Bài nghiên cứu này xây dựng thành công quy trình phát hiện ngô biến đổi gene bằng kỹ thuật LAMP. Kết quả cho thấy thông số tối ưu cho phản ứng này gồm nồng độ primer FIP/BIP: 0,8 µM, F3/B3: 0,2 µM, hàm lượng DNA 12,5 ng/µL, nhiệt độ tối ưu 62o C đến 67o C. Kết quả này chứng minh phản ứng LAMP có độ nhạy cao hơn phản ứng PCR và có thể áp dụng rộng rãi ngoài thực tế. Mời các bạn cùng tham khảo!
Kỷ yếu Hội nghị khoa học XÂY DỰNG QUY TRÌNH KỸ THUẬT LAMP ĐỂ NHẬN BIẾT NGÔ BIẾN ĐỔI GENE Nguyễn Trọng Nghĩa*, Hồ Viết Thế Trường Đại học Công nghiệp Thực phẩm TP.HCM *Tác giả liên lạc: nghiant0503@gmail.com TÓM TẮT Hiện nay, nước ta trồng ngô biến đổi gene cách rộng rãi nhiên nhiều ý kiến tranh cãi mức độ an toàn sản phẩm Vì việc kiểm sốt thực phẩm có chứa thành phần ngơ biến đổi gene nhanh chóng, xác cần thiết Nhiều phương pháp sinh học phân tử áp dụng có kỹ thuật LAMP đáp ứng yêu cầu độ xác, thử nghiệm nhanh chóng, có tính linh động cao với khả phân tích mẫu trường Trong phạm vi nghiên cứu này, xây dựng thành cơng quy trình phát ngơ biến đổi gene kỹ thuật LAMP Kết cho thấy thông số tối ưu cho phản ứng gồm nồng độ primer FIP/BIP: 0,8 µM, F3/B3: 0,2 µM, hàm lượng DNA 12,5 ng/µL, nhiệt độ tối ưu 62oC đến 67oC Kết chứng minh phản ứng LAMP có độ nhạy cao phản ứng PCR áp dụng rộng rãi ngồi thực tế Từ khóa: Promoter 35S, LAMP, ngô, PCR DEVELOP LAMP METHOD TO DETECT GENETICALLY MODIFIED MAIZE Nguyen Trong Nghia*, Ho Viet The Ho Chi Minh city University of Food Industry *Corresponding Author: nghiant0503@gmail.com ABSTRACT At present, Vietnam has grown genetically modified (GM) maize widely However there are still several controversies about the safety of this product, so that investigating new method to detect GM maize in food product fast and exactly is neccessary In this study, we develop new method to detect GM maize by using LAMP technique In this study, we identify the optimal condition for LAMP reaction as followings: the best concentration of primers FIP/BIP: 0,8 µM, F3/B3: 0,2 µM, the threshold DNA detection: 6,25 ng/µL, the optimal reaction temperature: 62oC to 67oC This result demonstrates that the LAMP reaction suitable for identifying GM maize and it can be further developed to apply in pratices Keywords: Promoter 35S, LAMP, maize , PCR MỞ ĐẦU Hiện nay, thực phẩm làm từ nguyên liệu có nguồn gốc sinh vật biến đổi gene (GMO) ngày sử dụng rộng rãi Các lương thực lúa, ngô biến đổi gene hay công nghiệp đỗ tương, biến đổi gene trồng với diện tích rộng lớn tồn giới [1] Từ năm 2015, Bộ Nông Nghiệp Phát Triển Nông Thôn cho phép trồng đại trà giống ngô NK66 Bt (giống chuyển gene Bt11), NK66 Gt (giống chuyển gene GA21) NK66 Bt/Gt (giống chuyển gene Bt11 GA21) có khả kháng sâu đục thân thuốc diệt cỏ vùng nước Mặc dù giống ngô chuyển gene đem lại hiệu lớn suất chất lượng sản phẩm, giới nói chung Việt Nam nói riêng có ý kiến trái chiều giống ngơ Một vài thử nghiệm tác động GMO dối với