Nghiên cứu kỹ thuật phát sinh phôi sona và tạo hạt nhân tạo ở cây lan Hồ Điệp

Nghiên cứu kỹ thuật phát sinh phôi sona và tạo hạt nhân tạo ở cây lan Hồ Điệp

1 Phần 1 Mở đầu

1.1 Đặt vấn đề

Từ lâu hoa Lan đã được tôn vinh là “Mỹ Nữ Sơn Lâm” của các loài hoa, đây không chỉ là một loại hoa vương giả có vẻ đẹp lộng lẫy, mê hồn mà còn tượng trưng cho bản tính hướng thiện của con người

Trong dân gian, đã lưu truyền nhiều câu chuyện có liên quan đến loài hoa này Người đầu tiên ca ngợi hoa Lan là đức Khổng Phu Tử (Trung Quốc - 551 B.C), ví hoa Lan là loài hoa quân tử Và trước đó nữa, vua Thần Nông (Trung Quốc - 2800 B.C) đã dùng hoa Lan trị bệnh như là một liều thuốc tiên, nên từ đó dân gian đã âm thầm gọi hoa Lan là vua của các loài hoa Tương truyền nước ta cũng có kể rằng: khi vua Trần Nhân Tông rời kinh thành về Yên Tử, Quảng Ninh trong đêm ngủ mộng Ngài thấy có người đến yết kiến và dâng tặng một giò hoa rất đẹp Sáng ra, nghi nghi hoặc hoặc hoặc nhà vua đi sâu vào trong núi thì bắt gặp tại một khe sâu có một loài hoa lạ, đẹp và vô cùng thuần khiết Đời sau người ta gọi loài hoa này là lan Trần mộng (giấc mộng của vua Trần) để chỉ điển tích rũ sạch bụi trần bước vào cõi thiền thuần khiết của Ngài

Do đó, thú chơi Lan mang một ý nghĩa rất đặc biệt, bởi khi chăm Lan người ta không chỉ chăm chút cái đẹp cho hoa mà còn đang dưỡng một cái Tâm trong sáng cho mình

Ngày nay, chúng ta có thể thấy hoa lan ở khắp mọi nơi và dễ bị choáng ngợp trước vẻ đẹp quyến rũ, biến hóa muôn màu muôn vẻ của các loài lan như Cattleya, Hồ Điệp , Dendrobium, Mokara, Vanda, Cymbidium, Oncidium Hoa lan được ưa chuộng phải chăng bởi đó là biểu tượng của niềm khát khao cuộc sống phong lưu và hạnh phúc bền bỉ

Hoa lan là một món quà của tạo hóa, nó không chỉ là một loài hoa đẹp có giá trị về mặt tinh thần mà còn có giá trị kinh tế cao và hiện đang có thị trường tiêu thụ mạnh trong nước cũng như xuất khẩu

Tại khu vực Đông Nam Á ngành hoa lan phát triển rất mạnh, Thái Lan là nước xuất khẩu lan nhiều nhất thế giới (có đến 1.000 giống hoa lan), tại Malaysia thì chính

phủ đã qui hoạch hẳn 300 ha đất ở Johor và giao cho Hiệp hội hoa lan tổ chức thành khu “Trung Tâm Sản Xuất Hoa Cảnh Xuất Khẩu”, ngành trồng hoa lan ở Đài Loan cũng đang tăng nhanh tốc độ từ 15-20%, đạt doanh thu hằng năm hơn 9,3 tỷ đài tệ

Ở Việt Nam, nghề trồng Lan phát triển chậm hơn các nước rất nhiều Việc trồng lan trên địa bàn TP.HCM lâu nay chủ yếu là do tự phát nên diện tích trồng còn nhỏ và trình độ tay nghề nông dân chưa đồng đều, ngoài ra người trồng lan vẫn chưa chủ động được nguồn giống, vì vậy việc trồng lan rất khó khăn, đặc biệt là trồng lan Hồ Điệp Loại lan này trồng rất khó và phải đầu tư lớn, từ việc cung cấp dưỡng chất và giữ ẩm cho cây đến thiết bị nhà ươm, chăm sóc… đều phải nhập ngoại và chịu thuế khá cao Đặc biệt, sau 2 năm trở đi cây mới cho thu hoạch thì có thể lúc đó thị trường đã bão hòa, lợi nhuận thu được không tương xứng với vốn và công sức bỏ ra

Theo tình hình đó đã có nhiều công trình nghiên cứu nuôi cấy in vitro lan Hồ

Điệp nhằm tạo ra nguồn hoa mới ổn định Từ nuôi cấy mô, nguồn gene từ các dòng lan sưu tập sẽ được lưu giữ lại để nâng cao chất lượng giống, đồng thời tổ chức nhân nhanh để cung cấp cho nhu cầu thị trường trong và ngoài nước Tuy đã có một số thành tựu đáng kể nhưng thực tế vẫn còn nhiều hạn chế như chất lượng giống không đồng đều và không thể thực hiện trên quy mô lớn

Dựa vào thực tế đã nêu trên, với đề tài “Nghiên cứu kỹ thuật phát sinh phôi

soma và tạo hạt nhân tạo ở cây lan Hồ Điệp (Phalaenopsis sp )”, chúng tôi mong

muốn góp một phần vào nền công nghiệp sản xuất hoa lan Hồ Điệp Trong đề tài này,

lan Hồ Điệp được sản xuất bằng phương pháp nhân giống in vitro tốc độ cao tạo cây

giống có đặc điểm về kiểu gen và kiểu hình đồng nhất với nguồn mẫu ban đầu Từ đó, có thể cho ra đời nhiều giống cây hoa lan Hồ Điệp mới có chất lượng tốt để ngày càng đáp ứng được nhu cầu của những người yêu hoa Lan

Hiện nay trên thế giới, các công trình nghiên cứu về phôi soma đã đạt được những thành công nhất định trên thực vật hai lá mầm, trong khi ở những cây một lá mầm vẫn còn gặp nhiều khó khăn Vì những ứng dụng tốt đẹp mà phôi soma có thể mang lại, trong đề tài này chúng tôi thử nghiệm một phương pháp tạo phôi soma trên cây hoa lan Hồ Điệp sao cho việc tạo phôi soma trở nên thật đơn giản và hiệu quả

Từ kết quả thu nhận được trong việc tạo phôi soma cây lan Hồ Điệp, chúng tôi đi xa hơn nữa, bằng cách sử dụng các phôi soma ấy để tạo hạt nhân tạo Công nghệ hạt

nhân tạo là phương pháp tạo một dạng hạt mô phỏng hạt tự nhiên, có một phôi sinh dưỡng hoặc "chồi ngủ" được bọc trong một lớp dung dịch alginate (một chất có tác dụng tạo lớp vỏ cứng bên ngoài cho mầm hạt) có chứa chất dinh dưỡng, phôi này sau đó nảy mầm thành cây con hoàn chỉnh Đây là một vấn đề đang được các nhà khoa học trên thế giới quan tâm trong ứng dụng bảo quản phôi vô tính, chất mầm thực vật dài hạn Đồng thời mở ra một hướng mới cho việc sử dụng những hạt vô tính thay cho các hạt hữu tính có khả năng nẩy mầm thấp và không đồng loạt

Khi thực hiện đề tài này, chúng tôi hy vọng sẽ mang đến những hiểu biết mới về quá trình hình thành phôi vô tính trên cây lan Hồ Điệp nói riêng và hoa lan nói chung, đồng thời đem lại những ứng dụng thiết thực cho ngành nuôi cấy mô thực vật tại Việt Nam

- Làm cơ sở cho việc kiểm chứng sự khác nhau giữa cây hoa lan Hồ Điệp in

vitro có nguồn gốc từ phôi soma với cây hoa lan Hồ Điệp từ các nguồn mô khác

- Làm cơ sở để nghiên cứu tiếp khả năng tạo mô sẹo và phát sinh phôi soma của các loại cây thân thảo một lá mầm khác

1.2.2 Yêu cầu

- Tạo được cây hoa lan Hồ Điệp có đặc điểm về kiểu gen và kiểu hình đồng nhất với nguồn mẫu ban đầu Từ đó, có thể tạo ra số lượng lớn cây con có chất lượng tốt, đồng thời làm giảm giá thành cây con

- Hình thành quy trình nhân giống vô tính in vitro và tạo hạt nhân tạo cây hoa

lan Hồ Điệp, để góp phần nghiên cứu giải quyết nhu cầu giống phục vụ cho việc tiêu thụ hoa trong nước và xuất khẩu

Phần 2 Tổng quan tài liệu

2.1 Giới thiệu về cây lan Hồ Điệp

Cây lan Hồ Điệp (Phalaenopsis sp.) là loại cây đơn trục sống biểu sinh, thuộc :

Ngành : Hạt kín (Angiospermae)

Lớp : Một lá mầm (Monocotyledoneae) Bộ : Lan (Orchidales)

Họ : Phong lan (Orchidaceae)

Cây phong lan Hồ Điệp (Phalaenopsis sp.) sinh trưởng và phát triển tốt trong

điều kiện khí hậu Việt Nam Hồ Điệp có hoa đẹp, đa dạng, màu sắc phong phú lại lâu tàn, trung bình trên mỗi phát hoa có từ 7 – 15 hoa, thời gian hoa tươi trên cây kéo dài từ 3 – 4 tháng Đó là tính chất hơn hẳn của phong lan Hồ Điệp so với các loại phong lan khác, giúp cho lan Hồ Điệp có giá trị kinh tế cao ở trong nước cũng như ở nước ngoài

Khả năng tự sinh cây lan con trong thiên nhiên rất thấp Thông thường để tạo số lượng lớn cây con của giống lan này, người ta dùng phương pháp gieo hạt trong nuôi

cấy in vitro Tuy nhiên những cây con mọc từ hạt thường tăng trưởng không đồng đều,

lâu trổ hoa, các đặc điểm của hoa không thuần nhất Nhân giống bằng con đường tạo mô sẹo và phát sinh phôi soma có thể khắc phục các nhược điểm trên

