độ bền của kháng sinh họ Cephalosporins trong nước tại nhiệt độ khác nhau (+25,

nhiệt độ phòng sau khi pha loãng.

M.I.Bailon-Perez và cộng sự [22] sử dụng phương pháp CZE và detector UV – DAD, pha động dùng hệ đệm tris 175 mM pH 8 và 20% (v/v) ethanol, dùng kĩ thuật chiết pha rắn làm sạch và làm giàu mẫu ứng dụng phân tích đồng thời AMP, AMO, dicloxacillin, CLO, OXA, PEN, nafcillin trong nền mẫu nước ( nước sông, nước thải…) Giới hạn phát hiện tương ứng 0.8; 0.8; 0.25; 0.30; 0.30; 0.9; 0.08 μg/l cùng độ thu hồi đạt 94 – 99 % với độ lệch chuẩn tương đối thấp hơn 10%.

Phương pháp MEKC cũng được M.I Bail´on P´erez, L Cuadros Rodr´ ıguez, C Cruces-Blanco [23] xác định 9 loại kháng sinh β_Lactam gồm CLO, dicloxacillin, OXA, PENG, penicillinV, AMP, nafcillin, piperacillin, AMO trong mẫu dược phẩm Các điều kiện tối ưu được chọn là 26 mM đệm Borat, 100 mM SDS pH = 8.5 làm chất nền điện di và thế điện di 25 kV Giới hạn phát hiện LOD 0.35 đến 1.42 mg/l, giới hạn định lượng 2.73 đến 5.74 mg/l, độ lệch chuẩn tương đối thời gian lưu từ 1.5 đến 1.7% Độ thu hồi từ 91 – 95.6%.

.Nhìn chung, phương pháp quang học và phương pháp điện hóa rất dễ tiến hành, đơn giản nhưng chỉ xác định từng chất riêng rẽ, điều này rất khó cho việc phân tích các mẫu có đa thành phần Với phương pháp HPLC kết quả tách tốt, độ chính xác, độ nhạy cao nhưng giá thành chi phí phân tích một mẫu lớn Vì vậy phương pháp MEKC sẽ là bước phát triển mới khắc phục những nhược điểm của phương pháp quang, điện, HPLC mà kết quả đáng tin cậy Trong bản luận văn này, chúng tôi nghiên cứu theo hướng của tác giả L Nozal, L Arce1,A.R´ıos, M Valcárcel [21], M.I Bail ´on P´erez, L Cuadros Rodr´ ıguez, C Cruces-Blanco [23] trong mẫu dược phẩm và sinh học.

CHƯƠNG 2 - ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng và nội dung nghiên cứu2.1.1 Đối tượng

Xác định hàm lượng kháng sinh trong mẫu thuốc và mẫu máu là một mảng đề tài rất thực tế và quan trọng Như đã chúng tôi đã đề cập trong bản luận văn này, vấn đề lạm dụng không đúng hàm lượng kháng sinh đem lại rất nhiều tác hại và ảnh hưởng đến sức khoẻ con người

Trong đề tài này, đối tượng phân tích mà chúng tôi chọn để nghiên cứu là penicillin (PENG), cloxacillin (CLO), oxacilin (OXA) ampicillin (AMP), amoxicillin (AMO), cephalexin (CEP), cefixim (CEF) là các kháng sinh β-lactam được sử dụng phổ biến hiện nay.

2.1.2 Nội dung nghiên cứu

Nội dung đề tài cần giải quyết là:

- Lựa chọn phương pháp nghiên cứu là phương pháp điện di mao quản điện động học kiểu Mixen (MEKC) với detector DAD

chất điện ly, điện thế, nhiệt độ….

2.2 Giới thiệu chung về phương pháp Điện di mao quản [7,8,20]

Để thực hiện được nhiệm vụ của luận văn, kỹ thuật tách được chọn là phương pháp điện di mao quản điện động học kiểu Mixen (MEKC)