động vật chuột lợn ghi nhận GMO tạo protein khơng mong muốn gây dị ứng, gây phản ứng miễn dịch hay tạo khối u kết không đáng kể thấp mức ngưỡng cho phép nên thực phẩm GMO phân phối thị trường [2-4] Vì vậy, việc quản lý sinh vật biến đổi gene, thực dán nhãn thực phẩm có nguồn gốc từ sinh vật biến đổi gene giúp tạo thêm lựa chọn cho người tiêu dùng, thêm lựa chọn cho nhà sản xuất Hiện có nhiều phương pháp phát nguyên liệu thực phẩm có chứa thành phần biến đổi gene PCR, Realtime PCR, ELISA [5, 6] Hầu hết phương pháp xác định chuyển gene trọng đến diện promoter 35S, promoter hoạt đơng mạnh sử dụng phổ biến chuyển gene vào trồng, có ngơ chuyển gene [7-9] Tuy nhiên phương pháp có nhược điểm phụ thuộc nhiều vào thiết bị đại đắt tiền phân 178 Kỷ yếu Hội nghị khoa học tích phịng thí nghiệm Yêu cầu thực tế cần phát triển phương pháp phát nguyên liệu thực phẩm biển đổi gene có tính di động cao để xác định cánh đồng từ chợ, siêu thị… Từ năm 2000, Notomi cộng nghiên cứu thành cơng kỹ thuật LAMP (Loop Mediated Isothermal Amplification), phát đoạn DNA đặc hiệu xác, nhanh chóng, đơn giản thu nhận kết trường [10] Kỹ thuật sử dụng thành công để phát loại sinh vật gây bệnh nhiều nơi giới Việt Nam [11-13] Trong nghiên cứu xây dựng quy trình phát nguyên liệu thực phẩm biến đổi gene kỹ thuật LAMP thông qua promoter 35S ngô biến đổi gene ty TNHH Syngenta Việt Nam Phương pháp nghiên cứu Mẫu ngô NK66 BT/GT tách chiết quy trình ly trích DNA Bùi Minh Trí, 2002 [14] Trong quy trình ly trích, thay đổi thời gian ủ mẫu với đệm ly trích DNA SDS 10% từ thành 24 DNA định tính phương pháp điện di với điện 110V 20 phút sau phân tích hình ảnh với máy chụp gel Quantum - ST4 3000 (Montreal – Biotech, Canada) định lượng phương pháp đo mật độ quang với máy (OD) UV-Vis 6600 Phản ứng PCR thực với cặp primer 35S1/35S-2 thiết bị SureCycler 8800 Thermal Cycler (Agilent, Mỹ) để khẳng định diện promoter 35S sản phẩm ngô sử dụng để so sánh độ nhạy, làm mẫu đối NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP chứng kết thực phản ứng LAMP Tổng thể tích phản ứng PCR 12 µL bao gồm: NGHIÊN CỨU primer xuôi 20 µM µL, primer ngược 20 µM Nguyên liệu Mẫu ngô NK66 BT/GT (giống ngơ lai đơn F1 µL, DNA (50ng/µL) µL, MyTaqTM HS White mang gene kháng sâu cánh vảy: Bt11 chống Mix (Bioline, Mỹ) 2x µL nước cất khử ion chịu thuốc trừ cỏ Glyphosate) có nguồn gốc từ cơng µL Bảng Trình tự cặp primer 35S-1/35S-2 Tên primer Trình tự primer xi ngược (5’-3’) Kích thước đoạn khuếch đại GCTCCTACAAATGCCATCA 35S-1 195 (bp) GCTCCTACAAATGCCATCA 35S-2 Phản ứng LAMP tối ưu hóa việc khảo 67oC Tổng thể tích phản ứng LAMP 25 µL sát nồng độ primer cho phản ứng, thay bao gồm: primer F3/B3, FIP/BIP 0,2-0,8 µM; 15 đổi nồng độ primer theo nghiệm thức F3/B3 µL Isothermal Master Mix 1X (Optigene, Anh); FIP/BIP (0,2; 0,4; 0,6 0,8 µM); sau chúng tơi µL DNA (40 ng/µL) Hỗn hợp ủ 65oC khảo sát hàm lượng DNA với hàm lượng thay 60 phút Cuối cùng, kết phản