Bài viết Nghiên cứu quy trình lưu trữ Hà thủ ô trắng (Streptocaulon juventas lour.) in vitro bằng phương pháp hạt nhân tạo được tiến hành nhằm mục tiêu bảo tồn cây dược liệu quý hiếm bằng phương pháp tạo hạt nhân tạo góp phần lưu giữ được các giống dược liệu tiềm năng. Mời các bạn cùng tham khảo!
NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH LƢU TRỮ HÀ THỦ Ơ TRẮNG (Streptocaulon juventas Lour.) IN VITRO BẰNG PHƢƠNG PHÁP HẠT NHÂN TẠO Lê Phan Đình Q, Nguyễn Phạm Tuấn, Nguyễn Cơng Kha, Nguyễn Hoài Vững, Nguyễn Ngọc Giàu, Lâm Bảo Nhƣ Phƣơng, Nguyễn Thị Thu Trang Trung tâm Công nghệ Sinh học Tỉnh An Giang TÓM TẮT Nghiên cứu ―Nghiên cứu quy trình lƣu trữ Hà thủ trắng (Streptocaulon juventas lour.) in vitro phƣơng pháp hạt nhân tạo‖ tiến hành nhằm mục tiêu bảo tồn dược liệu quý phương pháp tạo hạt nhân tạo góp phần lưu giữ giống dược liệu tiềm Kết thực đạt sau: môi trường tạo hạt nhân tạo thích hợp với Hà thủ trắng Na-Algiante; giá thể thích hợp cho nảy mầm hạt nhân tạo Hà thủ ô trắng môi trường MS bổ sung 0,5 mg/L BA Hạt nhân tạo Hà thủ trắng có khả nảy mầm phát triển sau 2, tháng lưu trữ Kết nghiên cứu cho thấy, hạt nhân tạo cơng cụ thích hợp cho mở rộng sản xuất quy mô lớn phục vụ thương mại, tiết kiệm chi phí, khơng gian, mơi trường thời gian, dễ dàng xử lý, gieo trồng vận chuyển so với phương pháp truyền thống Từ khóa: Hà thủ ô trắng, hạt nhân tạo, lưu trữ, MS, nẩy mầm GIỚI THIỆU Hiện nay, với tiến công nghệ nuôi cấy in vitro, tái sinh thành hồn chỉnh từ phơi vơ tính mở rộng phạm vi ứng dụng cho việc tạo hạt nhân tạo (Gray et al., 1991) [1] Hạt nhân tạo xem phương pháp hiệu rút ngắn thời gian số trồng quan trọng mặt thương mại, nhiều tiềm cho sản xuất quy mô lớn với chi phí thấp để thay cho hạt thật Một hạt nhân tạo tạo thành tương tự hạt giống thật bao gồm phơi soma (giai đoạn hình tim hình thuỷ lơi) bao quanh lớp phôi nhũ nhân tạo Thuận lợi hạt nhân tạo tạo dịng vơ tính tạo hạt giống tương tự có đặc tính mẹ; góp phần bảo tồn lồi thực vật quý đảm bảo trì đa dạng sinh học tạo đồng thu hoạch loại nơng nghiệp quan trọng Ngồi ra, dễ dàng xử lý, có tiềm lưu trữ lâu dài giảm chi phí sản xuất nhân giống (Rihan et al., 2011) [2] Ngày nay, hạt nhân tạo hình viên nang với lớp vỏ gel không chứa phôi soma mà chồi nách, chồi thân rễ Các lớp bảo vệ mẫu cấy tránh bị tổn thương trình xử lý cho phép nảy mầm, chuyển đổi mà không gây biến đổi (Pennycooke et al., 2001) [3] Chúng giống hạt thật nảy mầm thành điều kiện thích hợp Công nghệ nuôi cấy in vitro ứng dụng thành công hạt nhân tạo nhiều loại thực