Nghiên cứu sugarcane yellow leaf virus gây bệnh vàng gân lá trên mía bằng kính hiển vi huỳnh quang và kỹ thuật rt-pcr

Nghiên cứu sugarcane yellow leaf virus gây bệnh vàng gân lá trên mía bằng kính hiển vi huỳnh quang và kỹ thuật rt-pcr

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

***000***

NGUYỄN MINH NAM

NGHIÊN CỨU SUGARCANE YELLOW LEAF VIRUS GÂY

BỆNH VÀNG GÂN LÁ TRÊN MÍA (YLS) BẰNG KÍNH HIỂN VI HUỲNH QUANG VÀ KỸ THUẬT RT-PCR

Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 09/2006

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

*************

NGHIÊN CỨU SUGARCANE YELLOW LEAF VIRUS GÂY

BỆNH VÀNG GÂN LÁ TRÊN MÍA (YLS) BẰNG KÍNH HIỂN VI HUỲNH QUANG VÀ KỸ THUẬT RT-PCR

LUẬN VĂN KỸ SƯ

Chuyên ngành CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Niên khóa: 2002 – 2006

Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 09/2006

MINISTRY OF EDUCATION AND TRAINING NONG LAM UNIVERSITY, HCMC

DEPARTMENT OF BIOTECHNOLOGY ***000***

RESEARCH ON SUGARCANE YELLOW LEAF VIRUS, THE

CAUSAL AGENT OF YELLOW LEAF SYNDROME IN

SACCHARUM BY FLUORESCENCE MICROCOPY

AND RT-PCR METHOD

Graduation thesis Major: Biotechnology

LỜI CẢM TẠ

Con xin thành kính khắc ghi cù lao của cha mẹ, Người đã sinh thành, dưỡng dục và hy sinh tất cả để cho anh em con được ăn học nên người Con xin cảm ơn gia đình đã là chỗ dựa vững chắc cho con vững bước vượt qua mọi khĩ khăn

Em xin chân thành cảm ơn:

Ban Giám Hiệu Trường Đại Học Nơng Lâm Tp HCM, ban Chủ Nhiệm bộ mơn Cơng Nghệ Sinh Học đã tạo điều kiện cho em thực hiện thành cơng khĩa luận

PGS TS Bùi Cách Tuyến đã tận tình hướng dẫn và tạo mọi điều kiện thuận lợi để em hồn tất khĩa luận này

TS Bùi Minh Trí đã tận tình dạy bảo và giúp đỡ em trong suốt thời gian qua PGS TS Trần Thị Dân, TS Nguyễn Ngọc Hải, ThS Trần Nhật Phương đã giúp đỡ em giải quyết những vướng mắc trong quá trình thực hiện khĩa luận

Tồn thể Thầy, Cơ đã trang bị cho em những kiến thức quí báu

TS M Irey (USDA) đã tận tình cung cấp trình tự primers và protocol PCR cho em TS Tania (South African Sugarcane Research Institute) và TS S Schenck (HARC) đã tận tình cung cấp antiserum của ScYLV cho em TS Becky (itdna company) đã cung cấp cho em những tài liệu quí giá

RT-Anh Hà Đình Tuấn và anh Thống ở Trung tâm Nghiên cứu Mía đường An Phú, các anh ở trại giống Đức Huệ, Long An và các hộ dân ở xã Phú Lý, Vĩnh Cửu, Đồng Nai đã tạo mọi điều kiện thuận lợi và giúp đỡ em trong quá trình thu thập mẫu

Các Thầy, Cơ và anh chị tại Trung tâm Phân tích Hĩa Sinh đã hết lịng giúp đỡ và cho em những kinh nghiệm quí báu để em thực hiện thành cơng khĩa luận này

Các bạn lớp cơng nghệ sinh học 28 đã luơn ở bên mình, động viên và nhiệt tình giúp đỡ mình trong suốt thời gian mình học tập cũng như trong lúc mình thực hiện khĩa luận này

Tp Hồ Chí Minh, ngày 30 tháng 08 năm 2006

TÓM TẮT

Nguyễn Minh Nam, Đại học Nông Lâm Tp HCM Tháng 9 năm 2006

“NGHIÊN CỨU SUGARCANE YELLOW LEAF VIRUS GÂY BỆNH VÀNG GÂN

LÁ TRÊN MÍA (YLS) BẰNG KÍNH HIỂN VI HUỲNH QUANG VÀ KỸ THUẬT RT-PCR” được tiến hành tại Trung tâm Phân tích Hóa Sinh Trường Đại học Nông Lâm Tp Hồ Chí Minh; Trung tâm Công nghệ và Quản lý Môi trường và Tài nguyên

Phú, Bình Dương; xã Phú Lý, huyện Vĩnh Cửu, tỉnh Đồng Nai; xã Mỹ Thạnh Tây, Đức Huệ, Long An, xã Tân An, Thủ Dầu Một từ tháng 3/2006 đến tháng 8/2006

Triệu chứng vàng gân lá trên mía do sugarcane yellow leaf virus gây ra, đây là

một tác nhân gây bệnh quan trọng Bệnh này đã xảy ra ở nhiều vùng trồng mía trên thế giới ScYLV tập trung trong bó mạch libe của cây Triệu chứng của bệnh thường xuất hiện ở cây trưởng thành với biểu hiện vàng ở gân lá Bệnh này có thể được chẩn đoán dựa vào biểu hiện triệu chứng, kỹ thuật RT-PCR, ELISA, TBIA, ISEM, kính hiển vi điện tử hoặc kính hiển vi huỳnh quang

Nội dung của đề tài bao gồm:

- Phát hiện sự nhiễm ScYLV dựa vào triệu chứng

- Kiểm tra các bó mạch libe của cây có và không có biểu hiện triệu chứng vàng gân lá bằng kính hiển vi quang học và kính hiển vi huỳnh quang - Chẩn đoán ScYLV bằng kỹ thuật RT-PCR với cặp mồi YLS111 và

YLS462 Kết quả của đề tài:

- Triệu chứng vàng gân lá trên mía đã xuất hiện tại Trung tâm Nghiên cứu Mía đường An Phú, Bình Dương; xã Phú Lý, huyện Vĩnh Cửu, tỉnh Đồng Nai; xã Mỹ Thạnh Tây, Đức Huệ, Long An, xã Tân An, Thủ Dầu Một, Bình Dương

- Đối với cây có biểu hiện triệu chứng thì bó mạch libe có sự phát huỳnh quang trong khi bó mạch của cây bình thường thì không

Sugarcane yellow leaf syndrome is caused by sugarcane yellow leaf virus, being a pathogen of economic importance The disease has been reported to occur in

many sugarcane growing area worldwide Sugarcane yellow leaf virus resides in the

phloem of diseased canes Symptoms of the disease generally appear in maturing plant as a yellowing of the leaf midrib The disease can be diagnosed by symptoms, RT-PCR, ELISA, TBIA, ISEM, EM or fluorescence microcopy

The objectives of this research are as follows:

- To identify ScYLV infecting plants by symptoms

- To examine the phloem of plant with symptom and symptom less plant by light microcopy and fluorescence microcopy

The results of this research are as follows:

- Sugarcane yellow leaf syndrome has been present in sugarcane grown at Institute of Sugarcane Research of An Phu; Phu Ly village, Vinh Cuu district, Dong Nai province; My Thanh Tay village, Duc Hue district, Long An province, Tan An village, Thu Dau Mot town, Binh Duong province - In plants expressing disease symptom, the vascular bundles presented

fluorescence in the phloem while symtomless plants do not have fluorescence

- Finding out the RT-PCR process that can be used for ScYLV diagnosis.

PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

2.1 Tổng quan về cây mía 3

2.1.1 Về cây mía 3

2.1.2 Một số bệnh do virus trên cây mía 5

2.2 Bệnh vàng gân lá trên mía và sugarcane yellow leaf virus 7

2.2.1 Bệnh vàng gân lá trên mía 7

2.2.2 Sugarcane yellow leaf virus 9

2.2.3 Ảnh hưởng về kinh tế của bệnh vàng gân lá 15

2.2.4 Những nghiên cứu về tính kháng ScYLV trên mía 16

2.2.5 Tạo cây mía chuyển gene kháng ScYLV 16

2.2.6 Tạo cây mía sạch bệnh bằng kỹ thuật nuôi cấy mô 17

2.2.7 Một số kỹ thuật trong chẩn đoán ScYLV 17

2.3 Những nghiên cứu về ScYLV trên thế giới và ở việt nam 25

2.3.1 Những nghiên cứu về ScYLV trên thế giới 25

2.3.2 Những nghiên cứu về ScYLV ở Việt Nam 26

2.4 Kỹ thuật PCR và RT-PCR 27

2.4.1 PCR 27

2.4.2 RT-PCR 28

PHẦN 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 30

3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 30

v

3.2 Phương pháp lấy mẫu 30

3.3 Trang thiết bị và dụng cụ thí nghiệm 31

3.3.1 Máy móc, thiết bị 31

3.3.2 Dụng cụ 31

3.4 Hóa chất 32

3.4.1 Hóa chất sử dụng trong RT- PCR 32

3.4.2 Hóa chất sử dụng trong điện di 32

3.5 Phương pháp quan sát bằng kính hiển vi huỳnh quang 33

3.6 Phương pháp phát hiện bằng kỹ thuật RT-PCR 33

3.6.1 Qui Trình Ly Trích RNA 33

3.6.2 Qui trình thực hiện phản ứng RT-PCR 35

3.6.3 Qui trình RT-PCR chỉnh sửa 35

3.7 Phương pháp xử lý số liệu 36

PHẦN 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 37

4.1 Các biểu hiện của triệu chứng vàng gân lá do ScYLV 37

4.2 Kết quả chuẩn đoán dựa vào triệu chứng 39

4.2.1 Tỷ lệ nhiễm bệnh theo giai đoạn sinh trưởng 39

4.2.2 Tỷ lệ nhiễm bệnh theo địa phương 40

4.2.3 Tỷ lệ nhiễm bệnh theo nguồn gốc giống 42

4.3 Quan sát mạch dẫn bằng kính hiển vi huỳnh quang 43

4.4 Kết quả RT-PCR dựa theo qui trình của M Irey 46

vi

DANH SÁCH CÁC TỪ VIẾT TẮT

Bp: Base pair

BYDV: Barley Yellow Dwarf Luteovirus

cDNA: complementary DNACP: Coat Protein

DAS-ELISA: Double Antibody Sandswich - ELISA DBIA: Dot-Blot Immunoassay

DEPC: Diethyl Pyrocarbonate DNA: Deoxyribonucleic Acid

dNTP: Deoxyribonucleoside Triphosphate dsRNA: double stranded RNA

ELISA: Enzyme - Linked Immunosorbent Assay EM: Electron Microscopy

g: Gram ha: Hecta

ISEM: Immunosorbent Electron Microscopy k Da: Kilo Dalton

kg: Kilogram

ml: Mililitre µl: Microlitre µm: Micrometre mm: Milimetre

MP: Movement Protein mRNA: Messenger RNA

NASBA: Nucleic Acid Sequence-Based Amplification nm: Nanometre

ORF: Open Reading Frame PCR: Polymerase Chain Reaction

PEMV: Pea enation mosaic virus PLRV: Potato leaf roll virus

PTGS: Posttranscriptional Gene Silencing PVP: Polyvinylpyrrolidone

RdRp: RNA dependent RNA polymerase RNA: Ribonucleic Acid

RT-PCR: Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction

SCBV: Sugarcane bacilliform virus ScYLV: Sugarcane Yellow Leaf Virus

SDS-PAGE: Sodium Dodecyl Sunfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis SSR: Single Sequence Repeat

ssRNA: Single stranded Ribonucleic Acid TIBA: Tissue Blot Immunoassay

UTR: Untranslated Region YLS: Yellow Leaf Syndrome

vii

DANH SÁCH CÁC BẢNG VÀ BIỂU ĐỒ

Bảng 4.1 Tỷ lệ nhiễm bệnh theo giai đoạn sinh trưởng 39

Bảng 4.2 Tỷ lệ nhiễm bệnh vàng gân lá theo địa phương 40

Bảng 4.3 Tỷ lệ nhiễm bệnh theo giống 42

Biểu đồ 4.1 Tỷ lệ nhiễm bệnh theo giai đoạn sinh trưởng 39

Biểu đồ 4.2 Tỷ lệ nhiễm bệnh giữa các địa phương 41

Biểu đồ 4.3 Tỷ lệ nhiễm bệnh theo nguồn gốc giống 43

DANH SÁCH CÁC HÌNH Hình 2.1 Sự phân bố của ScYLV trên thế giới 8

Hình 2.2 Sugarcane yellow leaf virus dưới kính 9

Hình 2.3 Rệp lá bắp Rệp có cánh (A,B), rệp không cánh (C) trưởng thành 11

Hình 2.4 Biểu đồ mô tả bộ gene của Luteovirus thuộc nhóm phụ I và II 12

Hình 2.5 Cấu trúc kẹp tóc giả định trong bộ gene của ScYLV 14

Hình 2.6 Các bó mạch gân lá được kiểm tra bởi kính hiển vi huỳnh quang 19

Hình 2.7 Vi ảnh điện tử của lát cắt siêu mỏng của tế bào kèm libe cây mía 20

Hình 2.8 Kết quả TIBA của vết in gân lá khỏe (trên) và lá bị nhiễm (dưới) 21

Hình 2.9 Màng nitrocellulose được xử lý bằng kỹ thuật TBIA với huyết thanh 22

Hình 2.10 Kết quả immunoblotting (westren blotting) của protein ScYLV 22

Hình 2.11 Phân tử Beacon 23

Hình.2.12 Nguyên tắc của phản ứng PCR 27

Hình 2.13 Sơ đồ phản ứng RT-PCR 29

Hình.4.1 Lá biểu hiện triệu chứng vàng gân lá 37

Hình 4.2 Triệu chứng vàng gân lá bắt đầu từ lá thứ 3 37

Hình 4.3 Cây biểu hiện triệu chứng vàng gân lá 38

Hình 4.4 Cánh đồng có triệu chứng vàng gân lá (A) Cánh đồng khỏe mạnh (B) 38

Hình 4.5 Các bó mạch của gân lá được kiểm tra bởi kính hiển vi huỳnh quang 44

Hình 4.6 Các bó mạch gân lá được quan sát bằng kính hiển vi quang học (100X) 45

Hình 4.7 Sự phát huỳnh quang của tế bào do có phản ứng chết (200X) 45

Hình 4.8 Kết quả điện di sản phẩm RT-PCR 46

Hình 4.9 Kết quả điện di sản phẩm RT-PCR 47

iv

PHẦN 1 MỞ ĐẦU

Đặt vấn đề

Ở nước ta hiện nay mía là nguyên liệu duy nhất để chế biến ra đường, nên mía là một cây trồng quan trọng trong cơ cấu cây thực phẩm Ngoài ra, mía còn là cây có sản lượng cao (có thể đạt tới 200-250 tấn sinh khối/1ha/năm) và hiệu quả kinh tế cao nên mía là cây xóa đói giảm nghèo cho nông dân (Trần Văn Sỏi, 2003)

Tuy nhiên trở ngại lớn trong quá trình canh tác cây mía là bệnh dịch, đặc biệt

nhất là bệnh do virus Trong đó, bệnh do Sugarcane yellow leaf virus (ScYLV) đang là

tác nhân gây bệnh quan trọng về kinh tế ở nhiều nước trên thế giới Virus này được

phát hiện và công bố ở hơn 30 nước trên khắp thế giới như South Afica, Swaziland,

Malawi và Zimbabwe (Bailey et al., 1996), Mauritius (Anon 1996, Saumtally and Moutia, 1997), USA và Australia (Borg et al., 1997), Brazil (Anon., 1995), Cuba (Arocha, Y., Gonzalez, L., Peralta, E L., and Jones, 1999) (trích bởi Schenck, 2001), Ecuador (Freddy, 2006), …

Sugarcane yellow leaf virus gây thiệt hại kinh tế lớn trên các vùng trồng mía,

thiệt hại ước tính khoảng 40-60% ở Brazil và hơn 20% ở các vùng khác Việc chẩn đoán sự nhiễm virus và đưa ra các biện pháp phòng trừ có ý nghĩa kinh tế rất lớn

Diện tích trồng mía ở nước ta lớn, triệu chứng vàng lá do virus Sugarcane yellow leaf virus cũng đã xuất hiện ở nhiều nơi Tuy vậy, hiện nay vẫn chưa có một

công trình nghiên cứu nào cụ thể đánh giá sự hiện diện và phân bố cũng như nguồn gốc của virus này ở nước ta Việc chẩn đoán và đánh giá tình hình, sự hiện diện nguồn

gốc và phân bố của Sugarcane yellow leaf virus là rất cần thiết trong việc hạn chế và

phòng ngừa thiệt hại do virus này gây ra tại Việt Nam

Với thực tế trên chúng tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu sugarcane yellow leaf virus gây bệnh vàng lá trên mía (YLS) bằng kính hiển vi huỳnh quang và kỹ

thuật RT-PCR”

Mục đích

­ Đánh giá tình trạng nhiễm virus ScYLV trên tập đoàn giống gốc và tập đoàn giống mới nhập nội từ Thái Lan tại Trung tâm Nghiên cứu Mía đường An Phú, huyện Bến Cát, tỉnh Bình Dương và các tỉnh Bình Dương, Đồng Nai, Long An dựa vào triệu chứng đặc trưng của bệnh vàng gân lá

sóng 510nm, từ đó thiết lập mối tương quan giữa kết quả quan sát bằng kính hiển vi huỳnh quang và triệu chứng vàng gân lá trên mía

Yêu cầu

thiết vật không có biểu hiện triệu chứng vàng gân lá

­ Nắm vững nguyên tắc và cách tiến hành phản ứng RT-PCR

PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Tổng quan về cây mía 2.1.1 Về cây mía

2.1.1.1 Phân loại học

Theo phân loại thực vật cây mía thuộc:

Ngành: Spermatophyta

Lớp: Monocotyledneae Họ: Gramineae

Loại: Saccharum

Trong loại Saccharum có năm loài:

- Loài nhiệt đới (Saccharum officinarum L.)

- Loài Trung Quốc (Saccharum sinence Roxb Emend Jesw) - Loài Ấn Độ (Saccharum barberi Jesw)

- Loài hoang dại thân nhỏ (Saccharum spontaneum L.)

