Tiểu luận Khảo sát sơ bộ các nhóm chất hữu cơ có trong phong lữ thảo

1 TIỂU LUẬN NGHIÊN CỨU Khảo sát sơ nhóm chất hữu có Phong lữ thảo MỤC LỤC SƠ ĐỒ THIẾT KẾ NGHIÊN CỨU Gồm nghiên cứu mô tả cắt ngang nghiên cứu thử nghiệm thể qua sơ đồ thiết kế nghiên cứu sau: Thẩm định tên khoa học Phong lữ thảoThu hái, chế biến, bảo quản dược liệu Phong lữ thảo Thu thập bọ gậyvà muỗi Ae.aegypti Trứng muỗi Khảo sát sơ nhóm chất hữu thân, phong lữ thảo Bọ gậy Điều chế cao cồn 96%, cao phân đoạn (n-hexan, ethyl acetat, nước) cao cồn 96%, cất tinh dầu tổng hợp thân, Phong lữ thảo Muỗi trưởng thành F1 Thử tác dụng xua với muỗi Ae.aegypti Đánh giá tác dụng xua muỗi Chiết xuất, phân lập xác định cấu trúc số hợp chất từ mẫu thử có tác dụng xua muỗi Sơ đồ 2.3: thiết kế nghiên cứu CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH NGHIÊN CỨU  Nghiên cứu xác định thành phần hóa học Phong lữ thảo: - Thẩm định tên khoa học Phong lữ thảo - Thu hái, chế biến, bảo quản Phong lữ thảo - Khảo sát sơ nhóm chất hữu thân, phong lữ thảo - Điều chế cao cồn 96%, cao phân đoạn (n-hexan, ethyl acetat, nước) cao cồn 96%, cất tinh dầu tổng hợp thân, Phong lữ thảo - Phân lập xác định cấu trúc thành phần hóa học trongthân, láPhong lữ thảo  - Nghiên cứu đánh giá số tác dụng sinh học: Thử đánh giá tác dụng xua muỗi với mẫu thử điều chế từ thân, phong lữ thảo Thu thập bọ gậy Nuôi bọ gậy Nuôi muỗi trưởng thành Cho đẻ trứng Nuôi bọ gậy F1 Nuôi muỗi trưởng thành F1 bằng glucose 10 % Thử tác dụng xua muỗi với mẫu thử điều chế từ thân, phong lữ thảo PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 5 CHƯƠNG 1.1 Thẩm định tên khoa học - Quan sát mơ tả đặc điểm hình thái thực vật, điều kiện sinh trưởng phát triển Phong lữ thảo thực địa - Thu hái, làm tiêu mẫu lưu giữ tiêu Xác định tên khoa học sở phân tích đặc điểm hình thái thực vật, so sánh khóa phân loại thực vật chí Việt Nam, Trung Quốc hướng dẫn chuyên gia thực vật 1.2 Nghiên cứu thành phần hóa học 1.2.1 Khảo sát sơ nhóm chất hữu có Phong lữ thảo - Thực phản ứng định tính nhóm chất có dược liệu bằng phản ứng định tính ống nghiệm sắc ký lớp mỏng[1],theo sách Thực tập Dược liệu (phần định tính nhóm chất bằng phản ứng hóa học) – Bộ mơn Dược liệu – Trường ĐH Dược Hà Nội + Nhóm Alcanoid : Phản ứng với thuốc thử Mayer Phản ứng với thuốc thử Dragendorff Phản ứng với thuốc thử Bouchardat + Nhóm Flavonoid: Phản ứng với Cyanidin Phản ứng với NH3 Phản ứng với kiềm loãng Phản ứng với FeCl3 5% + Nhóm Saponin: Hiện tượng tạo bọt Phản ứng Liebermann Phản ứng Baljet Phản ứng Legal Phản ứng Keller – Kiliani + Nhóm Coumarin : Phản ứng mở đóng vịng lacton 6 + Nhóm Tanin : Phản ứng với FeCl3 5% Phản ứng chì