2.1.1 Nguồn gốc và sự phân bố

Cây phong lan Hồ Điệp có nguồn gốc ở Tây Nam Châu Á, trải rộng trên những vùng núi cao ở Trung Quốc và Tây Tạng đến Châu Úc, trên vùng kinh tuyến bao gồm giữa Ấn Độ Dương và Thái Bình Dương Người ta còn gặp giống này ở Sumatra, Bornéo, Célèbes, Nouvelle Calédonie (Marry Noble, 1971)

Đây là những cây sống biểu sinh, trên những cây cao trong rừng dầy có ẩm độ cao hoặc rất gần đất, trên những cây nhỡ (arbuter), hay sống bám trên những hốc đá, hay trên những đám rêu dày, một vài loài sống ở vùng ven biển Lan Hồ Điệp ít thích hợp với nắng hơn so với những loại phong lan có giả hành Nhiệt độ thích hợp cho sự

tăng trưởng và phát triển là 15oC – 38oC và giống này thường sống ở cao độ 400m (William và Kramer, 1983)

200m-Tên Phalaenopsis có nguồn gốc từ Phalaina (phalène) và d’Opsis (apparence),

được Blume (nhà thực vật học người Hà Lan) đặt vào năm 1852 khi ông khám phá một loài

lan đặc biệt có hoa giống cánh bướm, đó là Phalaenopsis amabilis

Đa số các tác giả đều đồng ý xếp chi Hồ Điệp có một nhụy, kiểu phát hoa bên và có cấu tạo đơn trục Trong chi này có khoảng 70 loài, được phân bố trong những vùng và khu vực khác nhau Các loài này thường xuyên lai chéo với nhau, do đó phả hệ của những cây nhận được cũng rất phức tạp Thế hệ con cháu của chúng cũng không thuần nhất Tuy nhiên sự lai tạo đưa đến một lợi ích lớn để cung cấp những cá thể luôn đổi mới và những đặc tính quyến rũ của hoa (Perlz, 1974)

2.1.2 Vị trí lan Hồ Điệp trên thị trường

So với đa số các loại lan trên thị trường hiện nay, thì lan Hồ Điệp nổi bật hơn, bởi các đặc tính của hoa đa dạng, màu sắc phong phú, hoa lâu tàn, trung bình hoa tươi trên cành có thể kéo dài từ 3-4 tháng (Broly, 1982) Trục phát hoa dài, đường kính to, mang nhiều hoa to, trung bình 7-15 hoa, do đó rất thuận lợi cho việc trang trí, và có thể cắt cành xuất khẩu, chuyên chở xa mà không ảnh hưởng đến chất lượng hoa Hồ Điệp có giá trị kinh tế cao hơn một số giống lan khác Nếu biết dùng biện pháp kỹ thuật để thúc đẩy việc ra hoa sớm thì sẽ có lợi nhiều trong việc kinh doanh

Hình 2.1 Một số loại lan Hồ Điệp phổ biến

2.2 Nuôi cấy mô tế bào thực vật

2.2.1 Khái niệm

Nuôi cấy mô tế bào thực vật hay còn gọi là nuôi cấy in vitro là công cụ cần thiết

trong nhiều lĩnh vực nghiên cứu cơ bản và ứng dụng của ngành công nghệ sinh học Nhờ áp dụng kĩ thuật nuôi cấy mô, con người đã thúc đẩy thực vật sinh sản nhanh hơn gấp nhiều lần so với tự nhiên Do đó tạo ra hàng loạt cá thể mới giữ nguyên tính trạng di truyền của cơ thể mẹ, làm rút ngắn thời gian đưa giống mới vào sản xuất Hơn nữa dựa vào kĩ thuật nuôi cấy mô có thể duy trì và bảo quản nhiều giống cây trồng quí hiếm để phục tráng giống cây trồng

Phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật bắt đầu từ một mảnh nhỏ thực vật vô trùng được đặt trong môi trường dinh dưỡng thích hợp Chồi mới hay mô sẹo mà mẫu cấy này sinh ra bằng sự tăng sinh được phân chia và cấy chuyền để nhân giống

2.2.2 Lịch sử phát triển

Năm 1838, hai nhà sinh vật học Đức là Schleiden và Schwann đề xướng học thuyết tế bào và nêu rõ: Mọi sinh vật phức tạp đều gồm nhiều sinh vật nhỏ, các tế bào hợp thành, các tế bào phân chia mang thông tin di truyền chứa trong tế bào đầu tiên, đó là trứng sau khi thụ tinh và là những đơn vị độc lập từ đó có thể xây dựng lại toàn bộ cơ thể

Năm 1902, Haberlandt đề xướng phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật để chứng minh tính toàn năng của tế bào, nghĩa là mỗi tế bào đều mang đầy đủ thông tin di truyền của cá thể Ông tiến hành trên cây họ hòa thỏa (cây một lá mầm) một lọai cây khó thực hiện và ông bị thất bại

Năm 1922, Kote (học trò Haberlandt) và Robbins (nhà khoa học người Mỹ) đã lặp lại thí nghiệm của Haberlandt và nuôi cấy được đỉnh sinh trưởng tách ra từ đầu rễ của một loại cây thuộc họ hòa thảo tạo ra hệ rễ nhỏ và có cả rễ phụ Tuy nhiên sự sinh trưởng như vậy chỉ tồn tại trong một thời gian sau đó chậm lại và ngừng hẳn mặc dù tác giả đã chuyển sang môi trường mới

Năm 1934, White đã nuôi cấy thành công đầu rễ cây cà chua (Lycopersicum

esculentum)

Năm 1937, Gautheret và Nobecout đã tạo ra và duy trì được sự sinh trưởng mô sẹo cây cà rốt trong một thời gian dài trong môi trường thạch cứng

Năm 1941, Overbeck đã chứng minh được vai trò của chất kích thích sinh trưởng trong nuôi cấy phôi họ cà Trong thời gian này chất hích thích sinh trưởng nhân tạo thuộc nhóm auxin đã được nghiên cứu và tổng hợp hóa học thành công Và năm 1948 Steward đã xác định được tác dụng của nước dừa trong nuôi cấy mô sẹo cây cà rốt

Năm 1955, người ta tìm ra tác dụng kích thích phân bào của kinetin.Sau đó các chất cytokinine khác như BAP, 2 IP, Zeatin cũng được phát hiện

Năm 1957, SKoog và Miller công bố kết quả nghiên cứu về ty lệ giữa kinetin/auxin đối với sự hình thành các cơ quan từ mô sẹo trên cây thuốc lá

Từ năm 1954, đến năm1959 kỹ thuật tách và nuôi cấy tế bào đơnđã được phát triển, các tác giả đã gieo tế bào đơn và nuôi cấy tạo được cây hoàn chỉnh

Năm 1966, Guha và Mahheswari nuôi cấy thành công tế bào đơn bội từ nuôi cấy túi phấn cây cà độc dược

Năm1967, Bougin và Nistsh tạo thành công cây đơn bội từ túi phấn cây thuốc lá

2.2.3 Ứng dụng

Năm 1986, một số lượng lớn cây trồng sản xuất bằng phương pháp nuôi cấy mô đã được tiêu thụ tên thị trường thương mại với hàng chục triệu dollar Kỹ thuật này thể hiện một số ưu điểm đã được ứng dụng:

- Nhân giống vô tính với tốc độ nhanh - Tạo cây sạch bệnh và kháng bệnh - Cảm ứng và tuyển lựa dòng đột biến

- Sản xuất cây đơn bội qua nuôi cấy túi phấn - Lai xa

- Lai tế bào soma và tạo dòng protoplast

- Gây biến tính thực vật qua hấp thụ DNA và ngoại lai - Cố định nitrogen

- Cải thiện hiệu quả của quang tổng hợp - Bảo quản nguồn gen quý

2.2.4 Các phương pháp nuôi cấy in vitro

 Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng

Mẫu cấy bao gồm: đỉnh sinh dưỡng, chồi đỉnh, chồi bên, có kích thước khoảng 0.58 - 1 cm Đây là phương pháp dễ dàng nhất, mẫu sau khi vô trùng và được nuôi cấy trong môi trường thích hợp cho loại cây đó thì sau một thời gian nuôi cấy tạo thành một hay nhiều chồi Sau đó, nuôi cấy trong môi trường có bổ sung chất kích thích sinh trưởng thì sẽ tạo thành nhiều chồi, rễ, tạo thành cây hoàn chỉnh

 Nuôi cấy mô sẹo

Mẫu cấy là những tế bào đỉnh sinh trưởng hay nhu mô được tách ra trong môi trường giàu auxin thì mô sẹo được hình thành Mô sẹo là những tế bào vô tổ chức có màu trắng Khối mô sẹo này có khả năng tái sinh thành cây hoàn chỉnh trong môi trường không có chất kích thích sinh trưởng tạo mô sẹo Nuôi cấy mô sẹo được thực hiện đối với những cây không có khả năng nuôi cấy từ đỉnh sinh trưởng cây tái sinh từ mô sẹo có nhiều chồi hơn so với cây tái sinh từ đỉnh sinh trưởng, tuy nhiên mức độ biến dị tế bào soma của phương pháp này rất cao