- Loài hoang dại thân to (Saccharum robustum Bround và Jesw)

2.1.1.2 Nguồn gốc

a Loài nhiệt đới (Saccharum officinarum L.)

Số nhiễm sắc thể 2n = 80 Loài này có nguồn gốc từ các đảo phía nam Thái Bình Dương (Niu Ghinê), chỉ có nguồn gốc trong mía trồng không thấy ở dạng hoang dại

b Loài Trung Quốc (Saccharum sinence Roxb Emend Jesw)

Số nhiễm sắc thể 2n = 134 Loài này có nguồn gốc ở Trung Quốc, Miến Điện, Ấn Độ, miền bắc Việt Nam

c Loài Ấn Độ (Saccharum barberi Jesw)

Số nhiễm sắc thể 2n = 92 Loài này có nguồn gốc ở bắc Ấn Độ

d Loài hoang dại thân nhỏ (Saccharum spontaneum L.)

Số nhiễm sắc thể 2n = 112 Loài này mọc dã sinh từ sườn núi Himalaya đến

vùng Nam Ấn Độ Từ một nhóm thực vật nhỏ Saccharum spontaneum đã phát triển

thành một quần thể rộng lớn bao gồm nhiều loại hình khác nhau Grassl đã lập một

bảng gồm 16 loại hình Saccharum spontaneum khác nhau

e Loài hoang dại thân to (Saccharum robustum Bround và Jesw)

Số nhiễm sắc thể 2n = 84 Loài này mọc dã sinh ở vùng nhiệt đới, ở Niu Ghinê

(Trần Văn Sỏi)

2.1.1.3 Vị trí kinh tế của cây mía

Hiện nay ở nước ta mía là nguyên liệu duy nhất để chế biến ra đường, nên mía là một cây trồng quan trọng trong cơ cấu cây thực phẩm Đường là thức ăn lành tính dễ tiêu, giàu năng lượng Một cân đường cung cấp năng lượng tương đương với 0,5 kg mỡ; 50-60 kg rau quả Đường cung cấp 10% nhu cầu năng lượng của cộng đồng Trên thế giới năng lượng do đường cung cấp bằng 7% năng lượng do các loại ngũ cốc cung cấp (Trần Văn Sỏi, 2003)

Đường có thị trường tiêu thụ ổn định do nhu cầu về đường trong nước ngày càng tăng cao Đường lại là mặt hàng chế biến bằng công nghệ hiện đại nên chất lượng ổn định, dễ dàng đạt tiêu chuẩn quốc tế, cho nên nếu sản xuất nhiều sẽ xuất khẩu ra bất cứ nước nào trong khu vực Vì vậy nên người trồng mía không có gì lo ngại về thị trường tiêu thụ

Mía là cây xóa đói giảm nghèo cho nông dân trung du, miền núi, là cây có hiệu quả kinh tế cao Do mía là cây hàng năm, thích hợp với nhiều loại đất, bộ rễ bám sâu nên có khả năng chịu hạn khá, có thể trồng trên đất đồi và trung du miền núi Vì mía có khả năng lưu gốc tới vụ sau nên đỡ công và giống trồng Mía là cây có sản lượng cao (200-250 tấn sinh khối/1ha/năm) Nhờ những ưu thế trên mà cây mía trở thành cây làm giàu cho nhiều gia đình, nhiều khu vực như Thanh Hóa, Nghệ An, Phú Yên, Bình Định, Quảng Ngãi, …

Mía là cây năng lượng cuối thế kỷ XX và về sau Do nguồn nhiên liệu địa khai ngày càng cạn kiệt trong khi nhu cầu năng lượng trên thế giới càng tăng nên việc tìm ra một nguồn nguyên liệu thay thế có ý nghĩa rất quan trọng Nguồn năng lượng từ thực vật là hướng được nhiều quan tâm vì đây là nguồn năng lượng tái tạo được hàng năm không bao giờ cạn kiệt Trong đó, cây mía được coi là cây năng lượng hàng đầu trong các loại thực vật có thể sản xuất năng lượng lỏng Từ một tấn mía có thể sản xuất ra 35-50 lít cồn 960, có thể dùng làm nhiên liệu cho động cơ Ở Brazil từ lâu người ta đã sản xuất cồn từ mía để thay thế xăng chạy ô tô vận tải

Mía là cây kiêm dụng, ngoài đường, cellulose trong bã mía có thể làm giấy, làm gỗ ép thay cho một phần gỗ rừng Mía là cây ngắn ngày lại là cây đặc biệt cao sản nên rất có nhiều triển vọng trong lĩnh vực này

Mía với thành phần hóa học rất phong phú nên ngày càng được nhiều ngành công nghiệp quan tâm khai thác Saccarose được ngành đường khai thác để sản xuất đường trắng Cellulose được ngành giấy và ngành gỗ ép khai thác Mật rỉ trong quá trình lên men, chưng cất và các phương pháp hóa học khác có thể sản xuất ra rượu các loại, cồn tinh khiết, acid lactic, acid nitric, acid glutamic, men thực phẩm, …

2.1.1.4 Sản xuất protein tái tổ hợp từ mía

Việc sử dụng cây trồng như một nhà máy sinh học có năng suất cao đòi hỏi cả một hệ thống chuyển biến nạp và khả năng sản xuất, tích lũy ở mức độ cao các protein tái tổ hợp có giá trị kinh tế cao Wang và cộng sự (2001) đã tạo ra cây mía chuyển gene tạo ra protein dược liệu có giá trị cao là granulocyte macrophage-colony stimulating factor (GM_CSF) Trên một vài dòng mía đã tạo ra tới 0,03% protein tổng số giống GM-CSF GM-CSF được sản xuất từ mía có hoạt tính tự nhiên được chỉ ra trong thử nghiệm sự tăng sinh tế bào xương người Dịch trích từ mía kích thích sự phân chia của tế bào tủy xương (TF-1)

2.1.2 Một số bệnh do virus trên cây mía

2.1.2.1 Peanut Clump Furovirus

Peanut Clump Furovirus (PCV) gây bệnh đốm đỏ trên lá mía đã được công bố đầu tiên bởi Baudin và Chatenet (1988) Biểu hiện triệu chứng do Peanut Clump Furovirus gây ra thường biến đổi và phụ thuộc vào giống (Baudin và Chatenet, 1988;

Baudin và cộng sự, 1994; Rott, 1996) Các triệu chứng thường là xuất hiện những sọc vàng úa với những đốm vàng hay đỏ Toàn bộ lá sẽ trở thành màu nâu hơi vàng (Braithwaite, 2001)

2.1.2.2 Sugarcane Bacilliform Badnavirus

Công bố đầu tiên của dạng virus hình que trên mía là ở Cuba (Rodriguez-Lema

và cộng sự, 1985) Sau đó, Lockhart và Autrey (1988) đã công bố rằng dòng

Mex.57-473 trồng ở Morocco và Hawaii và CP44-101 từ Morocco đã chứa virus hình que

tương tự banana streak virus (BSV) được tìm ra gần đó (Lockhart, 1986) Virus có tên là sugarcane bacilliform virus (SCBV) có quan hệ gần với BSV và chúng được chứng

minh là cùng thuộc một loại virus (Lockhart và Olszewski, 1993)

Triệu chứng của SCBV thì thường biến đổi và không chắc chắn Sự đồng nhiễm

của SCBV và các virus khác đã được nhận thấy Tất cả các dòng nhiễm với sugarcane mild mosaic virus đều nhiễm SCBV (Lockhart và cộng sự, 1992)

Ảnh hưởng của SCBV với năng suất trên mía không được xác định rõ ràng Sinh khối sinh ra ở giống mía CP63-588 bị nhiễm SCBV giảm đáng kể từ 23-31%

trong khi sinh khối sinh ra tăng ở giống CP65-357 bị nhiễm SCBV 2.1.2.3 Sugarcane Mild Mosaic Closterovirus

Trong quá trình kiểm tra SCVB trên mía bằng kính hiển vi điện tử người ta đã thấy những dạng hạt dài khúc khuỷu ở Mauritius và Mỹ Những hạt này trước đây

không được biết đến trên mía và xuất hiện tương tự với Closterovirus Virus này ban đầu có tên là sugarcane clostero-like virus, nhưng bây giờ nó được gọi là sugarcane

mild mosaic closterovirus (SCMV; Lockhart và cộng sự, 1992) 2.1.2.4 Ramu Streak

Ramu streak được phát hiện đầu tiên ở vùng đất Ramu, Papua New Guinia vào

giữa những năm 1980 nhưng nó không được coi là vấn đề cho đến năm 1993 khi nó

xuất hiện trên giống Casius (Magarey và cộng sự, 1996) Triệu chứng của Ramu streak

tương tự với bệnh sọc vàng trên mía Ảnh hưởng của bệnh lên năng suất thì không

được biết đến

2.1.2.5 Reovirus ở Nam Phi

Một bệnh mới đã được tìm thấy ở Nam Phi năm 1994 (Bailey, 1996) Những nốt nhỏ xuất hiện trên bề mặt lá và bẹ lá nhưng thường thưa thớt và không dễ nhận thấy Bệnh này không biểu hiện ảnh hưởng trên cây trưởng thành

