Tách và xác định cấu trúc hợp chất rutin từ thân và lá cây sắn dây (pueraria lobata willd) ở việt nam

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC VINH LƢU THỊ THANH NHÀN TÁCH VÀ XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC HỢP CHẤT RUTIN TỪ THÂN VÀ LÁ CÂY SẮN DÂY ( PUERARIA LOBATA WILLD) Ở VIỆT NAM LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Vinh - 2011 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC VINH TÁCH VÀ XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC HỢP CHẤT RUTIN TỪ THÂN VÀ LÁ CÂY SẮN DÂY (PUERARIA LOBATA WILLD) Ở VIỆT NAM Chuyên ngành: Hoá thực phẩm LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: TS TRẦN ĐÌNH THẮNG Sinh viên thực hiện: LƢU THỊ THANH NHÀN Vinh - 2011 MỤC LỤC MỞ ĐẦU 1 Lí chọn đề tài Nhiệm vụ nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu Chƣơng 1: TỔNG QUAN 1.1 Chi Pueraria 1.1.1 Đặc điểm thực vật 1.1.1.1 Phân loại phân bố 1.1.1.2 Đặc điểm sinh thái 1.1.2 Thành phần hóa học 1.1.3 Những ứng dụng 1.2.Cây sắn dây 11 1.2.1 Đặc điểm thực vật 11 1.2.1.1 Dạng sống săn dây 11 1.2.1.2 Đặc điểm phân bố, sinh thái 12 1.2.2 Thành phần hóa học 13 1.2.2.2 Rễ 13 1.2.2.3 Hoa 17 1.2.3 Dược tính cách dùng 21 Chƣơng PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU VÀ THỰC NGHIỆM 25 2.1 Phương pháp lấy mẫu 25 2.2 Thiết bị phương pháp 25 2.2.1 Hoá chất 25 2.1.2 Các phương pháp sắc ký 25 2.1.2 Sắc ký khí - khối phổ (GC/MS) 25 2.1.2.3 Sắc ký mỏng 25 2.1.2.4 Sắc ký cột 26 2.2 Dụng cụ thiết bị.S 26 2.3.1 Phân lập hợp chất 26 Chƣơng 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 28 3.1 Phân lập 28 3.2 Xác định cấu trúc hợp chất 52 28 KẾT LUẬN 50 TÀI LIỆU THAM KHẢO 51 DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ CÁI VIẾT TẮT CC: Column Chromatograpyl (Sắc ký cột) FC: Flash Chromatography (Sắc ký cột nhanh) TLC: Thin Layer Chromatography (Sắc ký lớp mỏng) IR: Infrared Spectroscopy (Phổ hồng ngoại) MS: Mass Spectroscopy (Phổ khối lượng) EI-MS: Electron Impact-Mass Spectroscopy (Phổ khối va chạm electron) ESI-MS: Electron spray Impact-Mass Spectroscopy (Phổ khối lượng phun mù electron) H-NMR: Proton Magnetic Resonance Spectroscopy (Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton) 13 C-NMR: Carbon Magnetic Resonance Spectroscopy (Phổ cộng hưởng từ hạt nhân carbon-13) DEPT: Distortionless Enhancement by Polarisation Transfer HSQC: Heteronuclear Single Quantum Correlation HMBC: Heteronuclear Multiple Bond Correlation COSY: Correlation Spectroscopy s: singlet br s: singlet tù t: triplet d: dublet dd: dublet dublet dt: dublet triplet m: multiplet TMS: Tetramethylsilan DMSO: DiMethylSulfoxide Đ.n.c: Điểm nóng chảy MỞ ĐẦU Lý chọn đề tài Việt Nam nằm vùng trung tâm Đơng Nam Á hàng năm có lượng mưa nhiệt độ trung bình tương đối cao Với khí hậu nhiệt đới gió mùa nóng, ẩm cho rừng Việt Nam hệ thực vật đa dạng phong phú Theo số liệu thống kê gần hệ thực vật Việt Nam có 10.000 lồi [5], có khoảng 3.200 loài sử dụng y học dân tộc 600 loài cho tinh dầu [7] Đây nguồn tài nguyên thiên nhiên quý báu đất nước có tác dụng lớn đời sống sức khỏe người Từ trước đến giới hợp chất thiên nhiên có hoạt tính sinh học ln đóng vai trị quan trọng