 Phương pháp nuôi cấy tế bào đơn

Những khối sẹo được nuôi cấy trong môi trường lỏng, đặt trong máy lắc thì khối sẹo dứơi tác dụng cơ học và hóa học sẽ tách ra nhiều tế bào đơn lẻ gọi là tế bào đơn Những tế bào đơn này nuôi cấy trong môi trường đặc biệt thì sẽ tăng sinh khối Sau một thời gian nuôi cấy trong môi trường lỏng tế bào đơn tách ra và đặt trải trong môi trường thạch thì sẽ phát sinh thành những tế bào mô sẹo Những tế bào mô sẹo này được nuôi cấy trong môi trường cytokinin/auxin thích hợp thì sẽ tái sinh thành cây hoàn chỉnh Trong chọn giống cây trồng người ta dựa vào phương pháp này để tạo ra giống mới bằng cách đột biến tế bào đơn bằng hóa chất hay phóng xạ

 Nuôi cấy protoplast- chuyển gen

Protoplast (tế bào trần ), thực chất là tế bào đơn được tách vỏ cellulose, có sức sống và duy trì chức năng sẵn có Protoplast có thể tái sinh trực tiếp từ thân, lá, rễ bằng cơ học, hoặc từ những tế bào đơn sẵn có Trong môi trường thích hợp các protoplast

có khả năng tái sinh màng tế bào, tiếp tục phân chia và tái sinh thành cây hoàn chỉnh Trong chọn giống cây trồng người ta sử dụng phương pháp này để cải tiến giống cây trồng bằng cách cho dung hợp protoplast ở 2 protoplast cùng loài hoặc khác loài

Protoplast có khả năng hấp thu tế bào ngoại lai để cải thiện đặc tính của một số loại cây trồng mà không thông qua các phương pháp chuyển gen khác

 Nuôi cấy tế bào đơn bội

Hạt phấn của cây trồng được nuôi cấy trong môi trường thích hợp tạo thành mô sẹo, những mô sẹo này có khả năng tái sinh thành cây hoàn chỉnh có bộ nhiễm sắc thể n gọi là cây đơn bội Trong nuôi cấy mô thực vật người ta sử dụng những mô sẹo này xử lý colchicin để tạo thành cây đa bội

2.3 Các yếu tố ảnh hưởng trong nuôi cấy in vitro

2.3.1 Chất điều hoà sinh trưởng

Chất sinh trưởng thực vật hay còn gọi là chất điều hòa sinh trưởng thực vật là các hợp chất hữu cơ (bao gồm các sản phẩm thiên nhiên của thực vật và các hợp chất tổng hợp nhân tạo) có tác dụng điều tiết các quá trình sinh trưởng và phát triển, làm biến đổi một quá trình sinh lý thực vật nào đó, ở những nồng độ rất thấp Chúng không phải là các chất dinh dưỡng hay các sinh tố dùng trong thực vật

Một số chất điều hoà sinh trưởng thường dùng:

(1) Auxin

Auxin là một nhóm các chất được tổng hợp chủ yếu ở đầu thân, đầu rễ, được vận chuyển đến các bộ phận khác nhau của cơ thể để kích thích sự tăng trưởng của tế bào

Các phản ứng auxin và sự tăng trưởng có liên quan với vô số quá trình sinh lý và trao đổi chất khác và mối quan hệ nhân quả giữa auxin, ARN và chuyển hóa protein không phải hoàn toàn rõ ràng Phản ứng chủ yếu và nhanh chóng nhất đối với việc xử lý auxin là làm tăng độ kéo dài của tế bào, điều này xảy ra chỉ một vài phút sau khi xử lý Một đặc trưng quan trọng là vách tế bào, là một vị trí quan trọng chịu sự tác động của các chất điều hòa sinh trưởng thực vật (Torry và csv, 1981) Auxin làm giảm pH do kích thích sự bài xuất proton H+, pH hoạt hóa các enzym tác động nới lỏng vách tế bào và enzym tổng hợp vách tế bào, nhờ đó khởi động quá trình giản nở tế bào (Roger Prat, 1993)

Auxin hoạt hóa sự sinh tổng hợp các hợp chất cao phân tử (protein, xenluloza, pectin, …) và ngăn cản sự phân giải chúng (Grodzinxki, 1981)

(2) Cytokinin

Đây là chất hoạt hóa sự phân chia tế bào (Mitsuhashi và csv, 1969; Mai Trần Ngọc Tiếng, 1989), đồng thời làm tăng quá trình chuyển hóa acid nucleic và protein (Vũ Văn Vụ và csv, 1993) Cytokinin được sử dụng khá nhiều trong kỹ thuật nuôi cấy mô, những chất thường được dùng là Kinetin và BA (Benzyl Adenin)

Cytokinin phá vỡ trạng thái ngủ của hạt, kích thích hạt nẩy mầm, làm tăng sự nở hoa Cytokinin gây nên sự hình thành chồi mầm trong nhiều mô bao gồm mô sẹo sinh trưởng (cals) trong mô nuôi cấy, hay việc tạo thành các mô bứu ở các cây gỗ lâu năm (Nester và csv, 1985; Taiz L và csv, 1991)

Cytokinin kích thích sự tổng hợp mới enzym Rubisco (Ribulozo-1,5-biphotphat cacboxylaza/oxygenaza) hoặc ở mức sao chép (làm tăng hoạt tính ARN-polymeraza) hoặc ở mức dịch mã (thành lập các polyriboxom) (Parthier, 1985) Ảnh hưởng của Cytokinin thấy rõ khi phối hợp sử dụng với auxin (Meredith và csv, 1970) Skoog và csv (1948) ghi nhận lượng benzyl amino purine cao có tác dụng kích thích sự tạo chồi, đồng thời ức chế sự phân hóa tạo rễ

 Thidiazuron [1-phenyl-3-(1,2,3-thidiazol-5-yl)urea] [TDZ]

Thidiazuron [1-phenyl-3-(1,2,3-thidiazol-5-yl)urea] là một hóa chất tổng hợp dạng tinh thể thường tan trong ethanol và ít tan trong nước Vào những năm 1970, TDZ được sử dụng như một thương phẩm làm rụng lá phục vụ cho quá trình thu hoạch bông vải Đến gần đây, nó được sử dụng rộng rãi trong nuôi cấy mô do có hoạt tính cytokinin và auxin mạnh hơn hẳn các cytokinin và auxin cơ bản thông dụng khác

Về cấu trúc, phân tử TDZ khác hẳn các auxin và các cytokinin dạng adenin với hai nhóm chức năng khác nhau: phenyl và thidiazol TDZ sẽ bị giảm hoạt tính khi bị thay thế bất kỳ một trong hai nhóm này bằng các vòng thơm khác (Murthy và csv, 1998)

Đối với cây in vitro, TDZ được thấy là có khả năng thay thế cả cytokinin và

auxin hoặc kết hợp các chất điều hòa sinh trưởng thực vật khác nhau để kích hoạt các quá trình phát sinh hình thái trong nuôi cấy mô

- Tạo mô sẹo: thông thường auxin được dùng để cảm ứng sự phân chia tế bào và tăng trưởng mô sẹo TDZ cũng có khả năng cảm ứng tạo mô sẹo ở nhiều hệ thống nuôi cấy khác nhau với tốc độ tăng sinh tế bào cao hơn nhiều các chất điều hòa sinh trưởng thực vật khác, có khi lên đến 30 lần Tuy nhiên mô sẹo thường hấp thu TDZ ít hơn các chất điều hòa sinh trưởng thực vật khác, có lẽ do hoạt tính của TDZ khá cao Không có nhiều tài liệu nói về dạng mô sẹo tạo bởi TDZ, ngoài một số tài liệu cho rằng TDZ có khuynh hướng tạo mô sẹo xanh với những tế bào kích thước nhỏ, xếp chặt chẽ

- Tạo chồi: có khá nhiều loại cây được tạo chồi bằng TDZ, đặc biệt hiệu quả trên nhiều giống cây thân gỗ, ví dụ như Bạch đàn (Chen và csv, 1995) TDZ kích thích

tạo chồi trực tiếp khi nuôi cấy tế bào lớp mỏng, ví dụ trên cây đậu Phaseolus vulgaris

L (Bui và csv, 2000) TDZ thúc đẩy sự biệt hóa các trung tâm tăng trưởng, làm giảm

sự ngủ của các đỉnh sinh trưởng ngọn, dẫn đến sự hình thành chồi bên và chồi bất định trực tiếp từ mô cấy

- TDZ được sử dụng trong quá trình tạo chồi (đặc biệt ở cây thân gỗ) với nồng độ rất cao Điển hình như báo cáo tạo phôi trên cây măng cụt bằng nồng độ TDZ lên đến 2,25mM (Te-Chato và Lim, 1999)

- Sinh phôi: Người ta thấy rằng TDZ, có thể thay thế cho auxin hoặc tổ hợp auxin và cytokinin trong sự hình thành phôi ở nhiều loài cây khác nhau như thuốc lá (Gill và Saxena, 1993), đậu xanh (Murthy và csv, 1995), cây phong lữ (Visser và csv, 1992), neem (Murthy và Saxena, 1998), cacao (Li và csv, 1998), … thường là với tỷ lệ sinh phôi cao hơn so với các tổ hợp chất điều hòa sinh trưởng thực vật khác Do tính chất này của TDZ, nên ngoài hoạt tính của cytokinin đã được đề cập nhiều, người ta cho rằng, TDZ có ảnh hưởng đến quá trình biến dưỡng auxin Victor và csv (1999) đã cũng cố cho giả thiết này bằng một khảo sát so sánh hoạt tính phát sinh hình thái của BAP và TDZ trên cây đậu phộng, ghi nhận sự khác biệt trong hoạt tính là TDZ có khả năng sinh phôi vô tính, trong BAP không có khả năng này

- Nuôi cấy protoplast: TDZ kết hợp với auxin (NAA; 2,4-D; NOA) được sử dụng trong giai đoạn hình thành vách tế bào xung quanh protoplast, khởi đầu cho sự phân chia tế bào (Chupeau và csv, 1993; Reustle và csv, 1995) và trong giai đoạn tiếp theo tái sinh từ mô sẹo có nguồn gốc protoplast (Lenzner và csv, 1995) Nhiều báo cáo khác nhau cho thấy, TDZ ở nồng độ thấp có hiệu quả cao hơn hẳn so với các cytokinin khác