2.2.1 Nguyên tắc của phương pháp điện di mao quản

- Nguyên tắc của sự tách: là dựa trên cơ sở tính chất điện di (sự di chuyển -

Mobility) của các phần tử chất tan (các ion chất tan, chất phân tích) trong mao quản

thích hợp, dưới tác dụng của một từ trường điện E nhất định được cung cấp bởi một nguồn thế cao một chiều (V: 15 - 40 kV) đặt vào hai đầu mao quản Nghĩa là CEC là kỹ thuật tách được thực hiện trong mao quản nhờ lực từ trường điện E điều khiển sự tách của các chất Việc dùng cột mao quản có nhiều ưu việt, như tốn ít mẫu và các hoá chất

và hiệu quả cao

- Cơ chế điện di: Sự điện di của các phần tử chất tan (các ion) trong ống mao

quản là cơ chế di chuyển khác nhau của chất tan ( chất phân tích ), dưới tác dụng của lực điện trường E nhất định (Electric Field Force: EFF) và tính chất (đặc trưng) của dòng điện di thẩm thấu (Electro-Osmotic Flow: EOF), trong sự phụ thuộc vào điện tích và

kích thước của chúng (Trong đó dòng EOF gọi là dòng điện di thẩm thấu, hay dòng điện thẩm).

2.2.2 Thiết bị của phương pháp điện di mao quản

- Trang thiết bị của hệ: Theo nguyên tắc, để thực hiện điện di, hệ thống máy

phải có các bộ phận chính như sau:

1 Buồng điện cực, bình điện di và các điện cực trơ (Au hay Pt),2 Cột tách sắc ký (cột mao quản hay gọi tắt là mao quản),

3 Nguồn cấp thế cao một chiều (15-40 kV), tạo lực điện trường E, để điều khiển quá trình điện di (sắc ký) của các chất,

4 Bộ phận nạp mẫu vào mao quản (cột tách),

5 Bộ phận phát hiện các chất sau khi tách (detector),6 Bộ phận điều nhiệt cho mao quản,

7 Bộ phận ghi nhận sắc đồ tách của các chất trong hỗn hợp mẫu Các bộ phận này có thể xem trong sơ đồ nguyên lý mô tả ở hình 1.

Hình 2.1 Sơ đồ nguyên tắc cấu tạo của hệ điện di mao quản

2.2.3 Các quá trình xẩy ra trong mao quản

Trong quá trình điện di, dưới tác dụng của lực điện trường E, do điện thế V đặt vào hai đầu mao quản tạo ra, trong mao quản có các quá trình là:

1 Sự xuất hiện lớp điện kép sát thành mao quản,

3 Xuất hiện dòng điện di thẩm thấu, EOF,

4 Sự tương tác của các chất mẫu và pha động (MP) với thành mao quản, 5 Sự khuếch tán, hay hội tụ của vùng mẫu các chất, khi di chuyển,

6 Sự phân bố của các chất giữa 2 pha (động và tĩnh), khi mao quản có pha tĩnh thật hay pha tĩnh giả (Mixen, trong hệ MEKC),

7 Hiệu ứng nhiệt Jun, làm mao quản nóng lên,

8 Sự phân tán, gradient và truyền nhiệt từ tâm mao quản ra xung quanh

9 Sự di chuyển (sự điện di) của các chất (như các ion âm, ion dương, và phần tử

trung tính) trong mao quản Đây là quá trình chính tạo ra sự sắc ký của các chất

Nhưng các quá trình trên (1-8) lại có tương tác và ảnh hưởng đến quá trình 9, nó có thể làm tốt và cũng có thể làm xấu quá trình điện di chuyển này của chất

Đó là các quá trình luôn xẩy ra trong mao quản của HPCEC Trong 9 quá trình xẩy ra đó, chỉ có quá trình 9 là dẫn đến sự tách của các chất, nhưng các quá trình khác

(1-8) lại ảnh hưởng đến quá trình 9, hoặc trực tiếp, hoặc gián tiếp Vì thế, muốn có kết

quả điện di tốt, nhất thiết chúng ta phải luôn xem xét tất cả các quá trình đó và các yếu tố liên quan đến các quá trình đó trong mao quản Tức là phải tối ứu hoá các điều kiện điện di cho một loại đối tượng mẫu và các chất cần xác định, để có được hiệu quả tách cao.

2.2.4 Sự phân loại hay các kiểu (mode) của phương pháp điện di mao quản

Sắc ký điện di mao quản rất đa dạng, nhiều kiểu, từ đơn giản đến hoàn chỉnh và phức tạp, nhưng tuỳ theo cơ chế, bản chất, và đặc điểm của sự tách (sự điện di) xẩy ra trong ống mao quản mà người ta thường phân chia thành các loại hay các kiểu (Mode) khác

nhau, và gán cho mỗi kiểu một tên riêng, để dễ hiểu, hay phân biệt và sử dụng chúng cho thích hợp Cụ thể các kiểu đó là:

1 Điện di mao quản cổ điển (Capillary Electrophoresis: CE) 2 Điện di mao quản vùng (Capillary Zone Electrophoresis: CZE)

3 Điện di mao quản điện động học kiểu Mixen (Micell), (Micellary Capillary Kenetic:MEK hay MCEK).