thực tế đời sống Các hợp chất thiên nhiên có hoạt tính sinh học đựơc dùng làm nguyên liệu cho công nghiệp dược phẩm làm thuốc chữa bệnh, công nghiệp thực phẩm, hương liệu mỹ phẩm… Thảo dược nguồn nguyên liệu trực tiếp chất dẫn đường để tìm kiếm loại biệt dược Theo số liệu thống kê cho thấy có khoảng 60% loại thuốc lưu hành giai đoạn thử nghiệm có nguồn gốc từ hợp chất thiên nhiên [5] Hơn nữa, Việt Nam sắn dây trở nên quen thuộc người Hiện nay, ngồi xuất hoang dại sắn dây biết tới trồng hữu ích vườn nhà Sản phẩm chế biến từ sắn dây sử dụng rộng rãi với mục đích khác nhau, việc tìm hiểu thành phần hợp chất có cịn câu hỏi thú vị Chính chúng tơi chọn đề tài: “ Tách xác định cấu trúc hợp chất Rutin thân sắn dây ” từ góp phần xác định thành phần hố học hợp chất tìm nguồn nguyên liệu cho ngành thực phẩm chức Nhiệm vụ nghiên cứu Trong luận văn này, chúng tơi có nhiệm vụ: - Chiết chọn lọc với dung mơi thích hợp để thu hỗn hợp hợp chất từ sắn dây (Pueraria lobata Willd.) - Phân lập xác định cấu trúc hợp chất từ sắn dây Đối tƣợng nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu dịch chiết sắn dây (Pueraria lobata Willd.) thuộc họ Đậu (Fabaceae) Việt Nam Chƣơng TỔNG QUAN 1.1 Chi Pueraria Peraria DC chi nhỏ, gồm loài dây leo quấn, phân bố chủ yếu vùng nhiệt đới cận nhiệt đới châu Á (16 loài); Việt Nam có lồi Một số lồi có rễ củ, nhiều tinh bột dùng làm thực phẩm hay làm thuốc; vài lồi khác có tác dụng phủ đất, lấy làm thức ăn cho gia súc Cá biệt có lồi P.tuberosa (Roxb.ex Willd.) DC mọc Neepan, Pakistan Ấn Độ, rễ củ có độc, thường dùng để duốc cá 1.1.1 Đặc điểm thực vật 1.1.1.1 Phân loại phân bố Cây sắn dây (P montana var lobata), sắn dây nhiệt đới (P phaseoloides) dạng tương quan phân loại chi Pueraria thuộc họ Đậu (Leguminosae) Hiện có khoảng 15 lồi phân loại trực giác mục: mục Nonnudiflorae Maesen, Pulcherrima Maesen, Schizophyllon Baker Ngồi ra, cịn có số loại khác Mỗi loại có lồi phụ như: P.candollei có loại, P.montana P.phaseoloides loại có lồi phụ….Chi Pueraria lồi phân tán qua Trung Quốc, Nhật Bản, phía Nam, phía Đơng châu Á, số Oceania Bảng 1.1: Bảng phân bố địa lý loài chi Pueraria Khu vực phân bố Các loài Pueraria P aplopecuroides Trung Quốc, Vân Nam, Myanma, Thái Lan P bella Ấn Độ, Myanma P calycina Trung Quốc, Vân Nam P.candollei var.candollei Banglades, Ấn Độ ,Myanmar, Thái Lan var mirifica Myanma, Thái Lan P.edulis Butan , Trung Quốc, Vân Nam, Ấn Độ P.imbricata Lào, Thái Lan P.lacei Myanma P.montan var.chinensis Butan, Trung Quốc, Đông Bắc Ấn Độ, Lào var.lobata Butan, Trung Quốc, Đông Bắc Ấn Độ, Lào, Philippin, var.montana Việt Nam,Australia,Châu Đại Dương, số khu vực nhiệt đới… P peduncularis Butan, Trung Quốc, Vân Nam, Tứ Xuyên, Ấn Độ, phía đơng Himalaya, đồi Khasi, Myanmar, Pakistan P phaseoloides var javanica Brunây, Indonesia, Malaysia, Philippin, quần đảo Solomon, số nước vùng nhiệt đới var phaseoloides Đông Nam Á, New Guinea, Châu Phi Nam Mỹ var subspicata Banglades, Butan, Đông Bắc Ấn Độ, Thái Lan P pulcherrima Đông Indonesia, Philippin, đảo Kei, đảo Solomon P sikkimensis Butan, Ấn Độ… P stricta Trung Quốc, Vân Nam, Myanma, Thái Lan P tuberosa Trung Quốc, Nepal, Pakistan P wallichii