- Tạo chồi ngoài vườn ươm : Ngoài các tác dụng sinh chồi in vitro, TDZ còn

có tác dụng kích thích tạo chồi trên cây khi được phun hoặc xử lý vào đất trong vườn ươm, chủ yếu là tạo chồi bất định từ rễ hoặc phần dưới thấp của cây

Đi cùng với những ưu điểm trên, nhược điểm của TDZ cũng được ghi nhận, bao gồm : thủy tinh hóa chồi tái sinh (Debergh và csv, 1992; Briggs và csv, 1988; Causineu và Donnelly, 1991); biến dị hình dạng lá (van Niewkerk và csv, 1986; Cambecedes và csv, 1991); chồi chặt và ngắn (Fasolo và csv, 1989; Meyer và van Staden, 1988); sự khó khăn trong việc kéo dài và ra rễ chồi tái sinh

2.3.2 Ảnh hưởng của nguồn carbon

Trong môi trường nuôi cấy, các mô không có khả năng tự dưỡng do không quang hợp đầy đủ trong điều kiện thiếu sự trao đổi khí với bên ngoài, do vậy cần cung cấp đường để giúp mô, tế bào thực vật tổng hợp các chất hữu cơ, giúp tế bào phân chia, tăng sinh khối Các loại đường thường được sử dụng là sucrose, d-glucose, d-fructose (Doods và Roberts, 1987) Sucrose là nguồn carbon được sử rụng rộng rãi nhất cho các loại cây, nồng độ sucrose thay đổi từ 2%-12% hoặc cao hơn tùy thuộc vào giống và tuổi phôi cấy

2.3.3 Ảnh hưởng của nước dừa

Nước dừa (CW-coconut water) thêm vào môi trường với lượng thích hợp sẽ kích thích sự phát triển của chồi bên cũng như sự hình thành cây con (Urata và Iwanaga, 1965; Scully, 1966; Tanaka và Sakanishi, 1978)

Từ việc sử dụng CW, nhiều mô thực vật được nghiền tách dịch chiết và bổ sung vào môi trường nuôi cấy có tác dụng kích thích sự phát triển phôi như nội nhũ bắp, chà là, chuối, mầm đậu, mầm lúa mì, nước chiết cà chua … nhưng thông thường các dịch chiết chỉ có tác dụng trên các loài cây trồng không cùng nguồn gốc (Trần Văn Minh, 2002)

Hoạt tính của CW khác BAP, tuy nhiên có thể thay thế được BAP Van Overbeek và csv (1941) cho thấy CW kích thích sự phân chia tế bào của mô cây cà

độc dược (Datura solanaceae) trong môi trường nuôi cấy

Theo Vũ Văn Vụ và csv (1993), trong CW khá giàu các hợp chất nitơ dạng khử như các acid amin, ngoài ra trong CW còn chứa các hormon sinh trưởng như cytokinine

Theo sự phân tích thành phần dinh dưỡng của Tổ chức Y tế Thế giới, thì trong CW có chứa protein, cacbohydrat, canxi, sắt và một số vitamin như thiamin, riboflavin, niacin, acid ascorbic và đường

2.3.4 Ảnh hưởng của than hoạt tính

Phải có những thực nghiệm xác định nồng độ than hoạt tính thích hợp cho quá trình nuôi cấy Than hoạt tính thêm vào môi trường kích thích sự phát triển phôi của cây bắp, jujube và đu đủ

2.3.5 Ảnh hưởng của độ pH và Agar

pH của môi trường nuôi cấy thường ở khoảng 6, thấp hơn 4,5 hoặc cao hơn 7 đều ức chế sự phát triển của mô (Nguyễn Văn Uyển, 1993 và Bùi Bá Bổng, 1995)

Các mô thực vật đều được cấy trên môi trường agar Agar thường được sử dụng ở nồng độ 6-10 g/lít, nồng độ agar tốt nhất cho sự phát triển của mô cấy là 8g/lít (Ribeiro và csv, 2000)

2.3.6 Ảnh hưởng của các điều kiện vật lý

Ánh sáng cần thiết cho sự phát sinh hình thái của mô cấy Trong tạo chồi ban đầu và nhân chồi tiếp theo, cường độ ánh sáng chỉ cần trong khoảng 1.000 lux Nhưng trong giai đoạn tạo rễ, cây cần chiếu sáng ở cường độ cao từ 3.000-10.000 lux để kích thích cây chuyển từ giai đoạn dị dưỡng sang tự dưỡng có khả năng quang hợp Dưới cường độ ánh sáng cao, cây lùn và có màu xanh hơi giảm nhưng có tỷ lệ sống sót cao khi chuyển sang môi trường đất Chưa có nhiều nghiên cứu về chế độ sáng trong môi trường cấy mô, nhưng thời gian chiếu sáng 16 giờ/ngày của bóng đèn néon huỳnh quang là thích hợp cho sự phát triển mô cấy của nhiều loài Cấy phôi thường không sử dụng ánh sáng đèn Theo Scozzoli và Pasini, 1992; Pinto và csv, 1994, cấy phôi đào nên để trong tối 14 ngày Tương tự, ở cây bơ nên để 21 ngày trong tối ở nhiệt độ 210C (Lano và csv, 1995)

Ngoài ra, để mô cấy phát triển tốt thì môi trường nuôi cấy phải thông thoáng và có nhiệt độ thích hợp, nhiệt độ trong phòng nuôi cấy thường được giữ ở 25-28oC (Nguyễn Văn Uyển, 1993)

2.3 Nuôi cấy phát sinh mô sẹo

2.4.1 Sự hình thành mô sẹo

Hình 2.2 Mô sẹo lan Hồ Điệp

Mô sẹo là một khối tế bào phát sinh vô tổ chức, có hình dạng không nhất định, do không có lớp nhu mô Mô sẹo được hình thành từ mặt cắt của thân hay rễ, bao gồm tế bào nhu mô và thành phần tế bào rây (Esau, 1977) Mô sẹo hình thành ở hầu hết các bộ phận của cây (thân, lá, rễ), khi nơi đó có vết cắt (Street, 1969) Điều quan trọng được nhận thấy ở đặc tính của mô sẹo là mô sẹo phát triển không theo quy luật nhưng có khả năng biệt hóa thành rễ, chồi hoặc phôi để có thể hình thành cây hoàn chỉnh

Đặc điểm sinh trưởng của mô sẹo có quan hệ với cơ quan hình thành mô sẹo, thành phần môi trường nuôi cấy, và điều kiện nuôi cấy Sự hình thành mô sẹo chia ra 3 giai đoạn : phát sinh mô sẹo, phân chia tế bào và biệt hóa

- Trong pha phát sinh mô sẹo, sự trao đổi chất kích thích tế bào chuẩn bị phân chia, giai đoạn này dài hay ngắn phụ thuộc vào tình trạng sinh lý của mô được đưa vào nuôi cấy và điều kiện nuôi cấy

- Tế bào đi vào giai đoạn phân chia tăng sinh khối

- Tế bào đi vào quá trình biệt hóa, xuất hiện sự biệt hóa tế bào và sự xuất hiện các con đường trao đổi chất dẫn đến sự sản xuất các chất thứ cấp có hoạt tính sinh học (Trần Văn Minh, 2003) Mô sẹo thường có màu vàng trắng, xanh hay màu sắc tố

anthocyanin Sự biệt hóa của tế bào hình thành những chất liệu cấu tạo nhu mô các loại, các tế bào rây… hơn nữa hình thành vùng mô phân sinh, trung tâm của sự tạo nên chồi và rễ

Nhiều nhà khoa học cho rằng, mô sẹo được tạo ra từ những mô hay cơ quan có chứa diệp lục có khả năng quang tự dưỡng (Street, 1969) Hildebrandt và csv (1963) cho rằng, mô sẹo có chứa diệp lục phụ thuộc vào lượng đường bổ sung trong môi trường và cường độ ánh sáng Có nhiều yếu tố ảnh đến khả năng quang tự dưỡng của những tế bào có chứa diệp lục (tế bào có màu xanh) như : cường độ ánh sáng mạnh, ánh sáng màu xang cần thiết cho sự biệt hóa diệp lục và sự hình thành các enzym, đường thấp, auxin thấp, CO2 cao, và tăng hàm lượng phosphate (Barz và Husemann, 1982), và những tế bào quang tự dưỡng này có khả năng cố định 14

CO2 bằng chu trình Calvin mặc dù có sự xuất hiện của các acid hữu cơ 4 carbon (Yamada và csv, 1982) Một vấn đề quan tâm trong nuôi cấy mô sẹo là sự biến tính tế bào Sự biến tính này xảy ra do : độ già của mẫu, sự thay đổi tế bào chất của nhân, tế bào đa bội thể có số lượng DNA cao, thời gian duy trì nuôi cấy mô sẹo, điều kiện nuôi cấy, thành phần môi trường nhất là hormon ( Trần Văn Minh, 2003)

Để tạo mô sẹo trong môi trường nuôi cấy có bổ sung chất sinh trưởng, đôi khi có dịch chiết (Trần Văn Minh, 2003) Phụ thuộc vào từng loại mô nuôi cấy mà chất sinh trưởng thêm vào có khác nhau (Trần Văn Minh, 2003) Chất hormon thường tổ hợp thành 4 nhóm :

