Rij = A.z.ti Trong đó:
3.1.8. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ đệm
Cùng với pH của dung dịch đệm, chất điện giải (chất điện ly) trong pha động cũng có vai trò quan trọng và nó phải có nồng độ phù hợp. Trong thực tế, người ta cố
gắng chọn chất đệm pH cũng đồng thời chính là chất điện giải của sắc ký điện di. Như vậy, pha động sẽ không phức tạp, không gây khó khăn ảnh hưởng đến hiệu quả tách sắc ký. Ở đây tôi chọn Natri tetraborat vừa là chất đệm pH vừa là chất điện giải
Chúng tôi tiến hành khảo sát nồng độ đệm tại bốn gía trị là 20 mM; 25 mM; 30 mM; 35 mM với điều kiện khảo sát như sau:
- 7 chất kháng sinh β-Lactam cùng nồng độ 5 mg/l, 100 mM SDS, pH = 7.75
- Thế điện di 20kV, bơm mẫu áp suất 50 mbar, thời gian bơm mẫu 8s, nhiệt độ mao quản
HÌnh 3.6 Sắc đồ điện di của β-Lactam tại nồng độ đệm 20 mM, 25 mM, 30 mM và 35 mM
Bảng 3.3 Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ đệm tới thời gian lưu ( phút)
Nồng độ đệm (mM) Thời gian di chuyển của β-Lactam (phút)
t0 AMO CEP AMP PENG OXA CEF CLO
20 5.42 7.94 9.90 10.12 10.49 11.51 11.80 11.91
25 5.67 8.34 10.62 10.88 11.41 12.37 12.84 13.32
30 6.08 9.3 12.03 12.37 13.53 14.22 14.86 16.0
35 6.31 10.95 14.16 14.58 17.54 17.8 19.70 22.42
Hình 3.7 Ảnh hưởng của nồng độ đệm đến độ điện di hiệu dụng của β-Lactam
1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 20 25 30 35 Đệm Borat (mM) AMO CEP AMP PENG OXA CEF CLO
Khảo sát nồng độ đệm tại bốn giá trị, càng tăng nồng độ đệm thì độ điện di hiệu dụng của 7 kháng sinh β-Lactam càng tăng, thời gian lưu của chất tan tăng nhưng hiệu quả tách cũng không tốt.
Trong ống mao quản, khi nồng độ đệm tăng, nghĩa là nồng độ các ion tăng, thường làm thay đổi, giảm độ lớn của lớp điện kép, ảnh hưởng đến sự tương tác tĩnh điện Culông của chất tan với thành mao quản. Lớp điện kép là một hiện tượng sinh ra rất tự nhiện trong mao quản. Lớp điện kép này thường làm cho vùng mẫu di chuyển không phẳng qua đó tạo ra sự doãng chân pic và cuối cùng làm giảm hiệu quả tách, cụ thể nhất ở nồng độ 35 mM.
Lực ion của dung dịch cũng là yếu tố ảnh hưởng đến dòng EOF và quá trình sắc ký điện di các chất. Nồng độ đệm tăng, lực ion cũng tăng theo, lớp điện kép bị thu hẹp lại kết quả làm giảm thế Zeta và giảm luôn tốc độ của dòng EOF. Lực ion lớn, taọ ra dòng điện cao và có hiệu ứng nhiệt Jun lớn làm mao quản nóng lên, độ nét của pic cũng bị ảnh hưởng, làm giảm hiệu quả tách. Tại nồng độ đệm 30 mM và 35 mM nồng độ đệm cao nên pic đã bị dãn và tín hiệu nền xấu đi nhiều, hiệu quả tách cũng kém, pic của PENG và OXA bị dính chân vào nhau tại nồng độ 35 mM.
Nồng độ đệm 20 mM, lực ion thấp hơn, giảm được cường độ dòng điện I, tăng sự hấp phụ của mẫu lên thành mao quản, tốc độ di chuyển của các chất tan nhanh hơn vì vậy hiệu quả tách kém, hai pic của CEF và CLO dính chân vào nhau.
Do đó chúng tôi chọn nồng độ 25 mM đệm Borat là điều kiện tối ưu.