Banglades, Trung Quốc, Vân Nam, Ấn Độ, phía đơng Hymalia… 1.1.1.2 Đặc điểm sinh thái Hầu tất loài chi Pueraria mệnh danh “những người leo trồng tài giỏi”, vài loại có rễ củ Thân thon dài, lên tới 20m, mọc đối, hoa mọc thành chùm từ nách thường dài 3040cm, hoa có màu thay đổi từ trắng đến xanh màu đỏ tía Những lồi chi Pueraria lâu năm P montana var lobata sinh sản từ hạt giống, cắt đoạn thân già Những hạt giống thông thường gieo trồng mùa xuân phát triển từ 4-6 10 tháng Cây sắn dây tăng trưởng 30cm/1 ngày đạt tới 18-30m/1 mùa Một số loại sắn dây hay sắn dây nhiệt đới…thì có củ Rễ sắn dây lan truyền theo chiều ngang chiều sâu tới 1m Những chổ lồi lên từ gốc có hình dạng béo, lớn bên chứa nhiều tinh bột dự trữ qua mùa đơng góp phần hỗ trợ tăng trưởng mua xuân Đa số lồi chi Pueraria thích nghi với vùng gió mùa, nơi có trận mưa, ưa ánh sáng Chúng tìm thấy mép rừng, rừng nhiệt đới bụi rậm Chúng thường quấn quanh bụi rậm P.phaseoloides thích hợp với khí hậu ẩm ướt trận mưa Một hệ rễ rộng lớn cho phép chúng chống cự với thời tiết khô hạn thời gian ngắn thời kì nạn lụt Nói chung, tùy lồi chi Pueraria khác mà có yêu cầu khí hậu dẫn đến nơi sồng phân bố có khác 1.1.2 Thành phần hóa học Các loài chi Pueraria biết đến loại thuốc tiếng Phương Đông Bằng phương pháp phân tích cực phổ, sắc kí… người ta tìm thấy có chứa chất : Polyphenol glycosit polyphenolic, isoflavone…trong isoflavones glycosit phần thử thiết yếu mang hoạt tính sinh học cao Hoạt tính sinh học Pueraria qui định có mặt isoflavon glycosit chúng Khi phân thích isoflavones sắc kí cột silisdioxit cho daidzein, daidzin, puerarin, genistein, formononetin, biochamin, glycosit có thay đổi bọc đường…( Bảng 1.2 _ sơ đồ cấu trúc isoflavone glycosit isoflavonoid từ Pueraria lobata) R3 R2O O R1 1' O 3' R4 4' OR5 43 Hình 3.9.Phổ DEPT hợp chất 54 44 Hình 3.10.Phổ DEPT hợp chất 54 45 Hình 3.11.Phổ HMBC hợp chất 54 46 Hình 3.12.Phổ HMBC hợp chất 54 47 Hình 3.12.Phổ HMBC hợp chất 54 48 Hình 3.13.Phổ HMBC hợp chất 54 49 Hình 3.14.Phổ HSQC hợp chất 54 50 Hình 3.15.Phổ HSQC hợp chất 54 51 Hình 3.16.Phổ HSQC hợp chất 54 52 Hình 3.18.Phổ COSY hợp chất 54 Hình 3.18.Phổ COSY hợp chất 54 53 Hình 3.20.Phổ mơ 1H-NMR hợp chất 54 54 Hình 3.20.Phổ mô 13C-NMR hợp chất 54 55 KẾT LUẬN Nghiên cứu thành phần hóa học thân sắn dây (Pueraria lobata Willd.) thành phố Vinh, Nghệ An thu số kết sau: Bằng phương pháp ngâm chiết với dung môi chọn lọc cất thu hồi dung môi thu cao tương ứng cao etylaxetat (267g), cao butanol (192 g), cao hexan (38 g), pha nước Phân lập hợp chất từ cao butanol phương pháp sắc ký kết tinh phân đoạn thu hợp chất A (54) Đã tiến hành sử dụng phương pháp phổ khối lượng (EI-MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR, 13C-NMR DEPT, HMBC HSQC, để xác định cấu trúc hợp chất tách Từ liệu phổ cho phép khẳng định chất 54 rutin Rutin có tác dụng tăng cường sức chịu đựng sức bền thành mạch mao mạch, làm cho thành mạch dẻo đàn hồi hơn, tăng tính thẩm thấu, phịng ngừa nguy giịn đứt, vỡ mạch 56 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Nguyễn Tiến Bân (Chủ biên) (2003) Danh mục loài thực vật Việt Nam Nhà xuất Nông nghiệp, Hà Nội Nguyễn Tiến Bân (2000), Họ Na (Annonaceae), Thực