vật Ngũ trảo, nho, cỏ mực, gừng, cam,…Từ lâu, dược liệu có khả hỗ trợ điều trị bệnh nưới, nhiên dược liệu ngày khai thác mức giống quý Vì dẫn đến cạn kiệt nguồn tài nguyên, số giống dược liệu địa đứng trước tình trạng báo động, số loài đưa vào sách đỏ Việt Nam Trước tình hình báo động khẩn cấp, cần hướng giải mang tính bền vững, lâu dài bảo tồn giống dược liệu địa phương Xuất phát từ thực tế đó, nghiên cứu ―Nghiên cứu quy trình lƣu trữ Hà thủ trắng (Streptocaulon juventas Lour.) in vitro phƣơng pháp hạt nhân tạo‖ thực 674 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nguyên vật liệu Hà thủ ô trắng (Streptocaulon juventas (Lour.) lưu giữ Trung tâm Công nghệ Sinh học An Giang Hóa chất: Sodium alginate, ethanol 70%, BA, NAA ,… Dụng cụ thiết bị: Nồi hấp khử trùng, cân phân tích, micropippet, tủ cấy,… dụng cụ thiết bị cần thiết khác 2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu 2.2.1 Khảo sát ảnh hưởng môi trường hạt nhân tạo * Mục tiêu: Xác định mơi trường thích hợp tạo vỏ hạt nhân tạo * Tiến hành: Cắt đoạn mẫu thành đốt riêng lẻ, cho tất mẫu vừa cắt xong vào dung dịch NaAlginate (đối chứng, b sung MS, ẵ MS v ẳ MS), sau ú khuấy nhẹ Dùng pipette nhựa hút giọt dung dịch trên, giọt chứa mẫu Sau nhỏ vào dung dịch 100 mM CaCl2.2H2O, chuyển qua máy lắc lắc vòng 30 phút Khi hạt nhân tạo hình thành gạn bỏ nước rửa hạt nước cất vô trùng – lần để loại bỏ dung dịch CaCl2.2H2O bám bề mặt Nghiệm thức lặp lại: lần/giống Số bình nghiệm thức: bình/giống Số hạt bình: hạt; Tổng số bình: 12/giống; Tổng số hạt: 48/giống Trữ lạnh 4oC, bóng tối * Chỉ tiêu khảo sát: Tỷ lệ nảy mầm hạt nhân tạo mơi trường MS * Thời gian thí nghiệm: Sau tuần, tuần lưu trữ cấy chuyển vào môi trường MS xem tỉ lệ nảy mầm hạt nhân tạo 2.2.2 Khảo sát nảy mầm hạt nhân tạo giá thể khác * Mục tiêu: Xác định giá thể cho hạt nhân tạo nảy mầm tốt * Tiến hành: Cắt đoạn mẫu thành đốt riêng lẻ, cho tất mẫu vừa cắt xong vào dung dịch NaAlginate + môi trường tối ưu từ nội dung 2.2.1 khuấy nhẹ Dùng pipette nhựa hút giọt dung dịch trên, giọt chứa mẫu Sau nhỏ vào dung dịch 100 mM CaCl2.2H2O, chuyển qua máy lắc lắc vịng 30 phút Khi hạt nhân tạo hình thành gạn bỏ nước rửa hạt nước cất vô trùng - lần để loại bỏ dung dịch CaCl2.2H2O bám bề mặt Nghiệm thức lặp lại: lần/giống; Số bình nghiệm thức: bình/giống Số hạt bình: hạt; Tổng số bình: 12/giống; Tổng số hạt: 48/giống; Trữ lạnh 4oC, bóng tối * Chỉ tiêu khảo sát: Tỷ lệ nảy mầm hạt nhân tạo giá thể khác * Thời gian thí nghiệm: Sau tuần, tuần lưu trữ cấy chuyển lên giá thể khác xem tỷ lệ nảy mầm hạt