Những hạt virus hình cầu có thể được quan sát bởi kính hiển vi điện tử từ những nốt bệnh Hạt virus này có chứa dsRNA và primer của RT-PCR được thiết kế

cho Fiji disease virus (FDV) có thể được sử dụng để tạo ra sản phẩm PCR Triệu

chứng, kích thước, hình dạng virus và bộ gene RNA sợi đôi (dsRNA) chứng tỏ rằng

virus mới này tương tự với FDV và thuộc nhóm Reovirus

2.1.2.6 Fijivirus

Nguyên nhân của bệnh Fiji trên mía là do họ Reoviridae Bệnh này thường xảy

ra ở Australia Nó được truyền bởi vector là Perkisiella sp planthoppers Bệnh này

2.1.2.7 Sugarcane mosaic virus (SCMV)

Đây là virus được phân bố rộng rãi, nhưng sự đột phát thường bị giới hạn ở những vùng lạnh Sự mất mùa có thể lên tới trên 20% Bệnh này có thể được phát hiện dựa vào triệu chứng hoặc kỹ thuật ELISA, PCR, RFLP

2.2 Bệnh vàng gân lá trên mía và sugarcane yellow leaf virus

2.2.1 Bệnh vàng gân lá trên mía 2.2.1.1 Nguyên nhân

Triệu chứng vàng gân lá đã được biết đến từ lâu với những tên gọi khác nhau như “Yellow wilt” ở châu Phi (Ricaud, 1968; Siddiqi, 1969; Rogers, 1970) và “autum decline” ở Brazil (Hughes, 1964) (trích bởi Lockhart và cộng sự, 2000) Triệu chứng này cũng đã được nhận thấy ở Hawaii trong những năm 1980 và sau đó là nhiều nước khác trên khắp thế giới (Comstock và cộng sự, 2002; Izaguirre-Mayoral và cộng sự, 2002; Lockhart và cộng sự, 1996; Lockhart và Cronje, 2000; Vega và cộng sự, 1997; Viswanathan, 2002) Nhưng đến những năm 1980 người ta mới biết rõ về nguyên nhân gây bệnh (Schenk và Hu, 1991; Comstock và cộng sự, 1994) Có hai tác nhân liên

quan đến triệu chứng vàng lá trên mía Một là Sugarcane Yellow Leaf Virus (ScYLV) (Lockhart và cộng sự, 1996; Vega và cộng sự, 1997; Scagliusi và Lockhart, 2000) và tác nhân còn lại là Sugarcane yellows phytoplasma (ScYP) (Cronjé và cộng sự, 1998)

Tuy nhiên một vài báo cáo khác chỉ ra rằng triệu chứng tương tự cũng có thể bị gây ra bởi côn trùng, stress sinh lý, thời tiết, một vài phản ứng chống stress và một vài yếu tố vô sinh khác (Bailey và cộng sự, 1996; Matsuoka và Meneghin,1999)

2.2.1.2 Sự phân bố địa lý

Bệnh vàng gân lá do ScYLV hiện nay được báo cáo là hiện diện ở nhiều nước trên thế giới như Argentina, Australia, Barbados, Brazil, Colombia, Cuba, Dominican Republic, El Salvador, Guadeloupe, Guatemala, Hawaii, India, Iran, Jamaica, Kenya, Martinique, Mexico, Morocco, Mozambique, Nicaragua, Peru, Réunion, Senegal, Nam Phi, Swaziland, Thailand, Uganda, Mỹ, Venezuela, Zambia, Zimbabwe, … (Lockhart và cộng sự, 2000) (hình 2.1).

Hình 2.1 Sự phân bố của ScYLV trên thế giới

2.2.1.3 Triệu chứng

Triệu chứng đặc trưng của bệnh vàng gân lá giống nhau ở tất cả mọi nơi Gân lá màu vàng tươi, đặc biệt ở trên bề mặt và đỉnh của lá trở nên vàng, sau đó hoại tử Hoại tử lan rộng xuống bản lá cho tới khi toàn bộ lá bị nhiễm Thường thì lá non nhất không có biểu hiện triệu chứng, nhưng màu vàng xuất hiện ở những lá thứ tư hoặc thứ năm và những lá già hơn Những cây non thường không biểu hiện trên đồng ruộng mặc dù những cây non trong nhà kính đôi khi có những triệu chứng đặc trưng dưới những điều kiện stress (Schenck, 2001) Trong một vài trường hợp thì mặt dưới của gân lá trở nên vàng hơn lá già Mặt trên của gân lá có thể vẫn giữ màu bình thường (trắng hoặc trắng hơi xanh) hoặc có thể trở vàng, hồng hay hơi đỏ Sự đổi màu của gân lá thường xảy ra trong khi bản lá vẫn giữ màu xanh Ở một số giống màu vàng của lá có thể ảnh hưởng tới toàn bộ lá Sự thay đổi sang màu vàng cũng có thể lan rộng ra bản lá và hoại tử bắt đầu từ chóp lá phát triển tới bản lá Triệu chứng này thường tạm thời và nhạt dần khi cây bắt đầu được chăm sóc tốt

Sự biểu hiện triệu chứng vàng gân lá trên mía rõ ràng hơn ở những cây trưởng thành và những cây bị stress Sự biểu hiện triệu chứng liên quan đến giống, nhiệt độ

lạnh hoặc yếu tố stress khác và cây bị nhiễm trên đồng thường không có biểu hiện triệu chứng (Schenck và cộng sự, 2001)

Đối với những cây có triệu chứng YLS thì brix cao hơn từ 2 đến 3 lần so với những cây khỏe mạnh Vega và cộng sự (1997) đã nhận thấy sự tích lũy fenola trong mạch libe, điều đó chứng tỏ có sự rối loạn chức năng của mạch dẫn Ở những vùng lá khác nhau thì sự giảm tổng lượng đường, hàm lượng chlorophyl và sự vận chuyển đường đã được nhận thấy giữa cây có triệu chứng và cây không có triệu chứng nhiễm

với virus ScYLV

2.2.2 Sugarcane yellow leaf virus 2.2.2.1 Virus ScYLV

Sugarcane yellow leaf virus là một virus mới được mô tả gần đây, nó nhiễm vào

mía và gây ra triệu chứng vàng gân lá (YLS) (Vega và cộng sự, 1997; Scagliusi và Lockhart, 2000)

Hạt virus ScYLV có đường kính từ 24-29 nm trong sodium phosphatungstate ở pH5 (hình 2.2) Nó có tỉ trọng là 1,30g/cm3

trong Cs2SO4 và chứa 5,8 kb ssRNA Protein vỏ có trọng lượng 27 kDa và không chứa glycosylate (Scagliusi và Lockhart, 2000)

Hình 2.2 Sugarcane yellow leaf virus dưới kính

hiển vi điện tử (24-28nm), tỉ lệ thước 100nm (Nguồn: Scagliusi và Lockhart, 2000)

2.2.2.2 Huyết thanh học

Kháng huyết thanh từ barley yellow dwarf lueovirus (BYDV) kiểu huyết thanh

(serotype) PAV, MAV và RPV đã được kiểm tra cho phản ứng huyết thanh với mô

mía bị nhiễm ScYLV (Vega và cộng sự, 1997) Kết quả cho thấy có mối quan hệ huyết

thanh học giữa BYDV-PAV và ScYLV Bằng việc in những vết cắt mô gân lá lên màng nitrocellulose và xử lý chúng với huyết thanh miễn dịch BYDV-PAV, phản ứng miễn dịch dương tính đã được nhận thấy trong những tế bào libe của những bó mạch

(Vega và cộng sự, 1997) Kết quả dương tính chỉ nhận thấy ở những cây bị nhiễm với

ScYLV, nhưng không bao giờ thấy ở những cây khỏe mạnh được trồng bằng hạt trong nhà kính Huyết thanh miễn dịch đặc hiệu cho ScYLV được Lockhart nghiên cứu từ virus đã được tinh sạch (Scagliusi và Lockhart, 2000) Hiện nay nó đã được sản xuất thành công từ những mẫu ở nhiều nơi để phát hiện ScYLV bằng cả kỹ thuật ELISA và TBIA (Schenck, 2001)

2.2.2.3 Sự truyền nhiễm của ScYLV

Quá trình thử truyền mầm bệnh từ dịch trích của cây mía bị nhiễm với ScYLV

vào cây khỏe mạnh và các cây thảo mộc khác thì không thành công (Borth và cộng sự,

1994; Lockhart và cộng sự, 1996 (trích bởi Schenck, 2001); Scagliusi và Lockhart, 2000) Một vài loài rệp ở trên mía đã được kiểm tra khả năng truyền virus và kết quả là

rệp mía Melanaphis sacchari và rệp lá bắp Rhopalosiphum maidis (hình 2.3) là vector của ScYLV trong khi rệp vàng lá mía thì không (Angel và cộng sự, 2006; Scagliusi và

Lockhart, 2000; Schenck và Lehrer, 2000) Virus này không bị truyền bởi những hạt thuần hay bởi phương tiện cơ giới mà chỉ có thể lan rộng trên cánh đồng bởi hạt của

những cây đã bị nhiễm hoặc bởi những vector (Schenck và cộng sự, 2001)