(1) Auxin (2) Cytokinin

(3) Auxin + Cytokinin (4) Dịch Chiết

Sau khi mô sẹo hình thành, mô sẹo được cấy chuyền Môi trường cấy chuyền cũng giống như môi trường tạo mô sẹo nhưng chất sinh trưởng được giảm nồng độ Kích thước tách mô sẹo nhỏ vừa phải để tế bào phát triển mạnh nhất, thường cụm mô sẹo có trọng lượng là 20-100mg, thời gian giữa hai lần cấy chuyền là 20-30 ngày phụ thuộc vào từng loại mô sẹo Trong quá trình phát triển mô sẹo thường xuất hiện 2 loại tế bào :

(1) Loại tế bào xốp, có không bào to, nhân nhỏ và tế bào chất loãng

(2) Loại tế bào chặt, có không bào nhỏ, nhân to và tế bào chất đậm đặc

Mô sẹo cấy chuyền càng nhiều lần thì khả năng tái sinh càng giảm Ngoài ra, nếu sau thời gian dài không cấy chuyền thì mô sẹo sẽ hoá nâu và chết

Hình 2.3 Mô sẹo hoá nâu

2.4.2 Sự phát triển của tế bào mô sẹo

Giống thực vật cổ điển được sử dụng trong nghiên cứu phát sinh cơ quan là thuốc lá (Skoog và Miller, 1957) Bước đầu tiên trong nghiên cứu tái sinh là tạo mô sẹo Mô nuôi cấy cho thấy tiêu biểu của sự phân chia tế bào, những chức năng đặc biệt của tế bào, và sự hình thành cơ quan như cấu trúc của hệ thống mạch dẫn Sự hình thành mô sẹo từ mô nuôi cấy cho thấy có sự phân chia tế bào, những tế bào ít có tính chuyên biệt và mất khả năng hình thành cấu trúc cơ quan (Trần Văn Minh, 2003)

Khi cấy chuyền mô sẹo trên môi trường agar, tế bào mô sẹo phát triển theo hình chữ S Có 5 pha trong sự phát triển mô sẹo :

(1) pha Lag : tế bào chuẩn bị phân chia

(2) pha Exponential : tốc độ phân chia tế bào cao nhất

(3) pha Linear : tế bào phân chia chậm lại và phát triển kích thước (4) pha Deceleration : tốc độ phân chia và kéo dài tế bào giảm (5) pha Stationary: số lượng và kích thước tế bào ổn định

Sự phát triển của mô sẹo có thể đo được trọng lượng tươi Đo trọng lượng khô cho thấy chính xác hơn trọng lượng tươi, nhưng đòi hỏi mẫu phải đồng nhất Đo đếm sự phân bào nguyên nhiễm

2.3.6.1 Sự tái sinh chồi từ mô sẹo

Theo Thomas và Davey (1975) (trích dẫn bởi Trần Văn Minh, 2003) sự hình thành chồi từ mô sẹo được kích thích bởi :

- Các chất sinh trưởng đưa vào môi trường - Chất được sản sinh ra trong nuôi cấy mô sẹo - Các chất có chứa sẵn trong mẫu nuôi cấy

Khả năng hình thành chồi từ mô sẹo phụ thuộc vào số lần cấy chuyền mà các chất có trong mẫu không có khả năng tổng hợp trong thời gian dài (Gautheret,1959) và sự hình thành tế bào xốp (Trần Văn Minh, 2003)

Hình 2.4 Chồi lan Hồ Điệp tái sinh từ mô sẹo

Sự hình thành chồi được điều khiển bằng hóa chất (Skoog, 1944) Theo Trần Thanh Vân và Trinh (1978) sự hình thành chồi được điều khiển bằng :

2.4 Phôi vô tính

2.5.1 Lịch sử nghiên cứu

Bắt đầu từ 1958, Street và Reinert đã mô tả sự hình thành phôi vô tính từ các tế bào đơn của cà rốt Sau đó, vào 1977, Murashige đưa ra ý kiến tạo phôi vô tính có thể trở thành biện pháp vi nhân giống và tiếp tục cho đến nay thì công nghệ phôi vô tính được xem là rất có triển vọng cho nông nghiệp thế kỷ 21

Hình 2.5 Phôi vô tính lan Hồ Điệp

2.5.2 Khái niệm về phôi vô tính

Phôi vô tính hay phôi soma là các thể nhân giống (propagule) có cực tính bắt nguồn từ các tế bào dinh dưỡng, bao gồm cả phần mô phân sinh ngọn và mô phân sinh gốc, do đó có thể hình thành chồi và rễ

Không giống như các tế bào eukaryote, hầu hết tế bào thực vật đều có khả năng phát triển thành phôi dưới những diều kiện nhất định Williams và Maheswaran (1986) đã cho rằng phôi vô tính có thể được hình thành từ một tế bào đơn hay từ cả một cụm tế bào phôi tiến trình này khác với những quá trình tự nhiên khác và được gọi là quá trình hình thành phôi vô tính

Phôi vô tính rất giống phôi hữu tính ở hình thái và sinh lí nhưng không có quá trình tái tổ hợp di truyền do phôi vô tính không phải là sản phẩm của sự thụ tinh giữa giao tử đực và giao tử cái Do đó tất cả những cây con tái sinh bằng con đường này thì có vật chất di truyền giống hệt các tế bào sinh dưỡng đã sinh ra chúng (Nguyễn Văn Uyển, 1992) Đặc tính này của phôi sinh dưỡng không những cho phép thực hiện sự

nhân giống vô tính mà còn tạo ra những thay đổi chuyên biệt và trực tiếp để đưa các tính chất mong muốn vào các cá thể bằng việc chèn thêm những trình tự gen cố định vào tế bào sinh dưỡng (Saiprasad, 2001)

Giống như các tế bào của mô phân sinh, các tế bào sinh phôi có các đặc tính cơ bản như sau: tế bào nhỏ, có cùng một đường kính, có hoạt động biến dưỡng rất mạnh mẽ, có cường độ tổng hợp ribonucleic acid rất cao, có tế bào chất đậm đặc, không bào rất nhỏ, nhân to, dễ nhận thấy, hạch nhân rất to và sậm màu, đặc biệt là các tế bào này có một lượng lớn các ribosom, ty thể, lưới nội chất nhỏ và có vách rất dày (Ammirato, 1987; Emons, 1994; Raghvan, 1983; Thorpe, 1988)

2.5.3 Sự phát sinh hình thái của phôi vô tính

Tất cả các phôi vô tính đều có cấu trúc lưỡng cực, gồm có mô phân sinh của cả

chồi và rễ, do đó có thể hình thành một cây hoàn chỉnh trong nuôi cấy in vitro Sự phát

sinh hình thái ở phôi vô tính rất giống so với phôi hữu tính những phôi phát triển bình thường sẽ trải qua những giai đoạn phát triển riêng biệt như: hình cầu, hình tim, hình thủy lôi và hình lá mầm

 Cơ chế phát sinh phôi soma

Những quan sát chi tiết về quá trình phát sinh phôi phát hiện có 4 pha : 0, 1, 2 và 3, được nhận thấy trong giai đoạn đầu của tiến trình phát sinh phôi trong hệ thống nuôi cấy nói trên (Fujimura và Komamine, 1979)

Ở pha 0, những tế bào đơn (giai đoạn 0) hình thành những cụm tế bào có khả năng phát sinh phôi (giai đoạn 1) trên môi trường có auxin Trong suốt giai đoạn này, những cụm tế bào hình thành từ những tế bào đơn có khả năng tạo phôi khi môi trường nuôi cấy không có auxin, để hình thành những cụm tế bào giai đoạn 1

Sau đó, pha 1 xuất hiện khi cấy chuyển những cụm tế bào giai đoạn 1 qua môi trường không có auxin Trong suốt pha 1, những cụm tế bào tăng sinh chậm và dường như không biệt hóa

Sau pha 1 sự phân bào xuất hiện nhanh trên một phần của những cụm tế bào, dẫn đến việc hình thành những tế bào phôi hình cầu Pha này được gọi là pha 2

Pha tiếp theo sau, pha 3, cây con in vitro phát triển từ những phôi hình cầu qua

phôi hình tim và phôi hình thủy lôi

Hình 2.6 Các giai đoạn phát sinh phôi vô tính

 Các kiểu phát sinh phôi soma

Sự phát sinh phôi soma bất định

Các phôi vô tính có thể phát triển từ các tế bào hay các mô sẹo có liên quan của một số loài thực vật nhiệt đới, các phôi bất định này có thể được tạo trực tiếp từ tế bào đơn trên bề mặt của phôi non hoặc gián tiếp từ bề mặt của phôi non này Phương pháp này được sử dụng trong chương trình di truyền cải tạo giống, chẳng hạn như cứu các phôi bị chết non do lai tạo

Sự phát sinh đa phôi vô tính

Hiện tượng này xảy ra khi nuôi cấy các noãn non của thực vật hạt trần Các khối mô có khả năng tạo phôi cao khi được cấy chuyền sang môi trường mới sẽ phát triển và tăng trưởng thành phôi Mô có khả năng phát triển thành phôi có thể được phân biệt với mô không có khả năng phát triển thành phôi do màu trắng của phôi và hoá đỏ khi nhuộm bằng acetocarmine Dưới ánh đèn tử ngoại các tế bào phôi có thể phát huỳnh quang màu xanh lá cây

Sự phát sinh phôi soma do cảm ứng

Hiện tượng này do sự nuôi cấy lỏng các tế bào và mô sẹo sau khi các mô này chịu các xử lý đặc biệt đem lại sự cảm ứng khả năng tạo phôi Người ta đã thực hiện nhiều nghiên cứu trên nhiều loại thực vật ở các điều kiện nuôi cấy khác nhau để quan sát khả năng tạo thành mô sẹo

2.5.4 Những nhân tố ảnh hưởng đến sự hình thành phôi vô tính

Việc cảm ứng tạo phôi vô tính là một trong những công việc khá mới mẻ và rất khó khăn Để đạt được hiệu quả cao và thành công, việc tìm hiểu các điều kiện sinh lý, hóa học tác động đến sự hình thành phôi là một công việc rất quan trọng

