Sau khi ổn định qui trình cho phù hợp với phịng thí nghiệm chúng tơi tiến hành kiển tra đối với 9 mẫu đại diện. Kết quả ở Hình 4.9 cho thấy cĩ 4 mẫu đƣợc kiểm tra bằng kỹ thuật RT-PCR cho kết quả dƣơng tính với cặp mồi YLS111 và YLS462.
Các giống K84-200, ROC16, R570, DLM24 đều cho kết quả RT-PCR dƣơng tính. Đồng thời các mẫu này cũng đều cĩ biểu hiện rõ ràng của bệnh vàng gân lá do ScYLV. Các giống Comus, ROC26, C2217, Ja6420, RB72454 khơng cĩ biểu hiện triệu chứng vàng gân lá và âm tính với phản ứng RT-PCR. Điều này chứng tỏ rằng các
352bp M 1
triệu chứng vàng gân lá đã nêu ở mục 4.1 là các triệu chứng đặc trƣng cho bệnh vàng gân lá do ScYLV gây ra.
Hình 4.9. Kết quả điện di sản phẩm RT-PCR
(Giếng 1: K84-200; giếng 2: R570; giếng 3: Comus; giếng 4: RB72454; giếng 5: ROC16; giếng 6: ROC26; giếng 7: C2217; giếng 8: DLM24; giếng 9: Ja6420; M: thang chuẩn kích
thƣớc 1kb).
Các giống âm tính cĩ thể mang đặc tính kháng với ScYLV hoặc cĩ thể là chƣa nhiễm với ScYLV tại thời điểm đƣợc kiểm tra. Khả năng các giống này chƣa nhiễm là rất thấp vì các giống này đƣợc trồng cạnh các giống đang nhiễm nên chúng dễ dàng bị nhiễm. Song khi đƣợc kiểm tra kết quả đều âm tính với các mẫu này. Điều này cho thấy cĩ thể giả thiết các giống này mang đặc tính kháng là nhiều hơn.
Kết quả RT-PCR này cũng là một trong những bằng chứng đầu tiên về mặt phân tử chứng tỏ ScYLV đã hiện diện tại Việt Nam.
352 bp 1 2 3 4 5 M 6 7 8 9
PHẦN 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận
Tỷ lệ nhiễm bệnh vàng gân lá theo giai đoạn sinh trƣởng:
Đẻ nhánh 32,89%
Đầu vƣơn lĩng 35,00%
Giữa vƣơn lĩng 66,67%
Thu hoạch 77,50%
Tỷ lệ nhiễm bệnh vàng gân lá theo nguồn gốc giống:
Thái Lan 42,55% Ấn Độ 50,00% Việt Nam 78,57% Braxin 0,00% Cuba 25,53% Pháp 100,00% Australia 0,00% Hawaii 40,00% Việt Nam gốc Mỹ 100,00% Đài Loan 61,90%
Tỷ lệ nhiễm bệnh vàng gân lá theo địa phƣơng:
Giống mới nhập từ Thái Lan 25,00%
An Phú 58,33%
Tập đồn giống gốc 29,03%
Tân An 66,67%
Mỹ Thạnh 77,50%
Phú Lý 35,56%
Kính hiển vi huỳnh quang cĩ thể phát hiện những bĩ mạch libe bị tấn cơng bởi virus khi chúng bị kích thích bởi ánh sáng xanh (blue) ở bƣớc sĩng 510nm. Cĩ thể sử dụng kính hiển vi huỳnh quang để chẩn đốn sự nhiễm của virus.
Qui trình RT-PCR chúng tơi thực hiện là qui trình cĩ thể đƣợc sử dụng để kiểm tra sự hiện diện của virus ScYLV.
Kết quả RT-PCR cho thấy các giống K84-200, ROC16, R570, DLM24 đều nhiễm với ScYLV. Các giống Comus, ROC26, C2217, Ja6420, RB72454 khơng phát hiện cĩ nhiễm virus. Đây là bằng chứng đầu tiên về mặt phân tử chứng tỏ đã cĩ sự hiện diện tại Việt Nam.
5.2 Đề nghị
Đánh giá sự hiện diện của ScYLV ở diện rộng hơn bằng các kỹ thuật RT-PCR TBIA hoặc ELISA.
Áp dụng qui trình RT-PCR chúng tơi thực hiện để chẩn đốn ScYLV.
Nghiên cứu về hợp chất phenol cĩ khả năng phát huỳnh quang tích tụ trong bĩ mạch libe của cây khi bị virus tấn cơng.