vật chí Việt Nam, Flora of Vietnam, Nhà xuất Khoa học kỹ thuật, Hà Nội Vũ Văn Chuyên, Lê Trần Chấn, Trần Hợp (1987), Địa lý họ Việt Nam, Nhà xuất Khoa học kỹ thuật, Hà Nội Nguyễn Thượng Dong cộng (2006) Nghiên cứu thuốc từ thảo dược Nhà xuất Khoa học kỹ thuật, Hà Nội Trần Đình Đại (1998) Khái quát hệ thực vật Việt Nam Hội thảo Việt-Đức hóa học hợp chất thiên nhiên Hà Nội, 16-18 April, tr17-27 Nguyễn Văn Đàn, Nguyễn Viết Tựu (1985) Phương pháp nghiên cứu hóa học thuốc Nhà xuất Y học, Hà Nội Phạm Hoàng Hộ (1992) Cây cỏ Việt Nam Montreal Đào Hữu Vinh, Nguyễn Xuân Dũng, Trần Thị Mỹ Kinh, Phạm Hùng Việt (1985) Các phương pháp sắc kỹ Nhà xuất Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội Cây thuốc động vật làm thuốc Việt Nam (Tập 2) Nhà xuất Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội 10 Hoàng Trọng Quang, Nguyễn Thị Kim Liên Dược điển Nhà xuất Khoa học- Hội đồng Dược diển 57 Tiếng Anh 11 Arao T., Kinjo, J., Nohara T and Isobe R (1995), Oleanene-type triterpene glycosides from Puerariae radix II Isolation of saponins and the application of tandem mass spectrometry to their structure determination Chem Pharm Bull., 43, 1176–1179 12 Dictionary of Natural product on CD-Rom, Chapman and Hall-CRC (2005) 13 Fedoreyev S.A., Bulgakov V.P., Grishchenko O.V., Veselova M.V., Krivoschekova O E., Kulesh N I., Denisenko V.A., Tchernoded G.K., Zhuravlev Y.N (2008), Isoflavonoid composition of a callus culture of the relict tree Maackia amurensis Rupr et Maxim J Agric Food Chem 56(16) 7023-31 14 Kim JM, Lee YM, Lee GY, Jang DS, Bae KH, Kim JS (2006), Constituents of the roots of Pueraria lobata inhibit formation of advanced glycation end products (AGEs), Arch Pharm Res., 29 (10) 821-825 15 Kinjo, J., Furusawa J., Baba J., Takeshita T., Yamasaki, M and Nohara, T (1987), Studies on the constituents of Pueraria lobata III Isoflavonoids and related compounds in the roots and the voluble 16 stems Chem Pharm Bull., 35, 4846–4850 Prasain J.K., Reppert A., Jones K., Moore D.R., Barnes S., Lila M.A (2007), Identification of isoflavone glycosides in Pueraria lobata cultures by tandem mass spectrometry, Phytochem Anal 18(1) 50-9 17 WHO monographs on selected medicinal plants (Volume 1) World Health Organization Geneva 1999 18 Wing Ming Keugn (2002) The genus pueraria, Harvard Medical School, Boston, USA First published 2002 19 Lee J H., Ku C H., Baek N I., Kim S H., Park H W and Kim D K (2004), Phytochemical constituents from Diodia teres, Arch Pharm Res., 27(1), pp 40-43 ...2 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC VINH TÁCH VÀ XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC HỢP CHẤT RUTIN TỪ THÂN VÀ LÁ CÂY SẮN DÂY (PUERARIA LOBATA WILLD) Ở VIỆT NAM Chuyên ngành: Hoá thực phẩm... thích hợp để thu hỗn hợp hợp chất từ sắn dây (Pueraria lobata Willd.) - Phân lập xác định cấu trúc hợp chất từ sắn dây Đối tƣợng nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu dịch chiết sắn dây (Pueraria lobata. .. tìm hiểu thành phần hợp chất có cịn câu hỏi thú vị Chính chọn đề tài: “ Tách xác định cấu trúc hợp chất Rutin thân sắn dây ” từ góp phần xác định thành phần hoá học hợp chất tìm nguồn nguyên liệu