nhân tạo 2.2.3 Khảo sát thời gian thích hợp cho lưu trữ hạt nhân tạo * Mục tiêu: Xác định thời gian tối ưu để lưu trữ hạt nhân tạo * Tiến hành: Mơi trường tạo hạt nhân Na-Alginate, sau hạt trữ lạnh 4oC bóng tối Sau thời gian lưu trữ, hạt nhân tạo cấy lên giá thể để khảo sát nảy mầm sau thời gian lưu trữ 675 Thực lưu trữ bình, bình 10 hạt Sau thời gian lưu trữ lấy bình để cấy chuyển sang mơi trường thạch MS + 0,5 mg/L BA để khảo sát tỉ lệ nảy mầm hạt Nghiệm thức lặp lại: lần/giống; Số hạt bình: 10 hạt Tổng số bình: bình; Tổng số hạt: 30 hạt; Trữ lạnh 4oC, bóng tối * Chỉ tiêu khảo sát: Tỷ lệ nảy mầm hạt nhân tạo sau thời gian lưu trữ * Thời gian thí nghiệm: Làm theo định kỳ sau 2, 3, tháng tồn trữ cấy chuyền lên giá thể thích hợp xem tỷ lệ nảy mầm hạt nhân tạo 2.3 Phƣơng pháp thống kê Các số liệu thí nghiệm xử lý thống kê phần mềm Ecxel Statgraphics plus 16.0 Kiểm tra khác biệt trung bình nghiệm thức theo phép thử LSD Duncan KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Khảo sát ảnh hƣởng môi trƣờng hạt nhân tạo Mục tiêu nghiên cứu hạt nhân tạo tạo cấu trúc hạt giống hạt truyền thống có đặc điểm dễ xử lý, lưu trữ, tăng khả sống sót mức độ nảy mầm (Ara et al., 2000) [4] Sau tuần lưu trữ hầu hết hạt nảy mầm, chồi hình thành phát triển tốt, tỷ lệ nảy mầm hạt nhân tạo Hà thủ ô trắng đạt tỷ lệ cao 90% không khác biệt nghiệm thức Nghiệm thức có NaAlginate hạt sau nảy mầm có số chồi cao đạt trung bình 7,33 khác biệt khơng ý nghĩa nghiệm thức có Na-Alginate bổ sung ¼ MS đạt trung bình 7,0 chồi Nghiệm thức có Na-Alginate bổ sung MS nghiệm thức có Na-Alginate bổ sung ½ MS có số chồi trung bình 5,67 6,33 thấp so với nghiệm thức (Bảng 3) Bảng Ảnh hưởng môi trường tạo hạt nhân tạo Hà thủ ô trắng Nghiệm thức Sau tuần lƣu trữ Môi trƣờng Sau tuần lƣu trữ Tỷ lệ nảy mầm (%) Số chồi Tỷ lệ nảy mầm (%) Số chồi 100a 7,33a 100a 7,33a 91,67a 5,67b 91,67a 5,00b Na-Alginate Na-Alginate + MS Na-Alginate + ½ MS 100a 6,33ab 50,00b 3,33c Na-Alginate + ¼ MS 100a 7,0a 41,67b 2,33c Các giá trị có mũ có mẫu tự khác biệt khơng có ý nghĩa thống kê với độ tin cậy 95% Hình Sự nảy mầm hạt nhân tạo Hà thủ ô trắng môi trường tạo hạt khác sau tuần lưu trữ: (a) Alginate; (b) Alginate + MS; (c) Alginate + ½ MS; (d) Alginate + ¼ MS 676 Hình Sự nảy mầm hạt nhân tạo Hà thủ ô trắng môi trường tạo hạt khác sau tuần lưu trữ: (a) Alginate; (b) Alginate+MS; (c) Alginate+½ MS; (d) Alginate+¼ MS Sau tuần lưu trữ, kết cho thấy môi trường tạo hạt ảnh hưởng đến khả nảy mầm hạt nhân tạo Hà thủ ô trắng sau lưu trữ, tốc độ nảy mầm hạt chậm so