Electro-4 Điện di mao quản Gel-Filter (sàng lọc hay rây phân tử), (Capillary Gel Electrophoresis: Gel-CE),

5 Điện di mao quản hội tụ đẳng điện (Capillary Iso-electric Focusing : CIEF).6 Điện di mao quản đẳng tốc độ (Capillary Iso-Tacho-Phoresis: CITP).

2.2.5 Phương pháp điện di mao quản điện động học kiểu Mixen (MEKC)

ngắn gọn là MEKC) là một kiểu của kỹ thuật tách theo bản chất của sự điện di có sử dụng kết hợp cả tính chất của kỹ thuật điện di mao quản ( Capillary Electrophoresis) và sắc ký lỏng (LC) có pha tĩnh Nó là một trong các kiểu tách sắc ký (separation mode) của kỹ thuật CE được ứng dụng rộng rãi trong sinh học, y học và dược Nó là một kiểu kỹ thuật điện di mao quản có sức mạnh, tiện lợi và được ứng dụng cho việc tách cả các chất phân tử trung hoà và các chất mang điện tích (hợp chất liên kết ion) Vì thế nó bổ sung và làm phong phú về chủng loại của kỹ thuật điện di.

Bản chất và trung tâm của sự tách ở đây là sự hình thành các phần tử Mixen (tiểu phân Mixen - pha tĩnh giả) trong ống mao quản và các tiểu phân này sẽ dẫn dắt và đóng góp khả năng của quá trình tách sắc ký điện di các chất trên nền của dung dịch chất đệm và chất điện ly trong ống mao quản Sự tách sắc kí của các phân tử chất

tan trung hoà bằng kỹ thuật MEKC được điều chỉnh bởi các chất hoạt động bề mặt nằm trong dung dịch MP điện di Khi chất hoạt động bề mặt ở nồng độ cao hơn nồng độ ngưỡng của Mixen (giới hạn hình thành Mixen, CMC: Critial Micellary Concentration), ví dụ chất hoạt động bề mặt SDS (Sodium Dodecyl Sulfat), có CMC=9 mM, thì một tổ

hợp của các phần tử tiểu phân của chất hoạt động bề mặt được tích tụ lại và chúng hình thành (hay tạo ra) trong ống mao quản các tổ hợp của các tiểu phân SDS Nó chính là các Mixen (pha tĩnh giả) Các Mixen này là các tiểu phân có đầu kị nước của chất hoạt động bề mặt, định hướng vào trung tâm của Mixen và để cho đầu ưa nước của nó ra ngoài và sẽ tương tác với ion chất đệm, hay ion chất tan Nghĩa là đầu mang điện tích của chất hoạt động bề mặt sẽ hướng ra chất đệm Cấu trúc tiêu biểu của Mixen được mô tả trong hình 2.2 Các Mixen ở đây hoạt động như một pha tĩnh Các phân tử của chất mẫu (chất phân tích) được phân bố vào trong cả Mixen và cả ở ngoài Mixen (trong pha

có được kết quả sắc kí điện di tốt.

Phương pháp MEKC dùng để tách các chất phân tích có điện tích và không có điện tích Đối với các chất có điện tích, các Mixen loại này chuyển động hoặc là cùng chiều hoặc là ngược chiều với dòng EOF, là tuỳ thuộc vào điện tích của chất hoạt động bề mặt và cấu trúc của Mixen Các chất hoạt động bề mặt Aniônic, ví dụ như SDS, sẽ di chuyển về Anốt (cực dương), nghĩa là ngược chiều với hướng của dòng EOF Trong dung dịch đệm điện di có pH trung tính và kiềm, khi dòng EOF di chuyển nhanh hơn tốc độ của Mixen , thì sự điện di thực (net movement) của Mixen là theo hướng của dòng EOF Trong khi di chuyển như thế, các Mixen có thể tương tác với các phần tử chất tan (chất phân tích) như kiểu phân bố của sắc ký cột lỏng rắn (R-LC) theo cả tương tác ưa nước, tương tác kị nước và tương tác tĩnh điện, để tạo ra quá trình sắc ký của các chất mẫu, khi chạy qua cột mao quản trong quá trình điện di