acetat 10% + Nhóm Anthranoid: Phản ứng Borntrager + Nhóm Acid hữu cơ: Phản ứng với Na2CO3 + Nhóm đường khử: Phản ứng với thuốc thử Felling A B + Nhóm chất béo: vết mờ giấy lọc + Nhóm Sterol: Phản ứng Salkopski Phản ứng Liberman + Nhóm Caroten: Với H2SO4 đặc + Polysaccharid: với thuốc thử Lugol + Acid amin: Với thuốc thử Nihydrin + Định lượng tinh dầu: Dược liệu xác định độ ẩm Tinh dầu tách bằng phương pháp cất kéo nước, hàm lượng tinh dầu tính theo cơng thức sau: HLT.D(%)= Trong đó: a: số ml tinh dầu thu A: Khối lượng dược liệu đem định lượng X: Hàm ẩm dược liệu Kết xử lý theo phương pháp thống kê.[5] 1.2.2 Chiết xuất, phân lập hợp chất Phong lữ thảo - Chiết xuất hoạt chất dược liệu bằng cồn công nghiệp Cất thuhồi dung môi áp suất giảm thu cắn cồn toàn phần - Chiết xuất phân đoạn từ dịch chiết cồn toàn phần bằng dung mơi có độ phân cực tăng dần (n-Hexan, Ethyl acetat), thu phân đoạn tương ứng, tạo điều kiện thuận lợi cho trình phân lập chất 7 - Phân lập hợp chất mẫu cao dược liệu bằng sắc kí cột với chất hấp phụ silica gel, cỡ hạt 0,04 - 0,063mm sắc ký điều chế.Theo dõi phân đoạn bằng sắc kí lớp mỏng + SKLM thực mỏng tráng sẵn DC-Alufolien 60G F254(Merck) (silica gel, 0.25 mm) mỏng pha đảo RP-18 F 254 (Merck, 0,25 mm) Phát chất bằng đèn tử ngoại có hai bước sóng 254 nm 366 nm dùng thuốc thử dung dịch H2SO4 10% ethanol + Phân tích phân đoạn bằng SKLM để lựa chọn dung môi phù hợp cho việc phân tách chất bằng sắc ký cột + Sắc ký cột tiến hành với chất phụ silica gel pha thường (0,0400,063mm, Merck) vàsilica gel pha đảo YMC (30-50µm, FuJisilisa Chemical Ltd.) Theo dõi phân đoạn bằng SKLM - Xác định cấu trúc chất phân lập bằng việc phân tích đặc điểm hóa lý (cảm quan, nhiệt độ nóng chảy) dựa số liệu phổ: phổ hồng ngoại (IR), phổ tử ngoại (UV), phổ khối (MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) Phong lữ thảo (thân, lá) +Chiết lần với EtOH 96% + Cất thu hồi dung môi Cao tổng Bổ sung nước Lắc với n-hexan Bổ sung nước Cao n-hexan Dịch nước Lắc với EtOAc Cao nước Cao EtAc Chạy cột tinh chế Chất tinh khiết Sơ đồ 3.2:thiết kế nghiên cứu chiết xuất phân lập chất tinh khiết từ thân, củaPhong lữ thảo CHƯƠNG 2.1 Nghiên cứu thử tác dụng xua muỗi Aedes aegypti 2.1.1 Kỹ thuật thu thập muỗi bọ gậỵ  Kỹ thuật thu thập muỗi: -Tay phải cầm ống nghiệm, tay trái cầm đèn pin ( nơi sáng không cần đèn) nhẹ nhàng để muỗi khỏi bay Vừa vừu rọi đèn pin vào tường để soi muỗi Đèn thường cách tường 30cm, chiếu qua chiếu lại tránh kích thích ánh sáng trực tiếp vào muỗi Khi thấy muỗi, tay cầm ống nghiệm bằng ngón tay ngón úp nhanh ống nghiệm lên muỗi, theo phản xạ muỗi bay vào ống Lấy bơng để lên miệng ống.Mỗi ống nghiệm