với sau tuần lưu trữ, tỷ lệ chết tăng Nghiệm thức có Na-Alginate có tỷ lệ nảy mầm đạt 100%, khác biệt khơng ý nghĩa so với nghiệm thức có Na-Algiante bổ sung MS tỷ lệ nảy mầm đạt 91,67% Nghiệm thức cho thấy khả nảy mầm hạt bị giảm sau thời gian lưu trữ đạt tỷ lệ 50,0% 41,67% khác biệt có ý nghĩa so với nghiệm thức Đối với số chồi hình thành sau nảy mầm hạt nhân tạo, nghiệm thức có số chồi trung bình đạt 7,33 khác biệt có ý nghĩa so với nghiệm thức lại Số chồi nghiệm thức giảm dần từ nghiệm thức trung bình 5,00 chồi, nghiệm thức đạt trung bình 3,33 chồi nghiệm thức đạt trung bình 2,33 chồi (Hình 2) Nhiều nghiên cứu cho thấy mơi trường Na-Alginate phù hợp cho tạo hạt nhân tạo nhiều loại Ba gạc bốn (Rauvolfia tetraphylla L.) (Faisal et al., 2006) [5], lựu (Punica granatum L.) (Naik and Chand, 2006) [6], ngải cứu (Artemisia vulgaris) (Sujatha and Kumari, 2008) [7] Như vậy, môi trường Na-Alginate thích hợp cho tạo hạt nhân tạo Hà thủ ô trắng 3.2 Khảo sát nảy mầm hạt nhân tạo giá thể khác Việc bổ sung chất điều hòa sinh trưởng chất dinh dưỡng cho hạt yếu tố cần thiết cho thành công kỹ thuật tạo hạt nhân tạo, tăng khả nảy mầm sống sót cho hạt (Rihan et al., 2017) [8] Các hormone kích thích tăng có tác dụng đến nảy mầm hạt nhân tạo Hà thủ ô trắng Sau tuần lưu trữ tỷ lệ nảy mầm hạt cao 90% không khác biệt mặt ý nghĩa thống kê Tuy nhiên, khác biệt số chồi tạo hạt sau nảy mầm, nghiệm thức có giá thể mơi trường MS bổ sung 0,5 mg/L BA giúp cho hạt nảy mầm tốt, tạo nhiều chồi cao, to khỏe với trung bình 6,0 chồi khác biệt có ý nghĩa thống kê so với nghiệm thức lại Kế đến nghiệm thức có giá thể mơi trường MS tạo số chồi trung bình 4,67 chồi, khác biệt có ý nghĩa so với nghiệm thức (Bảng 4) Đối với nghiệm thức có giá thể môi trường MS bổ sung 0,5 mg/L NAA nghiệm thức có giá thể mơi trường MS bổ sung 0,5 mg/L BA 0,5 mg/L NAA tác dụng kích thích chồi nhiều nghiệm thức 2, hạt nảy mầm giá thể xanh tươi, phát triển nhiên có tượng phát triển thành cụm mô sẹo (callus), số hạt tạo chồi số chồi trung bình tạo nghiệm thức thấp so với nghiệm thức và khác biệt có ý nghĩa thống kê Tương tự, sau tuần lưu trữ hạt nhân tạo có khả phát triển tốt nghiệm thức có giá thể mơi trường MS có bổ sung 0,5 mg/L BA đạt số chồi trung bình 6,33 chồi khác biệt có ý nghĩa thống kê so với nghiệm thức lại Như vậy, nghiệm thức giá thể có mơi trường MS có bổ sung 0,5 mg/L BA thích hợp cho nảy mầm phát triển hạt nhân tạo Hà thủ ô trắng 677 Bảng Ảnh hưởng giá thể khác lên nảy mầm hạt Hà thủ ô trắng Sau tuần lƣu trữ Nghiệm thức Môi trƣờng Sau tuần