Hình 2.2 Cấu trúc của các Mixen và dòng EOF trong MEKC

Đối với các phần tử chất tan trung tính, nó chỉ là sự phân bố của chất tan vào trong Mixen và ở ngoài Mixen (pha động điện di) theo một cân bằng động học có hằng

động học này gây ra (tạo ra) sự lưu giữ khác nhau của các chất tan, và tạo ra sự tách sắc ký các chất phân tích theo kiểu Mixen Vì thế các Mixen trong ống mao quản của kỹ thuật tách này được gọi là pha tĩnh giả Nhiều chất tan tương tác với Mixen khá bền, nó tồn tại trong Mixen dài hơn (lâu hơn) sự di chuyển của nó, khi các Mixen mang nó (các

chất tan trung tính) một phần đi ngược chiều của dòng EOF

Khi mà các chất tan lại không tương tác với các Mixen, thì nó được dòng EOF mang một cách đơn thuần cùng với dòng EOF Nhiều hợp chất kị nước tương tác rất mạnh với các Mixen, và nó bị lưu lại khá lâu trong mao quản, nên làm tăng thời gian lưu giữ của chất tan

Cơ chế của sự tách các phần tử trung tính trong MEKC về cơ bản vẫn là kiểu tương tác phân bố của chất tan, tương tự như trong sắc ký cột lỏng-rắn (LC) hấp phụ, nhưng lại được điều khiển bới lực điện trường E của thế cao V giữa hai đầu mao quản tạo ra, mà không phải bằng áp suất đẩy pha động như trong HPLC Trong kỹ thuật phân

R, cũng dựa trên cơ sở tương tự với các tính toán của hệ sắc kí cột LC, và tất nhiên có bổ sung thêm một số yếu tố cho thích hợp và đúng đắn hơn cho hệ pha MEKC Chính tỷ số giữa tổng số mol của chất tan (total moles of solute) ở trong Mixen (pha tĩnh giả), và tổng số mol của chất tan ở trong pha động (dung dịch đệm điện di), cũng được xem như là dung lượng của cột mao quản, và nó được biểu diễn theo công thức sau

Trong đó:

độ của chất hoạt động bề mặt trong mao quản, và quan hệ này được biểu diễn bởi công thức sau đây.

Trong đó:

V : Điện thế sử dụng để tạo ra điện trường E của sự điện di

Ki : Hệ số phân bố của chất thứ i ở trong và ngoài Mixen

tính như sau.

của chất tan trong hệ MEKC, cũng là một đại lượng quan trọng có liên quan đến các quá trình xẩy ra trong mao quản và được xác định theo biểu thức sau

phân bố Ki luôn luôn phụ thuộc vào nhiệt độ Nó cũng là một hằng số nhiệt động

chính cũng là yếu tố thuận lợi cho sự tách trong kỹ thuật điện di Đồng thời với các chất

biểu thị bằng công thức sau đây theo ba thành phần cơ bản.

Rij = A.z.ti (8)Trong đó:

ti : Thời gian lưu của chất tan.

nâng cao (làm tốt), khi tối ưu hoá được số đĩa N lớn nhất, khi chọn được điều kiện để có

của chất hoạt động bề mặt, thêm dung môi hữu cơ vào pha động (dung dịch đệm điện

độ của chất hoạt động bề mặt trong một vùng nhất định Song khi tăng nồng độ chất hoạt động bề mặt nhiều, thì một vấn đề xuất hiện ở đây là, nhất là khi dùng các chất hoạt động bề mặt loại ionic với nồng độ cao thường gây ra sự tăng cường độ dòng điện trong mao quản và hiệu ứng nhiệt Jun xuất hiện rõ rệt Công suất điện trong vùng từ 5 - 7 W/m mao quản trong môi trường lực ion trung bình, thì cũng đã làm nhiệt độ mao quản đã

cao, thì đương nhiên sẽ càng làm nóng mao quản nhiều Vì thế nên tránh dùng thế quá

Các chất hoạt động bề mặt được dùng trong MEKC cũng có thể tương tác với thành ống mao quản và cũng có thể ảnh hưởng nhất định đến dòng EOF, làm thay đổi sự tương tác hấp phụ giữa chất tan và thành ống mao quản Hướng di chuyển của chất tan và của các Mixen, là cũng bị thay đổi trong sự phụ thuộc vào điện tích của Mixen và tốc độ của dòng EOF Nói chung, các hệ đệm điện di có pH tương đối cao, thường được sử dụng để duy trì dòng EOF có tốc độ đủ lớn và đảm bảo hướng di chuyển ổn định của các Mixen