 Mẫu cấy

Mỗi loại mẫu cấy có những khả năng cảm ứng tạo phôi khác nhau Sự lựa chọn mẫu cấy rất khắc khe, ví dụ, nhiều loài một lá mầm đòi hỏi mẫu cấy phải ở một giai đoạn cụ thể nào đó của hợp tử phôi non thì mới hình thành mô sẹo từ đó tạo phôi vô

tính Những bộ phận thích hợp được sử dụng để nuôi cấy tạo phôi Asparagus

officinalis, Lilium như chồi đỉnh, cuống lá, lóng thân, mầm, phôi chưa trưởng thành,

còn những bộ phận khác thì hiệu quả tạo phôi rất thấp (Hisato Kunitake, 1998)

 Môi trường nuôi cấy

Gần 70% nghiên cứu thành công đều nhờ vào sử dụng môi trường MS với hàm lượng muối khoáng cơ bản (Ammirato, 1983; Litz và Gray, 1992; Thorpe, 1988) Lý do vì môi trường này có chứa hàm lượng muối nitrat và ammonia cao Tỉ lệ giữa muối nitrat và ammonia trong môi trường rất quan trọng trong việc cảm ứng tạo phôi (Niedz, 1993, 1994) Polyamine trong môi trường dinh dưỡng có hiệu quả kích thích đến việc hình thành phôi vô tính (Minocha và Minocha, 1995) Những chất hữu cơ khác như nước dừa, casein thủy phân, tinh chất mạch nha (malt extract)… ở những nồng độ khác nhau cũng được sử dụng và đã cho thấy có nhiều ảnh hưởng đến cảm ứng tạo phôi ở một số loài thực vật Bên cạnh đó cũng đã có những đề nghị về vai trò của nitrogen, amino acid, amid, cũng như của kali, photphat đến sự hình thành phôi( Tisserat và cộng sự, 1979; Ammirato, 1983)

 Nguồn cacbohydrate

Sucrose là một nguồn cacbon chính trong môi trường nuôi cấy Tuy nhiên trong một vài trường hợp, galactose (Cabasson và cộng sự, 1997), lactose (Jumin và Nato, 1995), maltose (Dhir và Yavada, 1995), glucose và fructose (Canhoto và Cruz, 1994)

và manitol (Kunitake và cộng sự, 1991) khi kết hợp với sucrose đã đẩy mạnh sự cảm ứng tạo phôi cũng như sự phát sinh hình thái bình thường của phôi

 Chất điều hòa tăng trưởng

Chất điều hòa tăng trưởng được chia làm 5 nhóm chính là auxin, cytokinin, acid abscisic, gibberellin, ethylen Các chất điều hòa tăng trưởng là tối cần thiết cho việc cảm ứng tạo phôi và mỗi chất điều hòa tăng trưởng thì lại có những tác dụng lên việc tạo phôi khác nhau trên những loài thực vật khác nhau và ở những nồng độ khác nhau Quá trình cảm ứng hình thành phôi vô tính ở những loài thực vật khác nhau cho thấy có 3 kiểu ảnh hưởng của chất điều hòa tăng trưởng đối với phôi:

1) Sự hiện diện của chất điều hòa tăng trưởng là cần thiết trong tất cả các giai đoạn phát triển cuả phôi

2) Chất điều hòa tăng trưởng cần thiết trong giai đoạn cảm ứng, tuy nhiên, sang đến giai đoạn phát triển cao hơn thì các chất điều hòa này cẩn phải được loại bỏ

3) Sự hình thành phôi vô tính chỉ xuất hiện khi có sự có mặt của chất điều hòa tăng trưởng, nhưng khi phôi vô tính phát triển sau giai đoạn hình cầu thì sự có mặt của chất điều hòa không còn tác dụng nữa

Chất điều hòa tăng trưởng là auxin, thường là 2,4-D và NAA được sử dụng trong hơn 50% và 25% trường hợp cảm ứng tạo phôi (Evans và cộng sự, 1983; Litz và Gray, 1992) Có những sự khác biệt ở mức tế bào và mức độ phôi trong hoạt động phân chia tế bào của các tế bào phôi vô tính và tế bào mô sẹo, cũng như là những sự khác biệt trong sự phát triển hình thái của phôi vô tính được cảm ứng trên những chất auxin khác nhau ( Rodrigeuz và Wetztein, 1998) Auxin được chứng tỏ cho thấy có một tác dụng tích cực khi được sử dụng kết hợp với cytokinin và TDZ Tuy nhiên ở nồng độ auxin cao thường hạn chế sự phát triển của phôi vô tính trong những giai đoạn đầu tiên của sự phát triển phôi

Cytokinin cũng có những tác dụng tương đối lên sự hình thành phôi, nhưng nó không có những tác dụng đáng kể Mặc dù vậy, sự kết hợp của cả auxin và cytokinin cho thấy nhiều thuận lợi để đạt được hiệu quả cảm ứng phôi tối đa trên một số loài (Cruz và cộng sự, 1990; Nishi, 1997) Tuy nhiên hiện nay, đã có nhiều nghiên cứu sự

dụng TDZ, chất điều hòa tăng trưởng thuộc nhóm cytokinin, nhằm mục đích cảm ứng tạo phôi vô tính ở một số thực vật hai lá mầm (Murthy và cộng sự, 1998) Vì vậy trong những năm gần đây việc sử dụng TDZ đã trở nên phổ biến

Môi trường không có hormone thường được sử dụng cho sự phát triển của phôi vô tính từ dạng hình cầu cho tới khi phát triển thành cây con Đôi khi, những nồng độ thấp của hormone trong môi trường cần cho sự biểu hiện hoặc trong môi trường cần cho sự phát triển thì có thể có lợi, thậm chí là bắt buộc phải có, tùy theo loài, để kích thích sự phát triển bình thường của phôi

Tóm lại, để cảm ứng tạo một cấu trúc lưỡng cực cần phải có tín hiệu của một loại hormone Ngược lại, để cảm ứng tạo cơ quan thì phải có hai tín hiệu hormone khác nhau: đầu tiên là tạo chồi, sau đó tạo rễ, sử dụng hai môi trường khác nhau Để những tế bào phôi phát triển bình thường thành những cây con thì cần một môi trường khác, có hoặc không có hormone

 Thời gian xử lý

Khoảng thời gian mẫu cấy được xử lý với chất điều hòa tăng trưởng là một nhân tố quan trọng trong việc cảm ứng cũng như hình thành phôi vô tính một cách bình thường Khi mẫu cấy được chuyển sang môi trường không có nhân tố tăng trưởng, một khoảng thời gian tối thiểu là 8 ngày rất cần thiết cho việc cảm ứng hình thành phôi với một hiệu quả rất cao mà không cần quan tâm đến dạng chất điều hòa tăng trưởng đã sử dụng

 Sự tương quan gữa độ tuổi của mẫu cấy và sucrose

Thường thì độ tuổi (Wetzstein và cộng sự, 1989) hay giai đoạn phát triển của mẫu cấy (Karunaratne và cộng sự, 1991) là một nhân tố quan trọng trong cảm ứng tạo phôi Do đó, sự phát triển tối đa hay độ tuổi sinh lý của mẫu cấy là một nhân tố chủ yếu trongcảm ứng tạo phôi có hiệu quả ở một số loài thực vật Hơn nữa, nguồn dinh dưỡng cơ bản cần thiết (sucrose/cacbonhydrate) cho các loại mô thì khác nhau đáng kể tùy vào độ tuồi phát triển (Monnier, 1990) Bên cạnh đó, sự ảnh hưởng của các chất kích thích tăng trưởng khác nhau đến các loại mô khác nhau thì phụ thuộc nhiều vào nồgn độ sucrose có trong môi trường nuôi cấy (Thompson và Thorpe, 1987) Một

nồng độ sucrose cao (4-6%) được bổ sung ở giai đoạn cảm ứng và phát triển của phôi thì rất có lợi cho việc tạo phôi ở một số loài thực vật

 Nồng độ của môi trường

Nồng độ của các thành phần trong môi trường cơ bản có ảnh hưởng đến việc cảm ứng tạo phôi vô tính Hầu hết các nghiên cứu tạo phôi trên môi trường MS đều cho hiệu quả tạo phôi cao Nồng độ môi trường càng loãng thì khả năng tạo phôi càng kém

 Trạng thái vật lý của môi trường

Sự tạo thành phôi vô tính thường được cảm ứng trên môi trường bán rắn Tuy nhiên, trạng thái của môi trường (bán rắn hay lỏng) thì rất quan trọng trong việc duy trì và làm tăng cường sự phát triển của phôi vô tính Sự cảm ứng tạo phôi vô tính của

Gossypium klotzschiapum trên môi trường MS lỏng có bổ sung vitamin B, có chứa các

chất điều hòa tăng trưởng cho thấy đạt hiệu quả cao (Yuqiang Sun và cộng sự, 2003)

Ở Lilium longiflorum, kết quả tương tự cũng được phát hiện (Tribulato và cộng sự,

1997; Duong Tan Nhut và cộng sự, 2002)

 Kiểu gen

Một vấn đề thường gặp trong cảm ứng tạo phôi nữa là sự phụ thuộc rất lớn vào loại cây trồng và kiểu gen Kiểu gen có một ảnh hưởng to lớn trong việc cảm ứng tạo phôi của hầu hết các loài thực vật Không phải tất cả các thực vật đều có khả năng cảm ứng tạo phôi Đối với những cây tự thụ phấn, những giống cây khác nhau thì khả năng phát sinh phôi vô tính cũng có thể khác nhau