lƣu trữ Tỷ lệ nảy mầm (%) Số chồi Tỷ lệ nảy mầm (%) Số chồi 91,67a 4,67b 75,00a 3,67b MS MS + 0,5mg/L BA 100a 6,0a 91,67a 6,33a MS + 0,5 mg/L NAA 100a 1,33d 66,67a 1,33c MS + 0,5 mg/L BA + 0,5 mg/L NAA 100a 2,67c 91,67a 2,67bc Các giá trị có mũ có mẫu tự khác biệt khơng có ý nghĩa thống kê với độ tin cậy 95% Hình Sự nảy mầm hạt nhân tạo Hà thủ ô trắng loại giá thể khác sau tuần lưu trữ: (a) MS; (b) MS + 0,5 mg/L BA; (c) MS + 0,5 mg/L NAA; (d) MS + 0,5 mg/L BA + 0,5 mg/L NAA Hình Sự nảy mầm hạt nhân tạo Hà thủ ô trắng loại giá thể khác sau tuần lưu trữ: a(a) MS; (b) MS + 0,5 mg/L BA; (c) MS + 0,5 mg/L NAA; (d) MS + 0,5 mg/L BA + 0,5 mg/L NAA 3.3 Khảo sát thời gian thích hợp cho lƣu trữ hạt nhân tạo Thời gian lưu trữ hạt yếu quan trọng ảnh hưởng đến nảy mầm hạt sau thời gian lưu trữ Các hạt nhân tạo Hà thủ trắng cho thấy có khả nảy mầm tối đa sau tháng lưu trữ nhiệt độ 4oC bóng tối (Bảng Hình 5) Sau tháng lưu trữ khả nảy mầm hạt giảm so với nội dung thực sau tuần lưu trữ, tỷ lệ nảy mầm hạt đạt 73,33%, số chồi trung bình tạo thành đạt 13,67 chồi khác biệt có ý nghĩa thống kê so với sau tháng lưu trữ Sau tháng lưu trữ khả nảy mầm hạt giảm đáng kể xuống 40% số chồi trung bình đạt 6,67 chồi Cuối cùng, sau tháng lưu trữ khả nảy mầm hạt Hà thủ trắng giảm cịn 13,33% số chồi tạo thành có 1,33 chồi, thấp so với sau tháng tháng lưu trữ khác biệt có ý nghĩa thống kê Theo nghiên cứu hạt nhân tạo Hà thủ ô trắng cho thấy thời gian lưu trữ lâu so với nghiên cứu Ray Bhattacharya (2008) [9] thực Ba gạc (Rauvolvia serpentine) tháng lưu trữ 4oC Ngày có nghiên cứu bảo quản hạt nhân tạo kỹ thuật cần phải có nhiều nghiên cứu tiềm to lớn hạt nhân tạo dễ dàng lưu trữ nguồn gen tiết kiệm chi phí (Rihan et al., 2017) [8] 678 Bảng Ảnh hưởng thời gian lưu trữ lên nảy mầm hạt Hà thủ ô trắng Nghiệm thức Thời gian lƣu trữ Tỷ lệ nảy mầm Số chồi tháng 73,33a 13,67a tháng 40,00b 6,67b tháng 13,33c 1,33c Các giá trị có mũ có mẫu tự khác biệt khơng có ý nghĩa thống kê với độ tin cậy 95% Hình Sự nảy mầm hạt nhân tạo Hà thủ ô trắng sau thời gian lưu trữ: (a) tháng; (b) tháng; (c) tháng KẾT LUẬN – Môi trường tạo hạt nhân tạo thích hợp với Hà thủ trắng Na-Algiante sau tuần lưu trữ tỷ lệ hạt nảy mầm 100% số chồi trung bình tạo thành 7,33 – Giá thể thích hợp cho nảy mầm hạt nhân tạo Hà thủ ô trắng môi trường MS bổ sung 0,5 mg/L BA sau tuần lưu trữ tỷ lệ hạt nảy mầm 100% 91,67%; số chồi trung bình tạo thành 6,0 6,33 – Hạt nhân tạo loại dược liệu có khả nảy mầm phát triển sau thời gian lưu trữ Hạt nhân tạo Hà thủ ô trắng sau 2, tháng lưu