Bảng 2.1 Các chất hoạt động bề mặt dùng trong MEKC

2.2.6 Phân tích định lượng trong phương pháp điện di mao quản

lưu của chất là đại lượng đặc trưng để định tính (phát hiện) các chất Còn chiều cao H

Trong một vùng nồng độ nhất định và không lớn, thì chúng ta luôn có biểu thức xác định mối quan hệ đó là:

Để phân tích định lượng các chất theo kỹ thuật CE, chúng ta dựa theo phương

trình cơ bản trên và có thể dùng một trong hai phương pháp chuẩn hoá là phương pháp

đường chuẩn và phương pháp thêm tiêu chuẩn để xác định nồng độ chất phân tích

- Mắc trắc quang UV – 1601PC của hãng Shimadzu- Máy đo pH TITROLINE của hãng SCHOTT – Đức

- Bể siêu âm, máy ly tâm, hệ thống bơm chân không, cân phân tích, giấy lọc 0.45 μm; 0.2 μm của hãng Millipore (USA)

- Các dụng cụ thí nghiệm thông dụng khác của Phòng thí nghiệm phân tích

2.3.2 Hóa chất

CEF, OXA do Viện kiểm nghiệm Bộ Y tế ( 48 Hai Bà Trưng – Hà Nội) cung cấp- Nước deion được lọc qua giấy lọc 0.45µm của hãng Millipore (USA)

với nước deion Dung dịch được siêu âm 10 phút, lọc qua giấy lọc kích thước lỗ 0.2 μm

giá trị pH thay đổi cho phép ± 0.05 và được đo sau khi thêm SDS Dung dịch được bảo quản ở nhiệt độ thường

- Dung dịch chuẩn được pha trong nước deion từ các chất chuẩn sau đó đem siêu âm 15 phút được dung dịch nồng độ 1000 mg/l Dung dịch 1000 mg/l được pha loãng 10 lần thành 100 mg/l.( 1000 mg/l bảo quản trong 2 tháng và 100 mg/l bảo quản 1 tháng) Các dung dịch nồng độ thấp được pha từ dung dịch 100 mg/l và sử dụng trong ngày

CHƯƠNG 3 - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1 Nghiên cứu khảo sát tối ưu điều kiện tách β-Lactam 3.1.1 Chọn bước sóng phát hiện chất

Để khảo sát phổ β-Lactam, detector được chọn là UV-Vis Do các β-Lactam đều là những hợp chất không có mầu, hấp thụ ánh sáng trong vùng tử ngoại nên chúng tôi sử dụng máy quang phổ UV – 1601PC với khoảng quét phổ là 190 – 400 nm dùng cuvet thạch anh để xác định các bước sóng hấp thụ tối ưu của các chất này Các chất được pha với nồng độ 10 mg/l trong 25 mM đệm Borat, 100 mM SDS, pH=9 Phổ thu được thể hiện hình 3.1

Hình 3.1 Phổ hấp thụ của các β-Lactam (nồng độ 10 mg/l )

Các hệ đệm đa axit hay đa bazơ có nhược điểm là có hấp thụ quang trong vùng UV hay UV-VIS gây khó khăn phát hiện chất.Vì thế phải quét phổ các chất đệm, xem xét sóng đo thích hợp để hạn chế ảnh hưởng

Kết quả quét phổ cho ta thấy: các β-Lactam có phổ hấp thụ quang cao nhất ở 198 nm Chúng tôi chọn bước sóng làm việc là 198 nm cho pic cao và đẹp nhất Detector sử dụng của máy điện di là detector DAD của hãng HP

3.1.2 Mao quản và xử lý mao quản trước khi tách

Trong kỹ thuật điện di việc sử dụng mao quản silica đường kính trong nhỏ hơn 100 µm sẽ làm mất ảnh hưởng của nhiệt jun sinh ra trong ống mao quản và do vậy mới cho phép áp vào hai đầu mao quản điện thế cao tới 20 – 30kV Hơn nữa kích thước mao

quản sẽ rất thuận lợi khi phân tích những mẫu có hàm lượng nhỏ như mẫu huyết thanh Tuy nhiên, nếu mao quản có đường kính quá nhỏ thì thể tích mẫu nạp cũng bị giới hạn, điều này lại ảnh hưởng đến độ nhạy phát hiện Khoảng đường kính trong của mao quản thường là 25 – 150 µm Tốt nhất nên dùng mao quản có đường kính trong từ 25- 75 µm Vì mao quản có ID lớn hơn 75 µm thường cho hiệu ứng nhiệt Iun lớn và khó khống chế nhiệt độ mao quản khi điện di Để phù hợp với điều kiện của phòng thí nghiệm loại mao quản chúng tôi sử dụng trong nghiên cứu này có đường kính trong là 50 µm