Đã có các thí nghiệm khác nhau tiến hành trên các loài có kiểu gen khác nhau để khảo sát khả năng hình thành phôi vô tính Chẳng hạn như ở cây Asparagus, người ta đã quan sát khả năng tạo phôi vô tính trên các giống có kiểu gen khác nhau (Hisato và Masahiro, 1998) Delbreil và Julien (1994) đã mô tả những khác biệt quan sát được từ tần suất tạo phôi từ chồi dỉnh của 12 giống Asparagus có các kiểu gen khác nhau Những khác biệt về tần suất hình thành phôi ở các loài đa bội ( lưỡng bội, tứ bội) cũng đã được phát hiện ( Kunitake và cộng sự, 1992) Haensch và cộng sự (1996) đã quan

sát khả năng hình thành phôi vô tính và tái sinh cây ở những giống Lilium có kiểu gen khác nhau

 Cường độ chiếu sáng

Các nhân tố khác trong môi trường nuôi cấy như là cường độ ánh sáng cũng có ảnh hưởng đến việc cảm ừng tạo thành phôi vô tính Các nghiên cứu cũng đã baó cáo về những ảnh hưởng khác nhau của chế độ sáng và tối Nhìn chung, chế độ tối đã cho thấy có những ảnh hưởng tốt hơn trong giai đoạn cảm ứng Ở một số loài thực vật, sự cảm ứng cần có những điều kiện ủ trong tối Những điều kiện trong tối có thể được tạo bằng cách bao môi trường nuôi cấy bằng những tấm nhôm mỏng hoặc đặt chúng trong

hộp carton Những nghiện cứu tạo phôi vô tính ở loài Gossypium kltzschianum và

L.longiflorum đạt được kết quả tốt khi nuôi cấy trong tối (Yuqiang Sun và cộng sự,

2003; Tribulato, 1997)

2.5.5 Những vấn đề thường gặp trong quá trình phát sinh phôi vô tính

Một vài vấn đề thường gặp trong quá trình phát sinh phôi vô tính ở vài loại thực vật là sự xuất hiện những phôi dị thường Các lá mầm có thể bị xoắn lại, mô phân sinh chồi có thể có hình dạng không bình thường hoặc có thể thiếu Những trường hợp này cần phải có những thao tác phụ để thúc đẩy sự xuất hiện bình thường và sự phát triển của phôi bằng cách sử dụng nồng độ từ thấp đến vừa phải các chất điều hòa tăng trưởng trong môi trường, sử dụng acid abscisic hoặc những cách xử lý thẩm lọc cao, hay bằng những phương pháp vật lý khác như sự sấy khô (Ammirato, 1983; Parrott, 1988)

Những thực vật được tái sinh từ nuôi cấy mô sẹo và huyền phù tế bào có thể bị biến dị về hình thái hoặc biến dị ở phần sinh dưỡng Tuy nhiên, những trường hợp đó ít xuất hiện ở những cây được tái sinh bởi sự phát sinh phôi vô tính hơn là những cây được tái sinh từ sự phát sinh cơ quan (Ammirato, 1987; Reisch, 1983) Nếu những cây được sử dụng với mục đích nhân lên, thì việc kiểm tra lại kiểu di truyền là rất quan trọng bằng cách tiến hành kiểm tra độ hữu thụ và chỉ số di truyền cho nhửng đặc điểm tiêu biểu Nếu những cây được sử dụng với mục đích sản xuất thì những kiểu biến dị nên được bỏ đi

Hình 2.7 Phôi có hình dạng dị thường

Một điều đáng chú ý nữa là sự phát sinh phôi vô tính và sự phát sinh cơ quan thì không loại trừ nhau Ví dụ, cỏ ba lá có thể được tái sinh từ phôi vô tính (Phillips và Collins, 1984) Tuy nhiên khi nuôi cấy trên môi trường thuận lợi cho sự phát triển chồi thì cũng tạo ra phôi vô tính, sau đó nuôi cấy trên môi trường thuận lợi cho sự nhân lên của chồi thì đã tạo ra nhiều cây tái sinh hơn so với khi nuôi cấy bình thường

Vì vậy những phương pháp làm cho phát sinh phôi và làm tái sinh cơ quan được kết hợp để làm tối ưu hóa khả năng tái sinh cây Thật thú vị khi trên cùng môi trường thuận lợi cho sự phát triển sinh cực chồi của những phôi vô tính cũng là môi trường thích hợp để tái sinh những hợp tử phôi lai khác loài Từ đó cho thấy đã có một vài đặc điểm tương tự giữa phôi hợp tử và phôi vô tính

2.5.6 Ứng dụng của việc tạo phôi vô tính

Phôi vô tính giúp cho công tác vi nhân giống và sản xuất với số lượng lớn thực vật bằng bioreactor, và đồng thời mở ra một hướng mới trong công nghệ tạo hạt nhân tạo phôi vô tính còn là nguyên liệu cho việc chuyển gen ở thực vật, công nghệ nuôi cấy tế bào trần Áp dụng công nghệ đông lạnh phôi vô tính là một phương pháp rất hiệu quả trong việc bảo quản phôi mầm trong một thời gian dài Quá trình tạo thành phôi vô tính còn giúp ích cho việc nghiên cứu tính toàn thể, cũng như tìm hiểu cơ chế biệt hóa ở tế bào thực vật Việc tạo thành công phôi vô tính ở một số loài thực vật, cả hạt trần lẫn hạt kín, cây một lá mầm và hai lá mầm, đã mở ra nhiều triển vọng mới cho

nền công nghệ sinh học thực vật, tuy nhiên đây là một công việc khó khăn và khá mới mẻ

Hình 2.8 Chồi lan Hồ Điệp tái sinh từ phôi

2.5.7 Một số thành tựu tạo phôi vô tính

Phôi vô tính đã được nghiên cứu trên hơn 130 loài, bao gồm các loài ngũ cốc, các loài cỏ, cây họ đậu và các cây có quả hình nón (Ammirato, 1983; Wann,1988) Trong đó, việc nghiên cứu tạo phôi Lan cũng rất được các nhà khoa học quan tâm

 Tạo phôi thông qua nuôi cấy protocorm lan Hồ Điệp (Jen Tsung Chen và Wei Chin Chang, Đài Loan):

Jen-Tsung Chen và Wei-Chin Chang là 2 nhà nghiên cứu lan nổi tiếng ở châu Á Hai ông tiến hành nuôi cấy Protocorm lan Hồ Điệp trên môi trường ½ MS không bổ sung chất điều hoà sinh trưởng Sau 45 ngày nuôi cấy, 28.1% mẫu cấy hình thành phôi, trung bình 1 mẫu hình thành 1 phôi

Khi nuôi cấy thử nghiệm Protocorm lan Hồ Điệp trên môi trường MS bổ sung TDZ (0.45M, 4.54M, 13.62M), hai ông thấy rằng TDZ có ảnh hưởng trực tiếp đến sự hình thành phôi vô tính Trong đó, môi trường bổ sung TDZ nồng độ 13.62M cho hiệu quả tạo phôi cao nhất: gần 100% mẫu protocorm hình thành phôi (45NSC) Trung bình

13.5 phôi/mẫu cấy… Ngược lại, khi bổ sung thêm NAA (nồng độ 0.54M và 57.37M) sẽ ức chế sự tạo phôi

 Phương pháp nuôi cấy tạo phôi lan Hồ Điệp từ cuống hoa (Ken Tokuhara và

Masahiro, Nhật Bản)

Theo báo cáo của hai nhà khoa học người Nhật này, khi nuôi cấy mẫu cuống hoa trên môi trường New Dogashima (NDM) có chứa (NAA 0,5µM + BA 4,4µM + sucrose 29,2 mM) thì mô sẹo phát sinh phôi (embryo callus) sẽ được tạo thành sau 7 tháng nuôi cấy, với tỉ lệ 73% mẫu cấy hình thành embryo callus

 Tác động của điều kiện nuôi cấy và cơ quan nuôi cấy lên sự hình thành phôi soma lan Oncidium (Jen-Tsung Chen và Wei-Chin Chang):

Theo báo cáo của tác giả, sự hình thành phôi có liên quan đến vị trí mẫu cấy: những mảnh có vị trí ở phía đầu lá có khả năng tạo phôi cao hơn là ở những vị trí khác và môi trường tốt nhất cho việc tạo phôi lan Oncidium là: môi trường 1/2MS (chứa 85mg/l KH2PO4) bổ sung 10-20 g/l sucrose, 170mg/l NaH2PO4 và 0,5 mg/l peptone

 Phương pháp nuôi cấy tạo phôi lan Hồ Điệp từ mô sẹo (Nguyễn Bá Hùng ,

Hồng Ngọc Trâm, 2005)

Phôi vô tính sẽ hình thành khi nuôi cấy mô sẹo trên môi trường MS bổ sung NAA 0,5 mg/l + BA 2 mg/l + đường 30g/l sau 11 tuần nuôi cấy

2.6 Công nghệ tạo hạt nhân tạo

2.6.6 Khái niệm về hạt nhân tạo

Hình 2.9 Hạt nhân tạo

Hạt tổng hợp hay hạt nhân tạo là một thuật ngữ được dùng để nói đến các phôi vô tính hoặc các thể nhân giống khác được bao lấy bởi một lớp gel mang chất dinh dưỡng, giúp cho việc bảo quản trong thời gian dài, vận chuyển trở nên dễ dàng hơn Khái niệm được đưa ra lần đầu tiên bởi Murashige vào năm 1978

Công nghệ hạt nhân tạo sử dụng phôi vô tính có vai trò rất quan trọng trong việc trồng trọt ở những loài thực vật :