trữ với tỷ lệ hạt nảy mầm tương ứng 73,33; 40,0 13,33%; số chồi trung bình tạo thành tương ứng 13,67; 6,67 1,33 LỜI CẢM ƠN Xin chân thành cảm ơn thành viên Trung tâm Công nghệ sinh học tỉnh An Giang Sở Khoa học Công nghệ An Giang tạo điều kiện hỗ trợ để thực nghiên cứu TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Gray, D.J.; Purohit, A.; Triglano, R.N (1991) Somatic embryogenesis and development of synthetic seed technology Crit Rev Plant Sci 10, 33–61 [2] Rihan, H.Z.; Al-Issawi, M.; Burchett, S.; Fuller, M.P (2011) Encapsulation of cauliflower (Brassica oleracea var botrytis) microshoots as artificial seeds and their conversion and growth in commercial substrates Plant Cell Tissue Organ Cult., 107, 243–250 [3] Pennycooke, J.C.; Towill, L.E (2001) Medium alterations improve regrowth of sweet potato (Ipomoea batatas (L.) Lam.) shoot tips cryopreserved by vitrification and encapsulationdehydration Cryoletters, 22, 381–389 [4] Ara, H.; Jaiswal, U.; Jaiswal, V (2000) Synthetic seed: Prospects and limitation Curr Sci, 78: 1438–1444 679 [5] Faisal, M.; Ahmad, N.; Anis, M (2006) In vitro plant regeneration from alginateencapsulated microcuttings of Rauvolfia tetraphylla L Am Eurasian J.1: 1–6 [6] Naik, S.K.; Chand, P.K (2006) Nutrient-alginate encapsulation of in vitro nodal segments of pomegranate (Punica granatum L.) for germplasm distribution and exchange Sci Hortic, 108, 247–252 [7] Sujatha, G.; Kumari, B.D.R (2008) Micropropagation, encapsulation and growth of Artemisia vulgaris node explants for germplasm preservation S.Afr.J.Bot, 74, 93–100 [8] Hail Z Rihan, Fakhriya Kareem, Mohammed E El-Mahrouk and Michael P Fuller (2017) Artificial seeds (principle, aspects and applications) Agronomy, 15, 71-86 [9] Ray, A and Bhattacharya, S (2008) Storage and plant regeneration from encapsulated shoot tips of Rauvolfia serpentine—An effective way of conservation and mass propagation S Afr J Bot 74: 776–779 680 ... mầm hạt nhân tạo Hà thủ ô trắng môi trường tạo hạt khác sau tuần lưu trữ: (a) Alginate; (b) Alginate + MS; (c) Alginate + ½ MS; (d) Alginate + ¼ MS 676 Hình Sự nảy mầm hạt nhân tạo Hà thủ ô trắng. .. mầm hạt nhân tạo 2.2.3 Khảo sát thời gian thích hợp cho lưu trữ hạt nhân tạo * Mục tiêu: Xác định thời gian tối ưu để lưu trữ hạt nhân tạo * Tiến hành: Môi trường tạo hạt nhân Na-Alginate, sau hạt. .. cho lƣu trữ hạt nhân tạo Thời gian lưu trữ hạt yếu quan trọng ảnh hưởng đến nảy mầm hạt sau thời gian lưu trữ Các hạt nhân tạo Hà thủ trắng cho thấy có khả nảy mầm tối đa sau tháng lưu trữ nhiệt