chừng 4-5 Khi miếng cuối cách miệng ống cm Ghi nhãn: Địa điểm bắt, thời gian bắt ( giờ, ngày, tháng), người bắt: -Vị trí bắt muỗi: + Tùy theo đặc điểm sinh lý, sinh thái: sinh địa cảnh, vật chủ thích hợp, nơi trú ẩn tiêu máu, nơi rình mồi để hút máu…của lồi muỗi mà xác định vị trí bắt muỗi + Thường tìm bắt muỗi nơi tối, ẩm ngầm giường, ngầm tủ, ngầm cầu thang, hay chuồng gia súc lùm rậm rạp quanh nhà, bờ rào, nơi kìn gió có nước + Có thể bắt muỗi muỗi nở từ quăng, muốn phải bắt từ 5-6 giờ, tìm bắt muỗi mặt nước vũng nước dụng cụ chứa nước -Dung mồi để bắt muỗi: + Mồi người: bắt muỗi nhà nhà, thường mồi nơi kín gió Người ngồi vén quần lên đầu gối, tay cầm đèn pin soi bắt muỗi + Mồi động vật: Mắc ván đan nhốt động vật vào lồng (khỉ, chuột…) đặt lồng vào vén lên cho muỗi bay vào đốt động vật Buông xuống bắt muỗi  Kỹ thuật thu thập bọ gậy: +Dùng đèn pin soi vào DCCN vợt bọ gậy Lật ngược vợt khay men có chứa nước sẵn để bắt Dùng ống hút để hút bọ gậy tập trung vào lọ Điều tra bọ gậy hốc cây, hốc đá khó dùng vợt dùng ống hút có bóp cao su dài Hút nước hốc ra, đổ vào khay men để tìm bọ gậy + Dùng vợt ống hút thu thập bọ gậy, lăng quăng tất DCCN nhà quanh nhà + Cho bọ gậy bắt vào bình nước - Kỹ thuật ni bọ gậy: + Cho bọ gậy vào bocan chứa nước, đặt lồng có phủ che + Cho thức ăn ni bọ gậy vào nước 10 + Chờ bọ gậy phát triển thành muỗi trưởng thành đẻ trứng, phát triển thành bọ gậy hệ F1, thành muỗi hệ F1 - Kỹ thuật nuôi muỗi: + Muỗi hệ F1 bắt cho vào lồng nuôi muỗi + Cho muỗi hút máu chuột nhắt trắng [3] 2.1.2 Kỹ thuật thử tác dụng xua - Kỹ thuật tiến hành: +Chuẩn bị muỗi: Muỗi (chọn muỗi dựa vào đặc điểm hình thể bên ngồi) khoẻ, đủ chân, cánh, bay bình thường, cho vào lồng để muỗi nơi yên tĩnh 30 phút + Bôi dược chất xua vào tay trái (từ cổ tay đến hết bàn ngón tay), thường có người: người theo dõi người thử + Người thử cho hai tay vào lồng muỗi, tay trái có thuốc, tay phải đối chứng ( khơng có thuốc) + Mỗi cho đậu vào tay ( kể tay có thuốc hay tay ko có thuốc) người thử nghiệm tung tay cho muỗi bay đi, người theo dõi đếm số muỗi đậu vào tay ghi vào sổ + Mỗi thử 15 phút, sau người muỗi nghỉ, tiếp tục muỗi đậu vào hai tay bằng thuốc hết tác dụng Trên thực địa, hai người thử, chân xoa thuốc ( xoa cổ chân mu ngón chân), chân đối chứng khơng xoa thuốc Khi có số muỗi đốt hai chân ngang thuốc hết tác dụng Để đánh giá tác dụng muỗi loại thuốc theo thử nghiệm, tính kết theo hệ số giảm đốt K (Gladkix S.G, 1964) K=×100 K: hệ số giảm đốt (%) a: số muỗi đậu vào tay, chân khơng có thuốc b: số muỗi đậu vào tay, chân có thuốc Nếu K = 100% : tác dụng thuốc xua muỗi tốt K ≥ 50% : có tác dụng xua muỗi K< 50% : khơng có tác dụng xua.