(1) Không tạo được hạt

(2) Hạt được tạo thành với một số lượng thấp (3) Khả năng hạt sống sót thấp

(4) Việc nhân giống thực vật khó khăn và chất mầm không thể bảo quản được

2.6.2 Mục đích của sự ra đời công nghệ hạt nhân tạo

Sự biểu hiện thành công của việc tái sinh cây thông qua sự hình thành phôi vô tính ở một vài loài thực vật đã mở ra một phạm vi ứng dụng mới đó là tạo hạt nhân tạo nhằm tạo một hệ thống vận chuyển dễ dàng cho việc gieo trực tiếp phôi lên đất trồng Khả năng tái sinh cây của một số loài thực vật từ phôi vô tính và sự thích hợp khí hậu sau đó của cây là một trong những yếu tố khó khăn nhất nhằm đạt đến thành công

trong việc tạo hạt này Phôi vô tính được tạo thành in vitro thiếu một vỏ bao ngoài và

có khuynh hướng nẩy mầm ngay tức khắc (nếu phôi đã trưởng thành) dưới những điều kiện tối ưu hoặc có thể chuyển vào trạng thái thụ động nếu bị thiếu nước (Litz và Gray, 1992) Ngược lại phôi hợp tử với vỏ bao bên ngoài có một khả năng chịu hạn rất cao (Senaratna và csv, 1990, 1995; Teng và Hor, 1997) Do đó, cần có một hệ thống để cảm ứng phôi vô tính sao cho nó hoạt động giống phôi hợp tử, và từ đó có thể chịu đựng được những tổn hại ở mức tối thiểu

2.6.3 Qui trình tạo hạt nhân tạo

Bước 1: Chuẩn bị nguyên liệu tạo hạt nhân tạo  Với nguyên liệu là chồi (shootbud)

Dùng dao cắt những chồi (shootbud) có kích thước 2-3 mm từ cây nuôi cấy in vitro

 Với nguyên liệu là phôi vô tính

Dùng dao tách rời các phôi hình tim

Bước 2 Dùng pince cấy gắp các phôi/chồi cho vào môi trường tạo vỏ alginate

Bước 3 Dùng pipette 10ml hút môi trường alginate có chứa chồi/phôi nhỏ vào dung dịch CaCl2.2H2O 100mM trong 15 phút

Somatic embryos formed from cultured plant parts are ideal for artificial seed production.

Bước 4 Dùng pince gắp hạt vào đĩa petri có chứa nước cất vô trùng để làm sạch lượng CaCl2.H2O còn sót lại

Bước 5 Cấy hạt nhân tạo vào môi trường nuôi cấy (MS không bổ sung các chất điều hòa sinh trưởng)

2.6.4 Các nhân tố cần thiết trong việc tổng hợp hạt nhân tạo

Quá trình tổng hợp hạt nhân tạo từ phôi vô tính là một công việc được thực hiện với nhiều bước nhưng ít tốn kém Để việc tổng hợp hạt thành công thì đòi hỏi một yêu cầu cơ bản đó là phải có một số lượng lớn các phôi vô tính chất lượng cao, có sức sống tốt, và các phôi này phải phát triển đồng bộ Yêu cầu về một chất lượng tốt toàn diện của các phôi vô tính là yếu tố quan trọng hơn cả để đạt được tần suất biến đổi từ phôi đến cây con cao Quá trình làm vỏ bọc cho phôi chỉ quan trọng trong sự vận chuyển phôi, nó không phải là một nhân tố làm giới hạn sự phát triển của hạt nhân tạo

Có rất nhiều tác nhân tạo gel được sử dụng làm vỏ bọc cho phôi Đó có thể là agar, alginate, polyco 2133 (Bordon Co.), carboxyl methyl cellulose, carrageenan, gelrite (Kelko Co.), guargum, sodium pectate, tragacanth gum, dextran, xanthan gum … những hợp chất này sẽ đông lại thành gel khi được cho vào môi trường có chất điện phân thích hợp như đồng sulphate, calcium chloride hoặc ammonium chloride nhờ vào những liên kết ion Phương pháp được sử dụng rộng rãi nhất để tạo vỏ bọc cho phôi đó là sử dụng sodium alginate (Bajaj, 1995; Jeon và csv, 1986; Redenbaugh và csv, 1993) Alginate được sử dụng nhiều do nó có những đặc tính rất thuận lợi như tính dính vừa phải, không gây độc cho phôi sinh dưỡng, có các đặc tính tương hợp sinh học, khả năng tạo thành gel nhanh, rẻ tiền, để được lâu, độ cứng của gel vừa phải để có thể vừa tạo thuận lợi cho sự hô hấp của phôi và vừa bảo vệ được phôi khỏi những tổn thương bên ngoài

2.6.5 Nguyên tắc và điều kiện khi tạo vỏ bọc bằng chất nền alginate sodium

Alginate, chất hữu cơ mạch thẳng, kỵ nước, muối của acid alginic, là một polyuronic bao gồm -D-mannuronate (M) và mảnh bên C5 -L-guluronate (G) (Aoyagi và csv, 1998)

Nguyên tắc chính trong quá trình tạo vỏ bọc alginate đó là sodium alginate chứa phôi sẽ tạo thành từng hạt nhỏ, tròn và cứng khi nhỏ vào trong hỗn hợp NaCl2.2H2O nhờ vào sự trao đổi ion giữa ion Na+ có trong hỗn hợp sodium alginate với Ca2+ có trong hỗn hợp CaCl2.2H2O Vỏ bọc cứng nhiều hay ít là phụ thuộc vào số lượng ion Na+

trao đổi với ion Ca2+ Do đó nồng độ của hai tác nhân tạo gel, sodium alginate và CaCl2.2H2O, và thời gian cho việc tạo liên kết ion phải thật tối ưu để có thể tạo thành vỏ bọc ở một độ cứng thích hợp nhất

Không như phôi hợp tử, phôi vô tính thiếu lớp nội nhũ chứa chất dinh dưỡng bên ngoài nuôi phôi, do đó bằng việc thêm vào chất nền gel những chất dinh dưỡng, chất điều hòa tăng trưởng, carbohydrate sẽ tạo một nội nhũ nhân tạo thích hợp tối đa cho tăng trưởng và sống sót của phôi (Gray, 1990; Gray và Purohit, 1991; Redenbaugh và Walker, 1990) Ngoài ra nhằm tránh cho phôi bị mất nước, hay các tổn thương cơ học, tăng sức đề kháng cho phôi người ta có thể thêm vào chất nền gel chất kháng sinh, thuốc trừ nấm, trừ sâu, vi sinh vật

Mặc dù việc tạo hạt nhân tạo từ cách bọc phôi vô tính bằng sodium alginate cho thấy có một số thành công nhất định trong việc tái sinh cây con, vẫn còn nhiều vấn đề khó khăn khi sử dụng vỏ bao alginate này, chất dinh dưỡng có thể bị mất đi khỏi vỏ bao (Redenbaugh và csv, 1987), sự trao đổi khí kém (Redenbaugh và csv, 1993)… Đã có một số đề nghị cho rằng, việc thêm vào than hoạt tính sẽ giúp nâng cao khả năng sống sót, phát triển của phôi vô tính hơn Nguyên nhân là do than hoạt tính tăng cường khả năng hô hấp của phôi, và nó giữ lại những chất dinh dưỡng nhiều hơn trong vỏ bọc, phóng thích chúng rất chậm dùng cho sự phát triển của phôi

PHẦN 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP TIẾN HÀNH

3.1 Địa điểm và thời gian nghiên cứu

Các thí nghiệm được tiến hành tại Bộ môn Công nghệ Sinh học của Trường Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh

Thời gian thí nghiệm từ tháng 3/2005 đến tháng 8/2005

3.2 Vật liệu và phương pháp nghiên cứu

PLB (protocorm like body) cây lan Hồ Điệp (Phalaenopsis sp.) in vitro

 Môi trường nuôi cấy

Các thí nghiệm được thực hiện trên 2 môi trường MS (Murashige và Skoog, 1962) và VW (Vacin và Went, 1949)

Môi trường được bổ sung các chất kích thích sinh trưởng như BAP, 2,4D, TDZ, và các chất khác (khoai tây, nước dừa, đường, than hoạt tính) tùy theo mỗi nghiệm thức thí nghiệm pH môi trường 5,7 Thể tích môi trường là 70ml/bình tam giác

Bột sodium alginate, agar được dùng tạo gel và dung dịch CaCl2.2H2O 100mM giúp tạo vỏ cứng cho hạt

Môi trường nuôi cấy được hấp khử trùng ở điều kiện áp suất 1,2 atm, nhiệt độ 1210C trong 20 phút

 Điều kiện nuôi cấy

Phòng dưỡng cây có nhiệt độ 250C± 20C, thời gian chiếu sáng 16 giờ, cường độ chiếu sáng 2.500 lux, ẩm độ 75-80%

3.2.2 Phương pháp

3.2.2.1 Thiết kế thí nghiệm

Thực hiện 5 thí nghiệm theo các giai đoạn sau :

- Giai đoạn 1 : tạo mô sẹo từ PLB của cây lan Hồ Điệp in vitro - Giai đoạn 2 : tạo phôi soma từ mô sẹo của cây lan Hồ Điệp in vitro - Giai đoạn 3 : tạo cây lan Hồ Điệp in vitro hoàn chỉnh từ phôi soma

- Giai đoạn 4 : tạo hạt nhân tạo từ phôi soma và tạo cây hoàn chỉnh từ hạt nhân tạo

Các thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên, 3 lần lặp lại Mỗi nghiệm thức cấy 3 bình tam giác, mỗi bình cấy 5 mẫu

 Tổng số mẫu cấy ở mỗi thí nghiệm: 45 mẫu

 Các thí nghiệm tạo mô sẹo từ PLB (protocorm like body)

Thí nghiệm 1 : Ảnh hưởng của chất điều hoà sinh trưởng 2,4-D và BAP đến

khả năng hình thành mô sẹo từ PLB của cây lan Hồ Điệp in vitro

Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng của nồng độ đường và nước dừa đến khả năng hình thành

mô sẹo từ PLB của cây lan Hồ Điệp in vitro