ứng LAMP đổi theo nghiệm thức: 12,5; 25; 50; 100 200 nhận biết phương pháp điện di gel ng/µL, cuối khảo sát nhiệt độ tối ưu cho agarose 1,5% nhận biết trực tiếp thuốc phản ứng LAMP với nhiệt độ thay đổi từ 62oC đến nhuộm GelRedTM Bảng Trình tự cặp primer F3/B3 FIP/BIP phản ứng LAMP Tên primer Trình tự primer (5’ – 3’) AAGATGCCTCTGCCGACA F3 CAGCGTGTCCTCTCCAAAT B3 ACGTGGTTGGAACGTCTTCTT-CCCAAAGATGGACCCCCA FIP ATCTCCACTGACGTAAGGGATG-ATAGAGGAAGGGTCTTGCGA BIP KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Kết khảo sát độ nhạy phản ứng PCR với cặp primer 35S-1/35S-2 Sau thực ly trích DNA thành công, thực phản ứng PCR truyền thống để khẳng định mẫu ngô công ty Syngenta giống biến đổi gene Kết thu băng vạch khuếch đại đặc hiệu vị trí 195 bp, kết tương tự với nghiên cứu trước Zhou cộng sự, 2009, Rabieia cộng sự, 2013 [17, 18], bên cạnh việc tăng nồng độ mẫu DNA ban đầu từ 6,25 ng/µL lên mức 200 ng/µL làm cho băng vạch xuất rõ chứng tỏ nồng độ DNA cao hiệu phản ứng PCR tốt Vậy nồng độ mẫu DNA ban đầu tối ưu cho phản ứng 200 ng/µL Kết điện di sản phẩm PCR 179 Kỷ yếu Hội nghị khoa học thể Hình Kết khẳng định giống ngô từ công ty Syngenta giống biến đổi gene có sử dụng trình tự 35S làm promoter cấu trúc gene chuyển Vì chúng tơi sử dụng giống ngô để phát triển phương pháp LAMP cho thí nghiệm Hình Kết phản ứng PCR khảo sát độ nhạy phản ứng PCR với cặp primer 35S-1/35S-2 (M: Ladder 100 bp, 1: Mẫu đối chứng âm, 2: Mẫu DNA 6,25 ng/µL, 3: Mẫu DNA 12,5 ng/µL, 4: Mẫu DNA 25 ng/µL, 5: Mẫu DNA 50 ng/µL, 6: Mẫu DNA 100 ng/µL, 7: Mẫu DNA 200 ng/µL) Khảo sát tối ưu nồng độ primer phản ứng F3/B3: 0,2 µM), nghiệm thức (FIP/BIP: 0,8 µM, F3/B3: 0,2 µM ) nghiệm thức 10 (FIP/BIP: 0,4 LAMP Để xác định nồng độ tối ưu cặp primer sử µM, F3/B3: 0,6 µM) Vì vậy, chúng tơi chọn dụng cho phản ứng LAMP, tiến hành nghiệm thức nồng độ hai cặp primer tối ưu là: nghiệm thức có phối hợp hai yếu tố với FIP/BIP: 0,8 µM, F3/B3: 0,2 µM Kết phù nồng độ khác nhau, kết thể hợp với nghiên cứu nồng độ primer Hình Từ kết chúng tơi nhận thấy tất kỹ thuật LAMP công bố trước nghiệm thức xuất sản phẩm khuếch Zhou cộng sự, 2014 [19] Tỉ lệ hai cặp primer đại trừ nghiệm thức 13 (FIP/BIP: 0,2 µM, F3/B3: sử dụng để thực thí nghiệm tiếp 0,8 µM) Các nghiệm thức xuất băng vạch rõ theo nghiệm thức (FIP/BIP: 0,6 µM, Hình Kết phản ứng LAMP khảo sát nồng độ hai cặp primer F3/B3 FIP/BIP Khảo sát tối ưu lượng DNA mẫu phản nghiệm thức phản ứng LAMP với nồng độ DNA khác xuất các băng vạch ứng LAMP Kết điện di sản phẩm phản ứng LAMP với mẫu điện di kết tương tự với nghiên cứu DNA giống ngô chuyển gene có nồng độ thay Zahradnik cộng sự, 2014 [16] Kết đổi từ 12,5 ng/µL đến 200 ng/µL, kết cho thấy trình bày Hình 180 Kỷ yếu Hội nghị khoa học Hình Kết phản ứng LAMP khảo sát nồng độ DNA (M: Ladder 1000 bp, 1: Mẫu đối chứng âm, 2: Mẫu DNA 12,5 ng/µL, 3: Mẫu DNA 25 ng/µL, 4: Mẫu DNA 50 ng/µL, 5: Mẫu DNA 100 ng/µL, 6: Mẫu DNA 200 ng/µL) Vậy