Con rệp bắp (Rhopalosiphum maidis) thường ở trên cây bắp và nó ít khi phá hoại trên cây mía Theo Schenck và cộng sự (2001) rệp này cũng truyền ScYLV ở tỷ lệ thấp Rệp ở rễ cây lúa (Rhopalosiphum rufiabdomilanis) đã truyền ScYLV từ cây lúa bị nhiễm ScYLV sang cây lúa không bị nhiễm nhưng không truyền virus từ mía sang mía (Schenck và cộng sự, 2001)

Hình 2.3 Rệp lá bắp Rệp có cánh (A,B), rệp không cánh (C) trưởng thành

(Nguồn: http//:ipm_ncsu_edu-AG295-pics-corn_leaf_aphid_gif.htm)

2.2.2.4 Thời gian và không gian phân bố của ScYLV

Ở Lousiana thời gian gia tăng nhanh nhất của ScYLV xảy ra vào cuối mùa thu

và đầu mùa hè cùng với sự gia tăng và bắt đầu tàn phá của loài rệp mía Melanaphis sacchari (McAllister và cộng sự, 2006)

Ở Hawaii YLS thường xuất hiện nhất vào những tháng mùa hè do stress bởi nước Ở Florida triệu chứng này biểu hiện do hạn hán, úng nước và lạnh vào mùa đông Triệu chứng bắt đầu xuất hiện với những gân lá từ thứ 3 đến thứ 6 (tính từ ngọn xuống) trở nên vàng khi thời tiết bắt đầu trở lạnh vào tháng 10 và 11 Sau đó màu vàng lan ra bản lá và hoại tử bắt đầu từ đỉnh lá lan ra bản lá vào tháng 12 cho đến cuối mùa thu hoạch vào tháng 3 Từ tháng 1 đến tháng 3 toàn bộ cánh đồng trở thành màu vàng (Comstock và Miller, 2003) Borg (1997) đã báo cáo rằng YLS hiện diện rõ ràng nhất

suốt những tháng lạnh ở Australia và cũng tương tự ở Brazil 2.2.2.5 Những kí chủ khác của ScYLV

Các cây bắp, lúa, lúa mì, lúa mạch, yến mạch được lây nhiễm với ScYLV qua rệp được kiểm tra như là những kí chủ khác của ScYLV Những cây này được trồng từ hạt trong các chậu và được chủng với những rệp mía có mang virus Kết quả cho thấy các cây đều có thể bị nhiễm virus (lúa mì (wheat) 96,5%, yến mạch (oat) 94,6%, lúa

mạch (barley) 93,7%) nhưng chỉ có một tỉ lệ thấp của cây lúa và bắp được kiểm tra là

dương tính (lúa (rice) 8,5%, bắp (corn) 10,5%) (Schenck và cộng sự, 2001)

2.2.2.6 Những nghiên cứu về bộ gene của ScYLV

Dựa trên những phân tích trình tự nucleotide, ScYLV được xếp là một giống

mới trong họ luteoviridae Virus này cũng có những đặc tính của giống polerovirus, luteovirus và enamovirus (Moonan và cộng sự, 2000; Smith và cộng sự, 2000) Tuy

nhiên, nó được mô tả rõ ràng là một loài khác vì những đặc tính sinh học độc nhất và sự khác biệt ở mức độ phân tử mà nó được xem là sự tái tổ hợp giữa các loài khác nhau (Moonan và cộng sự, 2000; Smith và cộng sự, 2000)

Dựa vào trình tự và sự sắp xếp của các khung đọc mở (ORF), luteovirus được

chia thành hai nhóm phụ (subgroups I và II) Trình tự bộ gene của ScYLV đã được chứng minh là thuộc bộ gene của nhóm phụ II (hình 2.4)

Hình 2.4 Biểu đồ mô tả bộ gene của luteovirus thuộc nhóm phụ I và II

(Nguồn: Schenck, 2001)

Trình tự nucleotide hoàn chỉnh của bộ gene ScYLV được phân lập từ Ấn Độ đã được xác định Bộ gene RNA này dài 5899 nucleotide bao gồm 6 khung đọc mở (ORF):

ORF1 (72,5 kDa): mã hóa cho protein đa chức năng

ORF2 (64.4 kDa): mã hóa cho RNA polymerase không phụ thuộc RNA (RdRp)

ORF3 (21.8 kDa): mã hóa cho protein vỏ (CP)

ORF 4 (16.6 kDa): mã hóa cho protein di chuyển giả định p17 ORF5

ORF5 (52.1 kDa): mã hóa cho yếu tố truyền aphid giả định ORF0: chức năng chưa biết

Sự so sánh protein vỏ và trình tự 17kDa cho thấy ScYLV có quan hệ gần với

virus trong giống luteovirus Dựa trên trình tự ở đầu 5’ của ScYLV thì thấy nó tương tự với giống polerovirus, trong khi trình tự ở đầu 3’ thì gần với giống luteovirus Đây là những mô tả đầu tiên về đặc điểm phân tử của ScYLV ở Ấn Độ (Gaur và cộng sự,

2003)

Moonan và cộng sự (2000) đã giải trình tự bộ gene ScYLV Dựa trên trình tự

nucleotide mới của ScYLV và trình tự của luteovirus hiện tại, đồng thời sử dụng

phương pháp luận tiến hóa và phát sinh chủng loài để tìm vùng tương đồng của bộ

gene luteovirus Kết quả cho thấy tỷ lệ thay thế các nucleotide và tạo ra loài mới của luteovirus là có ý nghĩa về phương diện thống kê Kết quả cũng chỉ ra rằng Pea enation mosaic virus-1 (PEMV-1), Soybean dwarf virus (SbDV), và ScYLV biểu hiện

biến dị phát sinh chủng loài địa lý (spatial phylogenetic variation (SPV)) phù hợp với

sự tái tổ hợp xảy ra giữa hai tổ tiên là luteovirus và polerovirus sau khi có sự phân li di

truyền của hai nhóm tổ tiên này

Toàn bộ trình tự RNA gồm 5895 nucleotide của ScYLV được phân lập từ

Florida (ScYLV-F) đã được giải trình tự bao gồm 6 ORF (Smith và cộng sự, 2000)

Kết quả cho thấy, đầu 5’ thuộc vùng không dịch mã (UTR, untranslated region) bắt

đầu với trình tự ACAAAA thì phù hợp với motif ở đầu 5’ của polerovirus Bộ gene của ScYLV-F được sắp xếp giống như ở poleovirus

ORF0 của ScYLV-F bắt đầu ở codon AUG thứ nhất trong trình tự và nó mã hóa cho một protein 30,2 kDa

ORF1 của ScYLV-F mã hóa cho một protein 72,5 kDa tương tự với gene tương

đương ở trên bộ gene của polerovirus và Pea enation mosaic virus-1 (PEMV-1; enamovirus) cũng mã hóa cho một protease

ORF2 của SCYLV-F hầu như tương đồng với những gene RNA polymerase

không phụ thuộc RNA (RNA dependent RNA polymerase (RdRp)) của poleroviruses sobemoviruses, barnaviruses và PEMV-1 Đầu 5’ của ScYLV-F RdRp overlap trên

khung đọc 1 ở nucleotide 460 Có một trình tự heptamer, 5’GGGAAAC3’ ở trên overlap ở vị trí 1753 và trình tự ở đầu 3’ của motif heptamer có thể là ở dạng kẹp tóc (pseudoknot) (hình 2.5) Các trình tự này ở trên overlap của ORF 1 và 2 thì được bảo

tồn trên bộ gene của polerovirus và PEMV-1 và cho phép khung đọc dịch chuyển

ribosomal 1 từ gene ORF1 đến gene RdRP Heptamer và pseudoknot có thể là có cùng vai trò trong bộ gene của ScYLV-F và vì thế mà ORF 1 và 2 của ScYLV-F có thể được dịch mã liền nhau, sự dịch chuyển khung đọc tạo ra protein dung hợp (fusion protein) 120,6 kDa

ORF3 hầu như tương đồng với gene mã hóa protein vỏ (CP; 22 kDa) của BYDV-PAV

Tương tự ORF4 cũng tương đồng với gene mã hóa protein vận chuyển (MP)

(Smith và cộng sự, 2000) của BYDV-PAV Cũng như trên bộ gene của các luterovirid

khác, gene mã hóa protein vận chuyển (ORF4) nằm hoàn toàn trong trình tự mã hóa ORF3, trong khung đọc 1 Đầu N của protein vỏ (CP) (ORF3) của ScYLV-F thì giàu arginine và gene CP của ScYLV-F kết thúc với một đột biến vô nghĩa, giống như tất cả các gene CP ở các luteovirid khác và codon này được theo sau bởi codon đầu tiên của gene mã hóa protein RT (read-through, đọc xuyên: kiểu phiên mã di truyền mà việc tổng hợp RNA của một operon lại bắt đầu từ khởi điểm operon khác) (ORF5)

Trình tự quanh vùng đột biến vô nghĩa được bảo tồn cao (Smith và cộng sự, 2000)