Nghiên cứu sâu hơn về các giống chƣa phát hiện bệnh để tìm tính kháng.
Giải trình tự sản phẩm RT-PCR để khẳng định và so sánh trình tự gene của ScYLV ở Việt Nam với nƣớc khác.
TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT
1. Bùi Chí Bửu, Nguyễn Thị Lang, 2004. Di truyền phân tử. Nhà xuất bản Nơng Nghiệp Tp HCM. Trang 270-282.
2. Hồ Huỳnh Thùy Dƣơng, 1998. Sinh học phân tử. Nhà xuất bản giáo dục. Trang
190-204.
3. Trần Kim Đồng, Nguyễn Quang Phổ, Lê Thị Hoa, 1991. Giáo trình sinh lý cây trồng. Nhà xuất bản đại học và giáo dục chuyên nghiệp, Hà Nội, 1991. Trang 190-
204.
4. Nguyễn Thị Lang, Bùi Chí Bửu, 2005. Sinh học phân tử giới thiệu phương pháp
và ứng dụng. Nhà xuất bản Nơng Nghiệp tp HCM. Trang 87-96, 107-119.
5. Nguyễn Thị Lang, 2002. Phương pháp cơ bản trong nghiên cứu cơng nghệ sinh
học. Nhà xuất bản Nơng Nghiệp Tp HCM. Trang 38-46, 114-130, 160-166.
6. Vũ Triệu Mân, 2003. Chẩn đốn nhanh bệnh hại thực vật. Nhà xuất bản Nơng
Nghiệp Hà Nội. Trang 37-43, 56-95.
7. Vũ Triệu Mân, Lê Lƣơng Tề, 1998. Giáo trình bệnh cây nơng nghiệp. Nhà xuất
bản Nơng Nghiệp Hà Nội. Trang 17-21, 220-232.
8. Trần Văn Sỏi, 2003. Cây mía. Nhà xuất bản Nghệ An. Trang 7-26.
9. Hà Đình Tuấn, 2004. Điều tra thành phần bệnh hại mía trên một số giống mía mới nhập nội và khảo sát diễn biến bệnh hại quan trọng ở vùng mía nguyên liệu miền Đơng Nam Bộ. Luận văn thạc sĩ ngành nơng học đại học Nơng Lâm Tp Hồ
Chí Minh.
TÀI LIỆU TIẾNG NƢỚC NGỒI
10. Ahmad Y Abu, M Royer, L Costet, J-H Daugrois, J-M Lett, J.I Victoria and P Rott, 2006. Genotyping of Sugarcane yellow leaf virus in Colombia, Guadeloupe and Reunion. VIIIth ISSCT Pathology Workshop Petit-Bourg, Guadeloupe (FWI) 23 - 27 January 2006 Programme and Abstracts.
11. Henrik H Albert, Tichaona Mangwende, Ming-Li Wang, T. Erik Mirkov, 2003. Functional Analysis Of The P0 Protein Of Sugarcane Yellow Leaf Virus: A Suppressor Of Posttranscriptional Gene Silencing. Plant & Animal Genomes XIV Conference. Workshop: Intl. Consortium for Sugarcane Biotech. (ICSB) January
12. S. M. Aljanabi, Y. Parmessur, Y. Moutia, S. Saumtally and A. Dookun, 2001. Further evidence of the association of a phytoplasma and a virus with yellow leaf syndrome in sugarcane. Plant Pathology 50, p 628±636.
13. Angel S. J.C, Guzmán R. M. L, Angel S. F, Victoria K. J. I, 2006. Studies on the Sugarcane yellow leaf virus (SCYLV) in Colombia. VIIIth ISSCT Pathology Workshop Petit-Bourg, Guadeloupe (FWI) 23 - 27 January 2006 Programme and Abstracts.
14. Kathryn S. Braithwaite, 2003. New virus and virus – like diseases of sugarcane – an overview. Sugarcane pathology. Volume II: virus and phytoplasma diseases. Sugarcane Pathology: Virus and Phytoplasma Diseases v. 2 (G.P. b, R.E. Ford, M.Tǒsic and D.S. Teakle). Science Publishers, Inc: p 3-24.
15. Chatenet M., Delage C.,. Ripolles M, Irey M., Lockhart B. E. L, and Rott P., 2001. Detection of Sugarcane yellow leaf virus in quarantine and production of virus-free sugarcane by apical meristem culture. Plant Dis. 85: p1177-1180.