[3] 2.6 PHƯƠNG PHÁP XỬ LÝ SỐ LIỆU 11 Các số liệu nghiên cứu xử lý thống kê theo phương pháp thống kê sinh học, sử dụng công cụ Data analysis Microsoft Excel - Kết thí nghiệm hiển thị bằng trị số trung bìnhcộng/trừ độ lệch - chuẩn (M ± SE) Đánh giá, so sánh thống kê lơ thí nghiệm bằng phương pháp T testStudent Sự khác có ý nghĩa thống kê p < 0,05 CHƯƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN 3.1 THẨM ĐỊNH TÊN KHOA HỌC - Tiến hành thu hái mẫu đầy đủ thông tin cây, hoa, lá, cành để giám định tên khoa học dược liệu nghiên cứu - Văn xác định tên khoa học 3.2 NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HĨA HỌC 3.2.1 Kết định tính nhóm chất hữu thân,lá Phong lữ thảo phản ứng hóa học 3.2.2 Các cao chiết xuất cồn 96% cao phân đoạn dịch chiết cồn 96% từ thân,lá Phong lữ thảo, tinh dầu tổng 3.2.3 Phân lập xác định cấu trúc sốhợp chất mẫu thử có tác dụng xua muỗi thân, lácây Phong lữ thảo 3.3 NGHIÊN CỨU VỀ TÁC DỤNG SINH HỌC - Thử tác dụng xua muỗi mẫu thử điều chế từthân, câyPhong lữthảo 3.4 BÀN LUẬN 3.4.1 Về việc chọn đề tài mục tiêu đề tài Phong lữ thảo có tên khoa học Pelargonium hortorum Bailey thuộc họ Mỏ hạc (Geraniaceae), theo tài liệu cho thấy nước ta Phong lữ thảo chưa nghiên cứu góc độ y học đại tác dụng dược lý thành phần hóa học khơng có ghi nhận ý số tính chất độc đáo Phong 12 lữ thảo khơng hoa đẹp lại làm mơi trường đất có kim loại nặng có tác dụng xua đuổi muỗi, làm thuốc trị viêm tai giữa…Nhu cầu đặt cần có nghiên cứu có giá trị khoa học để làm sáng tỏ thành phần hóa học, tác dụng sinh học giá trị sử dụng thuốc Kiểm soát muỗi vấn đề quan trọng thời đại ngày với số lượng ngày tăng bệnh truyền qua muỗi Trong lịch sử giới, nhiều người chết bệnh lây truyền qua muỗi tất chiến tranh.Bệnh sốt xuất huyết Dengua Việt Nam ngày gia tăng năm gần đây, vai trò truyền bệnh chủ yếu muỗiAedes aegypti Trong đó, vấn đề kiểm sốt phòng chống muỗi chứng minh hiệu cao phòng chống bệnh truyền qua muỗi.[15] Việc sử dụng dược chất chiết xuất từ thực vật thực có tác dụng phịng chống muỗi, chúng lại không độc cho người, động vật mơi trường Để góp phần phịng chống muỗi bệnh muỗi truyền tiến hành đề tài:“Nghiên cứu thành phần hóa học đánh giá tác dụng xua đuổi muỗi Aedes aegypticủa Phong lữ thảo (Pelargonium hortorum Bailey)” Để góp phần vào nghiên cứu sâu rộng thành phần hóa học tác dụng sinh học Phong lữ thảo 3.4.2 Về thẩm định tên khoa học Về tên khoa học:Phong lữ thảocó tên khoa học Pelargonium hortorum Bailey thuộc họ Mỏ hạc (Geraniaceae) Cây thường trồng với tên loài lai củaloài thứ Pelargonium zonale L’ Hérit Ex Soland vàloài thứ hai Pelargonium inquinans Ait.Từ hai loài trồng này, người ta tạo lồi lai có dạng màu lồi thứ nhất, có hoa gần với loại thứ hai, hoa gần liên tục mùa khơ Bây lai giống đến khó phân biệt gần gũi với tổ tiên Do , có nhiều nịi khác lai tạo.