Hình 2.5 Cấu trúc kẹp tóc giả định trong bộ gene của ScYLV

ORF0 của ScYLV mã hóa cho protein 30kDa có ít amino acid tương đồng với

các protein P0 của những polerovirus khác Trong 3 protein P0 của polerovirus

(PLRV, BWYV và CABYV) ảnh hưởng đến sự tích lũy của virus cũng như sự kìm

hãm của posttranscriptional gene silencing (PTGS) Sử dụng Nicotiana benthamiana

với cấu trúc GFP reporter, protein P0, và PTGS, Albert và cộng sự (2006) đã chỉ ra rằng protein P0 của SCYLV cũng im lặng ở vị trí PTGS bị gây ra bởi cấu trúc sense GFP (sGFP) Không giống như protein P0 của BWYV, PLRV và CABYV, protein P0 của SCYLV ức chế ảnh hưởng của PTGS bởi sGFP nhưng nó không được gây ra bởi cấu trúc inverted repeat GFP (irGFP) Phân tích chức năng protein P0 bằng cách xóa bỏ cấu trúc P0 của SCYLV cho thấy protein này có nhiều vùng cần thiết cho chức năng ức chế của protein này Thấm lá với protein P0 của SCYLV, kết quả là xuất hiện những vết hoại tử ở trên những đốm được thấm, sự hủy bỏ hoạt tính ức chế cũng mất đi sự hoại tử, điều đó chứng tỏ những hoạt tính này có thể được liên kết

Những nghiên cứu về đa dạng di truyền gần đây đã thừa nhận sự tồn tại một vài kiểu gene của ScYLV Để xác định và mô tả chính xác các kiểu gene của ScYLV, Abu và cộng sự (2006) đã giải trình tự toàn bộ bộ gene (gồm 6 ORF) của 8 ScYLV phân lập từ 6 vùng khác nhau (Brazil, China, Colombia, Cuba, Peru, và Reunion) Bốn kiểu gene của ScYLV (BRA ở Brazil, CUB ở Cuba, PER ở Peru và REU ở Reunion) đã được phát hiện dựa vào phân tích phát sinh chủng loài với trình tự bộ gene của 6 vùng này Những cặp primer đặc hiệu đã được thiết kế để phát hiện từng kiểu gene của ScYLV bằng RT-PCR Kết quả cho thấy một vài kiểu gene của ScYLV có thể cùng

tồn tại trên một vùng địa lý hoặc trên cùng một cây (Abu Ahmad và cộng sự, 2006)

2.2.3 Ảnh hưởng về kinh tế của bệnh vàng gân lá

ScYLV là một tác nhân gây bệnh quan trọng về kinh tế ở Cauca Valley, Colombia Trong năm 2004, tỉ lệ nhiễm virus này trên toàn bộ cánh đồng trồng mía nguyên liệu là 12,2% (S, J.C Angel và cộng sự, 2006) Ở Brazil virus này đã nhiễm

25% trên giống SP 71-6163 và 750 000 ha trên toàn bộ diện tích trồng mía (Vega và

cộng sự, 1997) Giống SP 71-6163 mẫn cảm cao với ScYLV, ước tính làm mất 60% lượng đường (Lockhart và cộng sự, 1996) ScYLV đã hiện diện trên toàn bộ các cánh đồng mía công nghiệp ở Lousiana (McAllister và cộng sự, 2006) Năng suất giảm 15 đến 20% cũng đã được báo cáo do ScYLV ở Louisiana (Grisham và cộng sự,

40-2002) Sự giảm năng suất (lượng đường trên đơn vị diện tích) ở giống LCP 82-89 cao nhất ở vụ gốc thứ hai là 23% (Grisham) Ở Florida có ít nhất 65% diện tích trồng mía

thương mại bị nhiễm với ScYLV (Irey và cộng sự, 1997; ) Ở Nam Phi và Hawaii ảnh

hưởng của YLS trên mía đã làm giảm đáng kể hàm lượng phức hợp polysaccharide (gums) được tách chiết (Lockhart và cộng sự, 2000).

2.2.4 Những nghiên cứu về tính kháng ScYLV trên mía

Marker phân tử liên kết với tính kháng đã được sử dụng để chọn lọc kiểu gene của những cá thể và có thể cung cấp công cụ để xác định tính kháng ở trên mía Mục tiêu là tìm những quần thể có những cá thể kháng lại bệnh vàng lá Kết quả là tìm thấy 39 dòng trong quần thể lai Green German x Ind 81-146 là không có bệnh SCYLV

trong suốt quá trình thí nghiệm (Comstock và cộng sự, 2005)

Comstock và cộng sự (2006) đã nghiên cứu về marker phân tử liên kết với tính kháng bằng cách sử dụng microsatellite primer Mục đích là phát triển phương pháp xác định các dòng kháng với ScYLV một cách nhanh chóng và chính xác Với 216 microsatellite primer đã xác định được 12 cây nhiễm và 11 cây kháng từ quần thể 65 cây con lai từ Green German (nhiễm) và IND 81-146 (kháng) Trong số 216 microsatellite primer có 167 primer cho ra ít nhất 4 band Kết quả đã chỉ ra rằng có 3 band đa hình microsatellite liên kết với tính kháng ScYLV Phân tích kiểu gene trên 47 cây con cho thấy có 2 loci SSR liên kết với tính kháng nhưng không liên kết với locus SSR khác

Trên một vài giống mía có khả năng kháng lại với ScYLV và tính kháng này có

thể di truyền được (Schenck và Lehrer, 2001) Những nghiên cứu về tính kháng trên

mía đã chỉ ra rằng các giống CC 84-75, CC 87-505, PR 61-632 mẫn cảm với ScYLV,

nhưng giống CC85-92 thì kháng tốt với ScYLV (Angel và cộng sự, 2006) Ở Hawaii

các giống H 78-4153, H 78-3567, H 78-7750 và H87-4319 được báo cáo là kháng với

ScYLV (Schenck và Lehrer, 2000)

Các giống mía mới, Saccharum officinarum ít mẫn cảm (như là S robustum Saccharum spontaneum, S sinensis và Erianthus sp.) thường không có virus ở trên

cánh đồng mía ở Maunawili, nó được cho là liên quan đến tính kháng (Schenck và

cộng sự, 2001)

2.2.5 Tạo cây mía chuyển gene kháng ScYLV

Giống mía kháng ScYLV có thể được tạo ra thông qua biến nạp Sự bất hoạt gene được coi như một cơ chế phổ biến cho sự kháng của cây trồng đối với sự nhiễm của virus Bất hoạt gene sau sao mã (posttranscriptional gene) đã được hướng tới trong cây mía bởi biến nạp với vùng không giải mã của ScYLV Bộ gene của ScYLV và chức năng các protein của virus đã được biết đến (F Moonan, 2000), vì thế chiến lược tạo ra cây mía kháng ScYLV có thể dễ dàng

Giống H62-4671 đã được biến nạp với một vùng trình tự DNA không dịch mã (non-traslatabe DNA sequence piece) của protein vỏ virus mà nó làm bất hoạt gene RNA của virus để chống lại sự nhiễm virus Mía có một hệ thống bất hoạt gene rất hữu hiệu (Y J Zhu, 2003)

Phôi phát sinh từ mô sẹo của giống lai CC 84-75 được bắn với plasmids pFM395 và pFM396 chứa một đoạn DNA mã hóa protein vỏ của ScYLV Những cây

đã biến nạp được ủ với ScYLV bởi Melanaphis sacchari Sự nhiễm được kiểm tra sau

một vài tháng bằng kỹ thuật TBIA và RT-PCR Kết quả thu được 37 cây từ 66 cây được kiểm tra là âm tính với ScYLV (Rangel và cộng sự, 2005)

2.2.6 Tạo cây mía sạch bệnh bằng kỹ thuật nuôi cấy mô

Có 3 phương pháp để loại bỏ virus được sử dụng là xử lý nhiệt, nuôi cấy mô, xử lý bằng hóa chất Tuy nhiên, xử lý nhiệt và hóa chất thì không có hiệu quả trong việc loại bỏ virus ScYLV (M Chatenet và cộng sự, 2001) Có thể tạo cây sạch ScYLV

bằng phương pháp nuôi cấy mô (M Chatenet và cộng sự, 2001; Y Parmessur và cộng

sự, 2002) Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng là phương pháp hiệu quả nhất trong việc sản xuất cây sạch virus và cũng là phương pháp được chọn để loại bỏ virus khỏi cây bị nhiễm Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng có thể tạo ra 92% cây sạch virus, nhưng chỉ đạt 29% khi

nuôi cấy bằng chồi đỉnh (M Chatenet và cộng sự, 2001) Tuy nhiên, theo Parmessur

(2002) khi nuôi cấy đỉnh sinh trưởng chỉ tạo ra 64% cây sạch virus, chỉ có 6% khi nuôi cấy bằng chồi nách Nhưng khi nuôi cấy từ mô sẹo sẽ tạo ra 100% cây sạch virus (Y

Parmessur và cộng sự, 2002)

2.2.7 Một số kỹ thuật trong chẩn đoán ScYLV

2.2.7.1 Phương pháp chẩn đoán nhanh bằng cây chỉ thị

Cây chỉ thị thực chất cũng là cây ký chủ của virus, nhưng đặc biệt hơn là chúng mẫn cảm cao với virus và tạo ra các triệu chứng rất điển hình trên thân, lá, … Các triệu chứng này giúp ta chẩn đoán khá chính xác các bệnh do virus