phản ứng LAMP, cần lượng DNA nghiên cứu trước Nkouawa cộng sự, mẫu µL với nồng độ 12,5 ng/µL thực 2009 [13] phản ứng Khi so sánh độ nhạy phản Khảo sát tối ưu nhiệt độ cung cấp cho phản ứng LAMP phản ứng PCR thí nghiệm 3.1, có ứng LAMP thể thấy sản phẩm phản ứng LAMP Với mục đích thử nghiệm sử dụng thiết bị gia nhiệt phản ứng PCR thu băng vạch sáng, đơn giản để thay cho máy PCR, chúng tơi sử rõ ràng Chúng ta kết luận, dụng bể ổn nhiệt để thực phản ứng LAMP lượng DNA mẫu, phản ứng LAMP có độ nhạy Kết điện di mẫu khảo sát thể việc khuếch đại đoạn DNA đặc trưng tương Hình đương phản ứng PCR kết tương tự Hình Kết khảo sát nhiệt độ phản ứng LAMP (1: Ladder 1000 bp, 2: nhiệt độ 62oC, 3: nhiệt độ 63oC, 4: nhiệt độ 64oC, 5: nhiệt độ 65oC, 6: nhiệt độ 66oC, 7: nhiệt độ 67oC) Kết điện di sản phẩm LAMP cho thấy nhiệt phản ứng LAMP với nhiệt độ tối ưu (61, 63, 65oC) độ giao động từ 62oC đến 67oC mẫu thử So sánh hiệu phản ứng LAMP bể nghiệm xuất băng vạch đặc trưng ổn nhiệt bình giữ nhiệt khơng có khác lớn nhiệt độ Với mong muốn phương pháp LAMP phản ứng Chúng ta kết luận nhiệt độ tối áp dụng rộng rãi linh động, phát triển ưu để thực phản ứng LAMP khoảng nhiệt phương pháp thông qua việc thực phản ứng độ từ 62oC đến 67oC Kết thu LAMP bình ổn nhiệt cầm tay so sánh hiệu có tương đồng so sánh kết với nghiên với phản ứng sử dụng bể ổn nhiệt, kết cứu trước Zhen cộng sự, 2016 [20], khảo sát thể Hình 181 Kỷ yếu Hội nghị khoa học Hình Kết phản ứng LAMP thực bể ổn nhiệt hai ngăn (A) bình giữ nhiệt (B) (1: Mẫu DNA 12,5 ng/µL, 2: Mẫu DNA 25 ng/µL, 3: Mẫu DNA 50 ng/µL, 4: Mẫu DNA 100 ng/µL, 5: Mẫu DNA 200 ng/µL) Kết điện di sản phẩm phản ứng LAMP 100 200 ng/µL Tuy bình giữ nhiệt có khả bể ổn nhiệt đặt nhiệt độ 65oC cho thấy thực phản ứng LAMP ổn định mẫu khảo sát xuất băng vạch nhiệt độ suốt thời gian phản ứng không cao Đối với kết điện di sản phẩm phản ứng LAMP nên tỉ lệ thực thấp (3/5 mẫu xảy thực bình giữ nhiệt, có mẫu phản ứng – chiếm 60%) Vì vậy, để sử dụng giếng 3, 4, tương ứng hàm lượng DNA 50, 100 bình giữ nhiệt thực phản ứng LAMP nhận biết 200 ng/µL xuất băng vạch cịn mẫu cịn nơng sản chuyển gene đại trà, cần áp dụng thêm lại phản ứng LAMP không xảy nên không xuất biện pháp giúp giữ nhiệt độ ổn định để tăng tỉ băng vạch Kết cho thấy việc thực lệ thành công thực phản ứng LAMP bình giữ nhiệt có ngưỡng Kiểm tra kết phản ứng LAMP thuốc phát cao so với bể ổn nhiệt Điều có nhuộm GelRedTM thể giải thích nhiệt độ bình ủ nhiệt thơng Để nhận biết kết phản ứng LAMP cách thường khơng có khả giữ nhiệt ổn định nhanh chóng, chúng tơi sử dụng thuốc nhuộm thời gian dài đủ để phản ứng xảy Vì vậy, chúng GelRedTM Kết thí nghiệm thể qua nên chọn sử dụng hàm lượng DNA mức 50, Hình Hình Kết thí nghiệm nhận biết sản phẩm phản ứng LAMP thuốc nhuộm GelRedTM (Hàng A: Các mẫu sau thực phản ứng LAMP, Hàng B: Các mẫu không thực phản ứng LAMP 1: Mẫu DNA 12,5 ng/µL, 2: Mẫu DNA 25 ng/µL, 3: Mẫu DNA 50 ng/µL, 4: Mẫu