Chiều dài mao quản cũng là yếu tố quan trọng, vì muốn áp thế cao vào hai đầu mao quản thì chiều dài mao quản phải đủ lớn Về mặt lý thuyết, thế áp vào mao quản thông thường đảm bảo từ 200 – 600 V/cm là thích hợp Việc chọn chiều dài mao quản chỉ có tính chất định tính phụ thuộc vào khoảng cách từ lọ mẫu đến detector và từ detector đến lọ đệm và tùy thuộc vào hỗn hợp chất mẫu cần tách Mao quản của chúng tôi sử dụng là loại mao quản trần, có tổng chiều dài là 64.5cm, chiều dài hiệu lực là 58cm, loại bubble cell (có độ nhạy cao gấp 3 -5 lần so với cell thông thường) của hãng HP Để tạo flowcell trên mao quản, tại chiều dài 58cm tính từ đầu mao quản loại bỏ lớp poliamit bằng cách đốt nóng một đoạn mao quản dài 2mm Sau đó dùng giấy mềm tẩm axeton hoặc etanol lau sạch và lắp vào hệ điện di.

Mao quản lần đầu tiên sử dụng được rửa lần lượt với NaOH 1M 10 phút, nước deion 10 phút và rửa với đệm chạy 30 phút Sau khi chạy từ 3-4 lần thì hoạt hóa lại cột, rửa với NaOH 0.1M 3 phút, nước deion 3 phút và đệm chạy 10 phút.

3.1.3 Chọn phương pháp bơm mẫu

Trong kỹ thuật điện di mao quản có thể đưa vào mao quản bằng ba phương pháp là phương pháp điện động học (electrokinetic), phương pháp thủy động học (hydrodynamic) và phương pháp Xiphong (siphon) Trong đó phương pháp điện động học và thủy động học được dùng rộng rãi Nguyên tắc của phương pháp điện là đặt một thế nhất định trong một thời gian nhất định vào đầu của hai điện cực, một điện cực nhúng trong lọ mẫu và một điện cực kia nhúng trong lọ đệm Trong khi đó hai đầu của

mao quản cũng được nhúng vào hai lọ mẫu và đệm nói trên Như thế những ion mẫu sẽ di chuyển vào mao quản tạo thành vùng mẫu đầu mao quản Ion nào có kích thước nhỏ, điện tích lớn sẽ được dẫn vào mao quản nhiều hơn Trong mẫu nếu có hai chất phân tích có cùng nồng độ nhưng điện tích khác nhau thì lượng ion của những chất này được dẫn vào mao quản khác nhau Do vậy nồng độ chất phân tích được nạp vào mao quản sẽ khác so với nồng độ mẫu thực Sự sai khác này sẽ lớn nếu thời gian bơm mẫu dài Trong thực tế điều này không đáng ngại vì người ta có thể loại trừ bằng cách bơm mẫu trong thời gian ngắn và ở những điều kiện như nhau trong mọi thí nghiệm nghiên cứu, thời gian bơm mẫu ngắn ảnh hưởng đến độ nhạy Ngoài ra lượng mẫu bơm còn phụ thuộc vào độ dẫn của dung dịch mẫu, đặc biệt ở những mẫu có nồng độ muối cao mà ta không thể biết trước được như những mẫu nước tiểu

Trong phương pháp bơm mẫu thứ hai là bơm mẫu theo kiểu thủy động lực học bao gồm trong kiểu bơm mẫu này là bơm bằng áp suất hoặc xiphong Nguyên tắc của phương pháp xiphong dựa trên sự chênh lệch độ cao của hai đầu ống mao quản được đặt

vào lọ chứa đệm để mẫu tự xiphong vào ống mao quản trong thời gian nhất định Như thế mẫu nạp vào được đặt ở đầu mao quản cao Phương pháp này đơn giản nhưng khi nạp một lượng mẫu nhỏ cỡ vài nl thì khó chính xác và áp dụng cho những hệ điện di tự tạo đơn giản, độ lặp lại kém Vì vậy ít được dùng