16. Comstock J. C. and. Gilbert R. A. Sugarcane Yellow Leaf Disease. University of Florida, IFAS extension. SS-AGR-256.
http://edis.ifas.ufl.edu/pdffiles/SC/SC07400.pdf
17. Comstock J. C. and Miller J. D., 2003. Incidence and spread of sugarcane yellow leaf virus in sugarcane clones in the cp-cultivar development program at Canal Point. Journal American Society of Sugarcane Technologists, Vol. 23, 2003, p71-
78.
18. Comstock J. C., Sood S., and McCorkle K., 2005. Characterization of Sugarcane Populations for Disease Reactions for Use in Molecular Marker Research. Agricultural absracts 2005 annual meeting. Journal American Society Sugar Cane
Technologists, Vol. 25, 2005. [Abstracts].
19. Comstock Jack C., Chaparro Jose X., Tai Peter Y. P., Serge Edme, Katherine McCorkle, Jim D. Miller, 2004. The Association Of Microsatellite Markers With Resistance To Sugarcane Yellow Leaf Virus. Workshop: Intl. Consortium for
Sugarcane Biotech (ICSB). Plant & Animal Genomes XII Conference January 10- 14, 2004. Town & Country Convention Center San Diego, CA.
20. Cronjé C.P.R., 2004. Sugarcane viruses in sub-Saharan Africa. Plant virology in sub-Saharan Africa, p 492-497.
21. Cu Ramon, Manjunath K. L.,. Petersen Y,. Hiebert E and Davis M. J., 2004. Development of a Serological Diagnostic Probe to Detect the Sugarcane Yellow Leaf Luteovirus (SCYLV) Using Phage Display Technology. Journal American Society Sugar Cane Technologists, Vol. 24, 2004. [Abstracts].
22. Edon Carine, Vaillant Jean, Sauvion Nicolas and Daugrois J.H., 2006. Spatiotemporal evolution of plant infection by SCYLV in a disease free plot. Toward modeling virus spread in tropical conditions. VIIIth ISSCT Pathology Workshop Petit-Bourg, Guadeloupe (FWI) 23 - 27 January 2006 Programme and Abstracts.
23. Garcés Freddy, Reyna Medina and Eloy Orellana, 2006. Transmission of Sugarcane yellow leaf virus and Sugarcane mosaic virus in Ecuador. VIIIth ISSCT Pathology Workshop Petit-Bourg, Guadeloupe (FWI) 23 - 27 January 2006 Programme and Abstracts.
24. Gaur R.K., Rao G.P., Maneesha Singh and Axel T. Lehrer, 2003. Sequence analysis of the entire RNA genome of sugarcane yellow leaf luteovirus of an Indian isolate BSPP Presidential Meeting 2003 (15th – 18th December 2003) Plant Pathogen Genomics - From Sequence To Application Jubilee Campus, University of Nottingham, UK.
25. Goldstein C., Wang M-L. and Albert H., 2002. Production of recombinant protein in sugarcane and rice. Hawaii Agriculture Research center Annual report 2001- 2002. p10-11.
26. M.C. Gonçalves, M.M. Klerks,, M. Verbeek, J.Vega and J.F.J.M. van den Heuvel, 2002. The use of molecular beacons combined with NASBA for the sensitive detection of Sugarcane yellow leaf virus. European Journal of Plant Pathology
108: p401–407, 2002. Kluwer Academic Publishers. Printed in the Netherlands.
27. Lockhart Ben E., Cronjié C. Pieter R., Rott P., Bailey Roger A., Comstock Jack C., Barry J. Croft, A. Salem Saumtally, 2000. Yellow leaf syndrome. A guide to sugarcane diseases. CIRAD/ISSCT
28. McAllister C. D., Hoy J. W., and Reagan T. E., 2006. Temporal increase and spatial distribution of yellow leaf and sugarcane aphid infestations VIIIth ISSCT Pathology Workshop Petit-Bourg, Guadeloupe (FWI) 23 - 27 January 2006 Programme and Abstracts.
29. Moonan F., Molina J., and Mirkov T. E., 2000. Sugarcane yellow leaf virus: An emerging virus that has evolved by recombination between luteoviral and poleroviral ancestors. Virology 269: p156-171. Academic Press.
30. Parmessur Y., Aljanabi S., Saumtally S. and Dookun-Saumtally A., 2002. Sugarcane yellow leaf virus and sugarcane yellows phytoplasma: elimination by tissue culture. Plant Pathology. Volume 51 Page 561-566.
31. M. Paola Rangel, Lorena Gomez, Jorge I. Victoria, Fernando Angel, 2005. Transgenic plants of CC 84-75 resistant to the virus associated with the sugarcane yellow leaf disease. Silver jubilee congress Guatemala january 30 - february 4, 2005 abstracts of papers. International Society of Sugar Cane Technology.