Đối với virus, có 2 nhóm chỉ thị: nhóm chỉ thị theo bộ phận (necrotic) và nhóm chỉ thị theo hệ thống (systemic) Nhóm chỉ thị theo bộ phận là những cây chỉ thị mà khi ta truyền bệnh nhân tạo sẽ có vết chết cục bộ ngay trên bề mặt lá mà không di

chuyển đến những bộ phận khác của cây Ví dụ như cây cà độc dược (Datura stramonium) khi bị nhiễm TMV sẽ xuất hiện những vết đốm chết hình tròn trên mặt lá

sau khi lây bệnh từ 3 - 5 ngày trong điều kiện nhiệt độ 25 - 30oC Nhóm chỉ thị theo hệ

thống là những cây chỉ thị mà khi ta truyền bệnh nhân tạo sẽ tạo sự chết hệ thống trên toàn cây (Vũ Triệu Mân và Lê Lương Tề, 1998)

2.2.7.2 Phương pháp chẩn đoán dựa vào triệu chứng

Triệu chứng bên ngoài: Các triệu chứng phổ biến là đốt cuối ngắn, vàng những lá cuối, mặt dưới của gân lá trở nên vàng hơn lá già, hoại tử bắt đầu từ chóp lá, …

Triệu chứng bên trong: Sự thay đổi tế bào và mô có thể quan sát qua kính hiển vi quang học hay kính hiển vi điện tử Người ta còn quan sát những cấu trúc khác nhau

do virus sản sinh ra, thường là những thể vùi

2.2.7.3 Phương pháp chẩn đoán bằng Brix kế

Độ brix được đánh giá vào giai đoạn mía 10 tháng tuổi bằng Brix kế trên gân chính lá +1 và được chia thành 4 mức độ nhiễm bệnh khác nhau:

hơn 14, phiến lá có màu vàng lan ra từ gân chính

từ cổ lá xuống bẹ lá, toàn bộ cây trong bụi có triệu chứng bệnh, độ brix lớn hơn 14, bụi có thể nhổ lên dễ dàng (Hà Đình Tuấn, 2004)

2.2.7.4 Phương pháp chẩn đoán bằng kính hiển vi huỳnh quang

Những lát cắt tươi được cắt từ gân, bẹ lá và thân bởi dao lam được làm tiêu bản trên một giọt nước cất hai lần trên lam kính và được quan sát dưới kính hiển vi quang học Toàn bộ mô được nghiên cứu với sự chuyển từ ánh sáng trắng sang ánh sáng xanh bởi đèn huỳnh quang Sự kiểm tra huỳnh quang với ánh sáng kích thích màu xanh được tiến hành thông qua một kính tách màu nhị sắc ở bước sóng 510nm và một kính lọc màu vàng chặn lại tại bước sóng 510nm

Hình 2.6 Các bó mạch gân lá được kiểm tra bởi kính hiển vi huỳnh quang (A) Chất huỳnh quang màu vàng xanh (đầu mũi tên) trong mạch libe với triệu chứng vàng gân lá

(B) Cây không có triệu chứng các bó mạch libe bình thường (J Vega và cộng sự, 1997)

Kiểm tra những lát cắt từ cây có triệu chứng vàng gân lá bởi phương pháp phát huỳnh quang đã phát hiện ra những bó mạch với chất phát huỳnh quang màu vàng xanh ở trong mạch libe (hình 2.6 A) Trong những cây không có biểu hiện triệu chứng thì hiếm khi xuất hiện màu huỳnh quang trong mạch libe (hình 2.6 B)

2.2.7.5 Phương pháp chẩn đoán bằng kính hiển vi điện tử

Những lát cắt cực mỏng từ lá, gân hoặc thân mía sau khi sử lý bằng hóa chất được quan sát dưới kính hiển vi điện tử

Virus được tìm thấy ở dạng kết tụ vô định hình trong tế bào chất của tế bào kèm của mạch libe Trong tế bào kèm, virus chỉ xuất hiện ở tế bào chất không thấy ở trong nhân hay các cơ quan tử khác của tế bào chất Đường kính của hạt virus từ 22 đến 24 nm

Hình 2.7 Vi ảnh điện tử của lát cắt siêu mỏng của tế bào kèm libe cây mía (VP: virus particles, CW: cell wall, N: nucleus, tỷ lệ thước 100nm)

(Nguồn: Vega, 1997)

2.2.7.6 Phương pháp chẩn đoán bằng kỹ thuật DAS-ELISA

Kháng nguyên thu được (hạt virus tinh sạch) sẽ được tiêm vào thỏ New Zeland để thu globulin miễn dịch Kháng thể sau khi sản xuất sẽ được sử dụng cho DBIA, TBIA, ISEM để phát hiện các mô bị nhiễm ScYLV (Angel và cộng sự, 2006)

DAS-ELISA được thực hiện trên kháng nguyên từ lá mía và dịch nước mía cho thấy kháng nguyên từ dịch nước mía có chuẩn độ cao hơn kháng nguyên từ lá mía (R

Viswanathan và M Balamuralikrishnan, 2004)

2.2.7.7 Phương pháp chẩn đoán bằng tissue blot immunoassay (TIBA)

Cũng giống như ELISA, TIBA sử dụng kháng thể chống lại virus Nhựa từ cây được chuyển lên một màng nylone hay nitrocellulose và virus được phát hiện nhờ vào mẫu dò được đánh dấu Quy trình này không cần nhiều thao tác như ELISA, nhanh, nhạy, đơn giản (không cần dịch chiết của virus), không đắt tiền (chỉ cần số

lượng trang thiết bị tối thiểu), thích hợp cho khảo sát 1000 - 2000 mẫu trên ngày Kit cũng đã sẵn có cho nhiều virus

Hình 2.8 Kết quả TIBA của vết in gân lá khỏe (trên) và lá bị nhiễm (dưới)

(Comstock và Gilbert)

Sự nhiễm ScYLV được xác định bằng một kháng thể đặc hiệu cho ScYLV Lá được cắt khỏi cây và bản lá được cắt khỏi gân lá trong một thời gian ngắn Vị trí gốc của gân lá được cắt bằng dao mỏng Miếng cắt gân lá được cố định trên màng nitrocellulose Sau đó màng được rửa với huyết thanh sử dụng kháng thể đặc hiệu cho ScYLV được tạo ra bởi B E Lockhart, Đại học Minnesota (Minneapolis) (theo Comstock và Miller (2003)) Sau đó được phủ bởi cơ chất tạo màu Kính hiển vi ba chiều được dùng để kiểm tra vết lá in Vì ScYLV được xác định ở trong mạch libe nên mẫu dương tính cho sự hiện diện của virus khi những bó mạch libe trong vết lá in có màu xanh (Comstock và Miller, 2003) (hình 2.8 và 2.9).

Hình 2.9 Màng nitrocellulose được xử lý bằng kỹ thuật TBIA với huyết thanh của BYDV-PAV Kết tủa xuất hiện ở mạch libe của gân lá (A và B), lá (C),

thân (D) Tỷ lệ thước 200µm (Nguồn: Vega, 1997)

2.2.7.8 Chẩn đoán ScYLV bằng kỹ thuật Immunoblotting (western blotting)

Sau khi điện di protein trên SDS-PAGE, polypeptides được chuyển lên màng nitrocellulose để thực hiện Immunoblotting (western blotting) Màng được ngâm 2 phút trong 2% Tween 20 (v/v) và ủ qua đêm ở 40C với kháng thể sơ cấp (toàn bộ huyết thanh) được pha loãng với tỉ lệ 1:5000 trong TTBS chứa 1% gelatin Những band protein được phát hiện dựa vào 5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate và nitroblue tetrazolium (BCIP/NBT) Hạt virus ScYLV chứa protein 27 kDa, là một polypeptide được xác định bằng cách nhuộm với Coomassie blue (hình 2.11A) Protein 58, 27 và 17 kDA (6 band) được xác định bằng western blotting với kháng huyết thanh ScYLV (hình 2.11,lane1)

Hình 2.10 Kết quả immunoblotting (westren blotting) của protein ScYLV

(Nguồn: Scagliusi và Lockhart, 2000)

2.2.7.9 Real -Time PCR

Sử dụng phân tử beacon (Tyagi và Kramer, 1996; Eun và Wong, 2000) trong chẩn đoán virus cho phép phát hiện nhanh, nhạy và đặc hiệu hơn các kỹ thuật khác Kết hợp kỹ thuật phân tử beacon với sự khuếch đại dựa trên trình tự acid nucleotide (NASBA: nucleic acid sequence-based amplification, Kievits và cộng sự, 1991) cho phép đồng thời khuếch đại và phát hiện RNA của virus trong một tube kín, được gọi là

AmpliDet RNA (Leone và cộng sự, 1998) NASBA là phương pháp khuếch đại RNA

đích của virus trong điều kiện đẳng nhiệt ở 410C sử dụng hai oligonucleotide primer đặc hiệu và enzyme AMV-reverse transcriptase (AMV-RT), RNase H và T7-RNA polymerase Gần đây, AmpliDet RNA đã được sử dụng để xác định một số virus thực vật (Klerks và cộng sự, 2001; Leone và cộng sự, 1998; Szemes và cộng sự, 2002) AmpliDet RNA có độ nhạy cao và ổn định cho việc phát hiện những virus ở trong mô cây phức tạp như vỏ, chồi, củ và quả Hơn nữa, AmpliDet RNA phát hiện được đồng thời nhiều virus riêng biệt trong cùng một tube (Klerks và cộng sự, 2001; Szemes và cộng sự, 2002)