Phương pháp bơm mẫu bằng áp suất là dùng một áp suất thích hợp để nén vào lọ chứa mẫu và tạo chân không phía đầu kia mao quản trong một thời gian nhất định Do lực áp suất đẩy và hút mà một lượng mẫu sẽ được bơm vào đầu mao quản Áp suất hay được dùng từ 50 – 300 mbar Mẫu được bơm vào sẽ có nồng độ đều và giống với nồng độ của chất tan trong mẫu phân tích Trong phương pháp này chúng tôi chọn bơm mẫu theo phương pháp thủy động lực học với áp suất là 50 mbar và cách bơm mẫu này sẽ được dùng trong suốt quá trình thí nghiệm

3.1.4 Độ điện di và độ điện di hiệu dụng

Trong kỹ thuật MEKC chất tạo Mixen có vai trò rất quan trọng, nó quyết định đến độ phân giải của quá trình tách Các hạt Mixen hình thành trong dung dịch điện di đóng vai trò như pha tĩnh giả Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã sử dung loại Natri dodecyl sunphat (SDS), tức là Mixen được hình thành bởi các phân tử SDS.

Theo lý thuyết, độ điện di [7,8]

µtot(i) = ( µef + µEOF) = l/(ti E) = (L.l)/(ti V) (14)

Thời gian lưu của chất tan i là:

ti = (L.l)/(µtot(i) V) (15)Trong đó:

µtot(i) = (µef + µEOF ): Độ điện di tổng cộng (toàn phần) của chất tan.V: Điện thế được dùng đặt vào hai đầu ống mao quản, kV.

l: Chiều dài hiệu dụng (56cm) và L là chiều dài tổng cộng của mao quản (64.5cm).

E: Điện trường trong mao quản do thế V tạo ra Điện trường E này do thế V (kV)

đặt vào hai đầu ống mao quản và nó là lực chính điều khiển quá trình điện di của các

chất và cả dòng EOF trong ống mao quản.

µef = µtot - µEOF

µtot = (L l)/ ti V = 64.5 56/ ti V

này trong từng điều kiện nó nằm trong dòng EOF và sẽ di chuyển bằng tốc độ di chuyển

gây ra bởi dung địch đệm điện di Vì thế trong các thí nghiệm chúng tôi đã sử dụng thời

3.1.5 Ảnh hưởng pH của dung dịch đệm điện di

Ảnh hưởng pH trong dung dịch đệm điện di được khảo sát với dung dịch điện di chứa:

- 7 chất kháng sinh β-Lactam cùng nồng độ 5 mg/l, 25 mM đệm Borat + 100 mM SDS- Thế điện di 20kV, bơm mẫu áp suất 50mbar, thời gian bơm mẫu 8s, nhiệt độ mao quản

Gía trị pH thay đổi tại pH = 8.25; 8.0; 7.75; 7.5

Hình 3.2 Sắc đồ điện di của β-Lactam ở pH 8.25; 8.0; 7.75; 7.5

Bảng 3.1 Khảo sát ảnh hưởng của pH đến thời gian di chuyển của β-Lactam

Vì mao quản được sử dụng là mao quản thủy tinh silic Khi cho mao quản silic không phủ tiếp xúc với dung dịch đệm có pH từ 7.5 đến 8.25 (>4), bề mặt mao quản tích điện âm nguyên nhân là do các nhóm silanol trên bề mặt mao quản phân ly proton, làm

bề mặt mao quản mang tính âm điện (anionic), thì dòng EOF thường hướng theo phương từ anốt (cực dương) về phía catốt (cực âm) Khi có thêm chất hoạt động bề mặt SDS – dạng anionic, hình thành các Mixen Các Mixen sẽ di chuyển về phía anốt (cực dương) nghĩa là ngược chiều với hướng của dòng EOF Do từng tính chất riêng của các β-Lactam chúng phân bố vào Mixen khác nhau với hệ số phân bố khác nhau Khi chất phân tích bám vào Mixen, chúng di chuyển cùng tốc độ Mixen, khi không bám vào Mixen, chúng di chuyển cùng tốc độ dòng điện di thẩm thấu Kết quả là trong dòng EOF về phía cực âm là các phân tử trung hòa và các ion mang điện tích âm Mixen và dòng EOF di chuyển khác tốc độ Do hệ số phân bố vào Mixen khác nhau dẫn tới di chuyển tới cực âm với tốc độ khác nhau, tách khỏi nhau.