32. Rassabya L.,. Girard J.-C, Lemaire O., Costet L., Irey M. S., Kodja H.,. Lockhart B. E. Land Rott P., 2004. Spread of Sugarcane yellow leaf virus in sugarcane plants and fields on the island of Réunion. Plant Pathology. Volume 53 Page 117-125. 1. Sambrook J. and Russell D. W, 2001. Molecular Cloning- A laboratory manual.
Volume 1. Third edition. CSHL Press, New York. p 7.1 – 7.88.
33. Scagliusi Sandra Mansur and Lockhart B. E. L., 2000. Transmission, characterization, and serology of a luteovirus associated with yellow leaf syndrome of sugarcane. Phytopathology 90: p120-124.
34. Schenck S., Lehrer A.T., Wu K.K., 2001. Yellow Leaf Syndrome. Hawaii Agriculture Research Center, Pathology Report 68 February 2001.
http://www.hawaiiag.org/harc/path68.pdf.
35. Schenck Susan, 2001. Sugarcane yellow leaf syndrome: History and current concepts. Sugarcane pathology. Volume II: virus and phytoplasma diseases. Sugarcane Pathology: Virus and Phytoplasma Diseases v. 2 (G.P. Rao, R.E. Ford, M.Tǒsic and D.S. Teakle). Science Publishers, Inc: p24-35.
36. Smith Grant R., Borg Zara, Lockhart Ben E. L., Braithwaite Kathryn S. and Gibbs Mark J., 2000. Sugarcane yellow leaf virus: a novel member of the Luteoviridae
that probably arose by inter-species recombination. Journal of General Virology (2000), 81, p1865–1869. Printed in Great Britain.
37. Vega J., Scagliusi S. M. M., Ulian E. C, 1997. Sugarcane yellow leaf disease in Brazil: evidence of the association with a luteovirus. Plant Disease Vol 81No. 1
p21 - 26.
38. Viswanathan R and Balamuralikrishnan M, 2004. Detection of sugarcane yellow leaf virus, the causal agent of yellow leaf syndrome in sugarcane by DAS-ELISA.
Archives of Phytopathology and Plant Protection. Volume 37, Number 3 / August 2004, p169 – 176. Publisher: Taylor & Francis. [Abstract].
39. Wang M-L., Schenck S. and Albert H., 2006. Antibody to a short peptide sequence detected Sugarcane yellow leaf virus isolates from several sources. VIIIth
ISSCT Pathology Workshop Petit-Bourg, Guadeloupe (FWI) 23 - 27 January 2006
Programme and Abstracts.
40. Wang M-L., Ancheta S., Clayton J., Goldstein C. and Albert H., 2003. Production of a biologically active pharmaceutical protein in sugarcane and rice. Hawaii Agriculture Research center Annual report 2003. p.12.
41. Zhu Y. J., Osterman G., Moritomo C., McCafferty H., Agabayani R., Lehrer A., Schenck S. and Moore P., 2003. Developing Transgenic Sugarcane for ScYLV Resistance. Hawaii Agriculture Research center Annual report 2003. p. 9.