DNA 100 ng/µL, 5: Mẫu DNA 200 ng/µL) 182 Kỷ yếu Hội nghị khoa học Qua kết Hình cho thấy, sản phẩm phản ứng LAMP kết hợp hiệu với thuốc nhuộm GelRedTM (Hàng A), có khả phát sáng ánh đèn UV Bên cạnh đó, mẫu ban đầu khơng ủ máy ln nhiệt (Hàng B) khơng có tượng phát quang tia UV kết hợp với GelRedTM hai nhóm phân biệt mắt thường Tuy nhiên, kết phát quang khác biệt nghiệm thức hàm lượng DNA khác Như vậy, việc sử dụng thuốc nhuộm huỳnh quang GelRedTM để phát kết sản phẩm phản ứng LAMP khả thi, ứng dụng rộng rãi để phát thực phẩm biến đổi gene nói chung ngơ chuyển gene nói riêng KẾT LUẬN Trong nghiên cứu chúng tơi hồn thiện quy trình phát ngơ biến đổi gien thơng qua xác định có mặt promoter 35S kỹ thuật LAMP Chúng chứng minh hệ thống gia nhiệt thông dụng bể ổn nhiệt bình nước nóng cầm tay sử dụng cho hệ phản ứng LAMP Điều chứng minh khả ứng dụng rộng rãi kỹ thuật LAMP phát nông sản biến đổi gene hồn thiện Kit để ứng dụng rộng rãi thực tế sống TÀI LIỆU THAM KHẢO Tạ Bá Hưng, Cao Minh Kiểm, Đặng Bảo Hà, Nguyễn Mạnh Quân, Nguyễn Phương Anh, Phùng Anh Tiến Quản lý thực phẩm biến đổi gen: Kinh nghiệm Mỹ, Liên minh Châu Âu Trung Quốc CỤC THÔNG TIN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ QUỐC GIA 2010:9-12 Chowdhury EH, Kuribara H, Hino A, Sultana P, Mikami O, Shimada N cộng Detection of corn intrinsic and recombinant DNA fragments and Cry1Ab protein in the gastrointestinal contents of pigs fed genetically modified corn Bt11 JOURNAL OF ANIMAL SCIENCE 2003;81:2546-51 Prescott VE, Campbell PM, Moore A, Mattes J, Rothenberg ME, Foster PS cộng Transgenic Expression of Bean r-Amylase Inhibitor in Peas Results in Altered Structure and Immunogenicity Agricultural and Food Chemystry 2005;53:9023-30 Schubert D A different perspective on GM food Nature Biotechnology 2002;20 (Nature Publishing Group):969 Randhawa GJ, Firke PK Detection of transgenes in genetically modified soybean and maize using polymerase chain reaction Indian Journal of Biotechnology 2006;5:510-3 Meric S, Cakir O, Turgut-Kara N, Ari S Detection of genetically modified maize and soybean in feed samples Genetics and molecular research : GMR 2014 Feb 25;13(1):1160-8 PubMed PMID: 24634172 Fernandez S, Delobel CC, Geldreich A, Berthier G, Boyer F, Collonnier C cộng Quantification of the 35S Promoterin DNAExtracts from Genetically Modified Organisms Using Real-Time Polymerase Chain Reaction and Specificity Assessment on Various Genetically Modified Organisms, Part I: Operating Procedure AOAC International 2005;88:547-57 Steinbrecher RA The CaMV 35S Promoter Government and Corporate Scientific Incompetence: Failure to assess the safety of GM crops ECONEXUS 2002 Feinberg M, Fernandez S, Delobel CC, Cassard S, Bertheau Y Quantitation of 35S Promoterin Maize DNAExtracts from Genetically Modified Organisms Using Real-Time Polymerase Chain Reaction, Part 2: Interlaboratory Study AOAC International 2005;88:558-73 Notomi