Hình 2.11 Phân tử Beacon

(Nguồn: http://www.molecular-beacons.org)

Phân tử beacon MB ScYLV được thiết kế để mang trình tự 6 nucleotide tự bổ sung với nhau ở đầu 5’ và đầu 3’ Trình tự 21 nucleoitde bổ sung cho sản phẩm NASBA đặc hiệu cho ScYLV được chọn để lai với vùng tương tự như biotinylated probe BIO ScYLV Phân tử beacon được kết hợp với 6-carboxyfluorescein (FAM; bị kích thích ở bước sóng 494 nm, phát sáng ở bước sóng 530 nm) và quencher 4-[4 -

Vùng mang trình tự bổ sung với DNA đích

dimethylaminophenylazo]-benzoic acid (DABCYL) riêng biệt ở đầu 5’ và 3’ Đầu 6 nucleotide cấu trúc sợi đôi ở 410C sẽ kìm hãm sự phát quang khi không có sự bắt cặp với trình tự đích Khi có mặt gene đích probe sẽ bắt cặp với gene đích đồng thời với sự phát huỳnh quang Tín hiệu huỳnh quang được đo ở bước sóng 530nm sau mỗi 2 phút

Phương pháp này có độ nhạy cao với ScYLV, có thể phát hiện ScYLV ở mật độ rất nhỏ 10fg (femtogram, 1fg = 10-15

g) Phương pháp cho phép phát hiện ScYLV sau

khi pha loãng mẫu 1000 lần (Gonçalves và cộng sự, 2002)

2.2.7.10 Chẩn đoán ScYLV bằng kỹ thuật RT-PCR

RT-PCR được thực hiện trên dịch trích mô bị nhiễm ScYLV với cặp primer

Lu1 và Lu4 đặc hiệu cho nhóm virus luteovirus (Irey và cộng sự, 1997) Cặp primer

Lu1 và Lu4 tạo ra sản phẩm có kích thước 530bp đặc hiệu cho gene mã hóa protein vỏ của virus (Robertson và cộng sự, 1991 (trích bởi Schenck, 2001)) Những primer này được sử dụng để tách trình tự acid nucleotide của ScYLV mà nó được chứng minh rằng có khoảng 40% tương đồng với trình tự PAV của kiểu huyết thanh BYDV Từ trình tự của ScYLV được phân lập từ Florida, một cặp primer khác đã được tạo ra

(YLS111 và YLS462), nó đặc hiệu cho ScYLV (Irey và cộng sự, 1997) Primer này

khuếch đại gene mã hóa cho protein vỏ của ScYLV Sản phẩm khuếch đại có kích thước 352bp Ngày nay cặp primer này được sử dụng để phát hiện ScYLV ở các nơi như Brazil, Colombia, Taiwan, Mauritius và Mexico Florida, Hawaii, (Irey, thông tin cá nhân)

Ngoài ra các cặp primer khác khuếch đại gene mã hóa protein vỏ cũng được sử dụng để phát hiện ScYLV như các cặp primer:

­ RT-PCR sense primer – P1f GCT AAC CGC TCA CGA AGG AAT GT (3660–3882bp)

­ RT-PCR antisense primer – P2r GAA GGG GGC CGG GAA GAC T (4091–4109 bp)

­ RT-PCR sense primer – P3f CAG GTG CAA TCG CAC TTG AAG TGG A (3997–4021bp)

­ RT-PCR antisense primer – P4r GAA TTG TCC TGC TAG GCT CGA (4179–4199bp)

­ NASBA sense primer – N2f CAG GTG CAA TCG CAC TTG AAG

TGG A (3997–4022bp) (Gonçalves và cộng sự, 2002)

2.3 Những nghiên cứu về ScYLV trên thế giới và ở việt nam 2.3.1 Những nghiên cứu về ScYLV trên thế giới

Triệu chứng vàng lá xuất hiện trên mía ở Hamakua thuộc bờ biển của đảo Hawaii năm 1989 Chúng được thấy ở trên những cánh đồng giống H65-7052 và nó không giống như triệu chứng của sự thiếu dinh dưỡng Sau đó triệu chứng này đã được tìm thấy ở tất cả các cánh đồng ở Hawaii (Schenck, 1990; trích bởi Schenck, 2001)

Bệnh vàng gân lá gây ra bởi ScYLV là một bệnh quan trọng tiềm tàng được nhập vào Louisiana gần đây Một cuộc khảo sát rộng để xác định sự phân bố của ScYLV cho thấy virus này đã hiện diện trên tất cả các vùng trồng mía công nghiệp ở Louisiana (McAllister, 2006)

Ở Ecuador có 2 bệnh virus chính trên mía là bệnh vàng lá do SCYLV và bệnh khảm do Sugarcane mosaic virus (SCMV) Phạm vi tác động của bệnh vàng gân lá trên những cánh đồng thương mại cao và bệnh này đã lan rộng trong cả nước (Garcés và cộng sự, 2006)

Ở Mauritius YLS đã được tìm thấy đầu tiên vào năm 1994 trên giống CP 72 1210 Tiếp sau đó triệu chứng này đã được tìm thấy ở một vài giống khác và sự hiện

ScYLV được phát hiện đầu tiên ở Nam Phi năm 1997 ScYLV xuất hiện và lan rộng nhanh chóng trên những cánh đồng chọn lọc và lai tạo giống ở Pongola từ những cây bị nhiễm sang những cây mẫn cảm chưa nhiễm khi chúng được trồng gần nhau

Ở Colombia ScYLV đã được phát hiện năm 1998 Nó đã nhiễm vào một vài giống thương mại, đặc biệt là giống CC 84-75 được trồng phổ biến thứ hai trên các vùng trồng mía của nền công nghiệp mía Colombia Vì sự mẫn cảm của hầu hết các giống lai và tính quan trọng của giống CC 84-75, triển vọng tạo ra những cây chuyển gene kháng lại ScYLV đã được nghiên cứu (Rangel và cộng sự, 2005)

Tương tự triệu chứng héo vàng cũng được nhận thấy ở trung tâm và đông châu Phi ở những năm 1960

Ở Brazil đã xuất hiện trên giống SP 71-6163 năm 1990 với diện tích 750000 ha Hạt virus và kháng nguyên của ScYLV đã được xác định bởi EM, ISEM và DAS-ELISA trên các mẫu mô lá mía có triệu chứng YLS từ Australia, Brazil, Colombia, Mỹ, Guadeloupe, Malawi, Mauritius, Reunion Island, và Nam Phi Kết quả

dương tính với ScYLV ở tất cả các mẫu trên (Scagliusi và Lockhart, 2000) Chứng tỏ đã xuất hiện ScYLV ở tất cả các nước trên

Toàn bộ bộ gene (gồm 6 ORF) của 8 ScYLV phân lập từ 6 vùng khác nhau (Brazil, China, Colombia, Cuba, Peru, và Reunion) đã được giải trình tự Bốn kiểu gene của ScYLV (BRA ở Brazil, CUB ở Cuba, PER ở Peru và REU ở Reunion) đã được phát hiện dựa vào phân tích phát sinh chủng loài với trình tự bộ gene của 6 vùng này Cặp primer đặc biệt đã được thiết kế để phát hiện từng kiểu gene của ScYLV

bằng RT-PCR (Abu Ahmad và cộng sự, 2006).

Ở Hawaii một vài kỹ thuật miễn dịch đã thành công trong việc chẩn đoán sự nhiễm của ScYLV dựa trên những kháng thể đặc hiệu Mặc dù vậy quá trình tinh sạch virus từ cây bị nhiễm gặp phải khó khăn do virus bị hạn chế trong mạch libe và hiện diện với nồng độ thấp Một lượng nhỏ protein của mía còn lại gây trở ngại cho độ đặc hiệu của kháng thể Vì thế một kháng thể có hoạt tính và độ đặc hiệu cao đã được nghiên cứu và được sử dụng trong chẩn đoán mà không bị trở ngại bởi protein của mía

và các luteovirus hay polerovirus (Wang, Schenck và Albert, 2006)

ScYLV là tác nhân gây bệnh quan trọng về kinh tế ở Cauca Valley (Colombia) Trong suốt năm 2004, tỉ lệ nhiễm bệnh ScYLS trên các cánh đồng thương mại là 12,2% Sự hiện diện của các nòi ScYLS đã được xác định bằng kỹ thuật RT-PCR với primer o-FM359/323 Kết quả thu được là một band 1200bp đã được khuếch đại Khi

cắt sản phẩm này với enzyme cắt Sau 3AI thì thu được 3 band Band 100bp và 200bp

được phát hiện thì phù hợp với nòi ở Brazil và band 300bp là đặc thù của nòi Florida Những mẫu xuất hiện đồng thời 3 band thì có thể là một nòi mới (Angel và cộng sự, 2006)

Texas-Comstock và cộng sự (2005) đã sử dụng marker phân tử để xác định tính kháng ScYLV trên mía

2.3.2 Những nghiên cứu về ScYLV ở Việt Nam

Hà Đình Tuấn (2004) đã dựa vào triệu chứng và Brix kế để nghiên cứu về bệnh vàng gân lá Kết quả cho thấy hầu hết các giống được nghiên cứu đều nhiễm bệnh vàng gân lá Đây là nghiên cứu về bệnh vàng gân lá đầu tiên tại Việt Nam