ĐỊA CHỈ TRÊN WEB 42. www.ento.csiro.au 43. www.ento.okstate.edu 44. www.ipgri.cgiar.org/Publications/pdf/818.pdf 45. www.ipgri.cgiar.org/Publications/pdf/336.pdf 46. http://www.assct.org/journal/JASSCT%20PDF%20Files/vol24/ASSCT%20abstr %20June%2003.pdf 47. http://edis.ifas.ufl.edu/pdffiles/sc/sc07400.pdf 48. http://www.iita.org/info/virology/pdf_files/492-497.pdf 49. http://www.molecular-beacons.org 50. http://www.cosmobio.co.jp/export_e/products/products_top.asp 51. http//:ipm_ncsu_edu-AG295-pics-corn_leaf_aphid_gif.htm
1
PHỤ LỤC
Phụ lục 1 : Danh sách các giống điều tra
Kí hiệu Giống Triệu chứng (YLS) RT- PCR Sự phát huỳnh quang Nguồn gốc Tuổi
TL1 KU00-15-8 - -- - Thái Lan Đầu vƣơn lĩng
TL2 KU00-1-92 + -- - Thái Lan Đầu vƣơn lĩng
TL3 K92-51-56 - -- - Thái Lan Đầu vƣơn lĩng
TL4 K95-1-61 + -- + Thái Lan Đầu vƣơn lĩng
TL5
Uthong94-
2483 - -- - Thái Lan Đầu vƣơn lĩng
TL6 K95-1-56 + -- + Thái Lan Đầu vƣơn lĩng
TL7 KU98-009 - -- - Thái Lan Đầu vƣơn lĩng
TL8 K90-50 + -- + Thái Lan Đầu vƣơn lĩng
TL9 Uthong483 - -- - Thái Lan Đầu vƣơn lĩng
TL10 Uthong60-1 - -- - Thái Lan Đầu vƣơn lĩng
TL11 Uthong2 + -- + Thái Lan Đầu vƣơn lĩng
TL12 KU60-2 + -- + Thái Lan Đầu vƣơn lĩng
TL13 K95-84 - -- - Thái Lan Đầu vƣơn lĩng
TL14 KU00-1-61 - -- - Thái Lan Đầu vƣơn lĩng
TL15 K93-236 - -- - Thái Lan Đầu vƣơn lĩng
TL16 Uthong3 - -- - Thái Lan Đầu vƣơn lĩng
TL17 K84-92 - -- - Thái Lan Đầu vƣơn lĩng
TL18 LK11 - -- - Thái Lan Đầu vƣơn lĩng
TL19 KU207 - -- - Thái Lan Đầu vƣơn lĩng
TL20 K9087 - -- - Thái Lan Đầu vƣơn lĩng
TL21 K93-219 - -- - Thái Lan Đầu vƣơn lĩng
TL22 K95-32 - -- - Thái Lan Đầu vƣơn lĩng
TL23 K88-200 - -- - Thái Lan Đầu vƣơn lĩng
TL24 K9045 - -- - Thái Lan Đầu vƣơn lĩng
TL25 K95238 - -- - Thái Lan Đầu vƣơn lĩng
TL26 KU603 + -- + Thái Lan Đầu vƣơn lĩng
TL27 Uthong95156 - -- - Thái Lan Đầu vƣơn lĩng
TL28 K8865 - -- - Thái Lan Đầu vƣơn lĩng
VSX1 K84-200 + -- + Thái Lan Đầu vƣơn lĩng
VSX2 Co62170 + -- + Ấn Độ Đầu vƣơn lĩng
VSX3 ROC26 - - - Ấn Độ Đầu vƣơn lĩng
VSX4 DLM24 + + + gốc Mỹ Đầu vƣơn lĩng
VSX5 VN844137 - -- - Việt Nam Đầu vƣơn lĩng
2
VSX7 VN84422 + -- + Việt Nam Đầu vƣơn lĩng
VSX8 K84-200 + + + Thái Lan Đầu vƣơn lĩng
VSX9 RB72454 - - - Braxin Đầu vƣơn lĩng
VSX10 K8865 + -- + Thái Lan Đầu vƣơn lĩng
VSX11 My55-14 - -- - Cuba Đầu vƣơn lĩng
VSX12 K8865 + -- + Thái Lan Đầu vƣơn lĩng
G1 C876 - -- - Cuba Đẻ nhánh G2 C2217 - - - Cuba Đẻ nhánh G3 C8651 - -- - Cuba Đẻ nhánh G4 C8756 - -- - Cuba Đẻ nhánh G5 C14148 - -- - Cuba Đẻ nhánh G6 C14262 - -- - Cuba Đẻ nhánh G7 C17272 - -- - Cuba Đẻ nhánh G8 C18768 - -- - Cuba Đẻ nhánh G9 C20859 - -- - Cuba Đẻ nhánh G10 C23651 - -- - Cuba Đẻ nhánh G11 C28863 - -- - Cuba Đẻ nhánh G12 C29073 - -- - Cuba Đẻ nhánh G13 C32368 + -- - Cuba Đẻ nhánh G14 C33464 - -- - Cuba Đẻ nhánh G15 C37472 + -- - Cuba Đẻ nhánh G16 C69347 + -- + Cuba Đẻ nhánh G17 C81967 - -- - Cuba Đẻ nhánh G18 C6675 - -- - Cuba Đẻ nhánh G19 C306275 - -- - Cuba Đẻ nhánh G20 My645 + -- - Cuba Đẻ nhánh G21 My5369 - -- - Cuba Đẻ nhánh G22 MY5464 + -- - Cuba Đẻ nhánh G23 MY5465 + -- - Cuba Đẻ nhánh G24 My5715 - -- - Cuba Đẻ nhánh G25 My53174 - -- - Cuba Đẻ nhánh G26 My54129 - -- - Cuba Đẻ nhánh