T, Okayama H, Masubuchi H, Yonekawa T, Watanabe K, Amino N cộng Loopmediated isothermal aplification of DNA Nucleic Acids Research 2000;28 AG Biotech Hệ thống LAMP để phát trồng GM 2013 Hoàng Phú Hiệp, Lê Quang Huấn PHÁT TRIỂN KỸ THUẬT LAMP (LOOP-MEDIATED ISOTHERMAL AMPLIFICATION) CHO VIỆC PHÁT HIỆN NHANH VÀ CHÍNH XÁC VI KHUẨN Escherichia coli O157: H7 TẠP CHÍ SINH HỌC 2012;34:343-6 Nkouawa A, Sako Y, Nakao M, Nakaya K, Ito A Loop-mediated isothermal amplification 183 Kỷ yếu Hội nghị khoa học method for differentiation and rapid detection of Taenia species Journal of clinical microbiology 2009 Jan;47(1):168-74 PubMed PMID: 19005142 Pubmed Central PMCID: 2620829 Bùi Minh Trí Xây dựng quy trình chẩn đốn bắp có chuyển gene kháng sâu (CryIA [b]) gene tăng cường chuyển hóa đường (Invertase) kỹ thuật PCR 2002 (Trung tâm Phân tích Thí nghiệm Hóa sinh, Đại học Nơng Lâm Tp.Hồ Chí Minh) Lin H-Y, Chiueh L-C, Shih DY-C Detection of Genetically Modified Soybeans and Maize by the Polymerase Chain Reaction Method Journal of Food and Drug Analysis 2000;8(3):200-7 Zahradnik C, Kolm C, Martzy R, Mach RL, Krska R, Farnleitner AH cộng Detection of the 35S promoter in transgenic maize via various isothermal amplification techniques: a practical approach Analytical and bioanalytical chemistry 2014 Nov;406(27):6835-42 PubMed PMID: 24880871 Rabieia M, Mehdizadehb M, Rastegara H, Vahidic H, Alebouyeha M Detection of Genetically Modified Maize in Processed Foods Sold Commercially in Iran by Qualitative PCR Iranian Journal of Pharmaceutical Research 2013;12:25-30 Zhou X, Xing D, Tang Y, Chen WR PCR-free detection of genetically modified organisms using magnetic capture technology and fluorescence cross-correlation spectroscopy PloS one 2009 Nov 26;4(11):e8074 PubMed PMID: 19956680 Pubmed Central PMCID: 2778010 Zhou D, Guo J, Xu L, Gao S, Lin Q, Wu Q cộng Establishment and application of a loopmediated isothermal amplification (LAMP) system for detection of cry1Ac transgenic sugarcane Scientific reports 2014 May 09;4:4912 PubMed PMID: 24810230 Pubmed Central PMCID: 4014978 Zhen Z, Zhang M, Yu Y, Gao X, Zhu Y, Yan Y cộng Establishment of a loop-mediated isothermal amplification (LAMP) detection method for genetically modified maize MON88017 European Food Research and Technology 2016;242(10):1787-93 184 ... thu nhận kết trường [10] Kỹ thuật sử dụng thành công để phát loại sinh vật gây bệnh nhiều nơi giới Việt Nam [11-13] Trong nghiên cứu xây dựng quy trình phát nguyên liệu thực phẩm biến đổi gene kỹ. .. kỹ thuật LAMP thông qua promoter 35S ngô biến đổi gene ty TNHH Syngenta Việt Nam Phương pháp nghiên cứu Mẫu ngô NK66 BT/GT tách chiết quy trình ly trích DNA Bùi Minh Trí, 2002 [14] Trong quy trình. .. Kết khẳng định giống ngô từ công ty Syngenta giống biến đổi gene có sử dụng trình tự 35S làm promoter cấu trúc gene chuyển Vì sử dụng giống ngô để phát triển phương pháp LAMP cho thí nghiệm Hình