tan bị thay đổi theo Trong dung dịch với gía trị pH cao hơn hay thấp hơn giá trị pI ( độ ion hóa) sẽ làm thay đổi điện tích của các chất tan Nghĩa là khi thay đổi pH sẽ làm thay đổi chất tan bị dương điện hơn hay âm điện hơn hoặc ngược lại Kết quả sẽ làm cho

trị pI (pI = -log I và I: độ ion hóa) làm cho chất tan có điện tích âm và nó sẽ di chuyển về phía anốt (đầu cực dương) chậm hơn dòng EOF Như vậy cùng với tác dụng làm thay đổi điện tích của chất tan, sự thay đổi pH của dung dịch đệm điện di cũng làm thay đổi cả tốc độ của dòng EOF

Hơn nữa khi pH thay đổi nó cũng sẽ làm thay đổi sự tích điện của thành mao quản Vì khi pH của pha động điện di thay đổi, sẽ làm thay đổi quá trình de-hydro, tách ion H trong nhóm –OH trên thành mao quản Tức là làm thay đối lớp điện kép và thế Zêta Qua đó mà tác động hay làm ảnh hưởng đến sự điện di của chất.

Từ hình 3.3, ở pH =7.5 đến 8.25 độ điện di của PENG, OXA, CEF hầu như không bị ảnh hưởng Đối với CLO độ điện di ko đổi pH 7.5 đến 8, đến pH 8.25 độ điện di cao hơn.

Với CEP, AMP độ điện di thấp dần khi tăng dần gía trị pH, tại pH = 8.25 và 8.0 chân pic của CEP và AMP chưa tách ra được khỏi nhau

Nhận thấy càng tăng pH thì khả năng tách càng kém, thời gian di chuyển ngắn hơn và pic nhọn hơn Ảnh hưởng này thể hiện rõ nhất ở AMP và CEP Từ nghiên cứu, chũng tôi chọn pH =7.75 tốt nhất để tách các β-Lactam trong những nghiên cứu tiếp theo.

3.1.6 Ảnh hưởng của thành phần dung dịch đệm

Cùng với pH của dung dịch đệm, chất điện ly trong pha động cũng có vai trò rất quan trọng và nó phải có nồng độ phù hợp Trong thực tế người ta chọn chất đệm pH cũng chính là chất điện giải của sắc ký điện di.Tác động của chất điện giải thể hiện qua việc ổn định, duy trì dòng điện I và dòng điện thẩm EOF trong mao quản Qua đó sẽ làm

Trong hệ đệm, thì các hệ đệm đa axit, đa ba bazơ thường có hiệu lực tốt hơn các hệ đệm đơn axit, đơn bazơ Vì các đa axit, đa bazơ có nhiều nấc phân ly, nên có khả năng đệm trong vùng pH rộng và tính linh hoạt cao Các đệm dùng với nồng độ cao mà không gây hiệu ứng nhiệt lớn cho ống mao quản

Tiến hành chạy điện di thành phần đệm: 25 mM đệm Photphat - 7 chất kháng sinh β-Lactam cùng nồng độ 5 mg/l, 100 mM SDS, pH =7.75

- Thế điện di 20kV, bơm mẫu áp suất 50 mbar, thời gian bơm mẫu 8s, nhiệt độ mao quản

Thực nghiệm nhận thấy, khi chạy điện di trong hệ đệm photphat thì chưa xuất hiện pic trước thời gian 15 phút Vì vậy chũng tôi quyết định chọn đệm Borat cho các khảo sát tiếp theo

3.1.7 Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ chất tạo mixen SDS

Chất hoạt động bề mặt SDS được xem như pha tĩnh giả của sự tách vì thực chất nó vẫn chuyển động cùng với dòng điện di Nồng độ SDS trong dung dịch đệm điện di có ảnh hưởng mạnh tới độ điện li hiệu dụng của các β-Lactam bởi nó liên quan đến sự

hình thành hạt Mixen cũng như nồng độ Mixen trong dung dịch đệm điện di Để khảo sát ảnh hưởng của SDS đến quá trình điện di, nồng độ SDS đã bị thay đổi tại ba giá trị là 75 mM; 100 mM và 125 mM Các điều kiện khảo sát:

- 7 chất kháng sinh β-Lactam cùng nồng độ 5 mg/l, 25 mM đệm Borat, pH = 7.75

- Thế điện di 20kV, bơm mẫu áp suất 50 mbar, thời gian bơm mẫu 8s, nhiệt độ mao quản

Hình 3.4 Sắc đồ điện di của β-Lactam tại nồng độ SDS = 75 mM;100 mM và 125 mMBảng 3.2 Kết quả khảo sát ảnh hưởng nồng độ SDS đến thời gian lưu của β-Lactam