[2] 13 Tuy nhiên theo “ Từ điển thuốc Việt Nam” Võ Văn Chi đưa tên Phong lữ có tên khoa học Pelargonium hortorum Bailey thuộc họ Phong lữ (Geraniaceae) Các tài liệu tham khảo chủ yếu tài liệu lồi Pelargonium hortorum Bailey 3.4.3 Về hóa học - Về định tính: Sơ xác định nhóm hoạt chất có thân , Phong lữ thảobằng phương pháp hóa học [1] Ưu điểm phương pháp đơn giản, dễ thực hiện, cho kết nhanh - Điều chế mẫu thử để thử tác dụng xua muỗi từ làm sở để phân lập số hợp chất mẫu thử có tác dụng nhằm định hướng sau nghiên cứu sâu tạo sản phẩm ứng dụng xã hội 3.4.4 Về tác dụng sinh học - Kết hợpvới phần nghiên cứu hóa học để tìm kiếm phân đoạn có hoạt tính hợp chất từ phân đoạn có hoạt tính định hướng sở cho nghiên cứu ứng dụng sau KIẾN NGHỊ VỀ VIỆC NGHIÊN CỨU TIẾP THEO - Nghiên cứu quy trình phân lập chất tìm với hiệu suất cao Tiến hành thử tác dụng dược lý chất phân lập 14 Tiếp tục nghiên cứu xác định thành phần hóa học Phong lữ thảo - tiến hành thử tác dụng dược lý chất phân lập từ Phong lữ thảo - Nghiên cứu chiết xuất nhóm hoạt chất có tác dụng sinh học phối hợp với - số dược liệu để bào chế dạng cream xua đuổi côn trùng Nghiên cứu, chế tạo phương pháp pha chế thuốc, đo lường khả gây chết, tiến hành thí nghiệm hiệu diệt trừ côn trùng gây hại giai đoạn phát triển khác chúng, so sánh, đối chiếu với thuốc có tính xua đuổi côn trùng khác bán thị trường, THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU Kế hoạch triển khai 1.1 TT Thời gian 8/2015 - 10/2015 9/2015 - 01/2016 Nội dung công việc Dự kiến địa điểm nghiên cứu Viết đề cương bảo vệ -Trung tâm đào tạo đề cương nghiên cứu Dược, Học viện Quân y Trồng cây, chăm sóc, thu - Trung tâm đào tạo hái, chế biến nghiên nghiên cứu Dược, Học 15 cứu thực vật 10/2015 04/2016 01/2016 06/2016 01/2016 10/2016 – Nghiên cứu thành phần hóa học, chiết xuất hợp chất tự nhiên có tác dụng xua muỗi dược liệu – Nghiên cứu đánh giá tác dung xua đuổi muỗi - Trung tâm đào tạo nghiên cứu Dược, Học viện Quân y - Viện Dược liệu TW -Trung tâm đào tạo nghiên cứu Dược, Học viện Quân y -Khoa Ký sinh trùng – côn trùng, Học viện Quân y – Viết luận văn bảo vệ - Học viện quân y luận văn CÁN BỘ HƯỚNG DẪN KHOA HỌC 1) 2) viện Quân y - Trường Đại học Dược Hà Nội TS Phạm Văn Minh TS Hoàng Việt Dũng  ... cứu CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH NGHIÊN CỨU  Nghiên cứu xác định thành phần hóa học Phong lữ thảo: - Thẩm định tên khoa học Phong lữ thảo - Thu hái, chế biến, bảo quản Phong lữ thảo - Khảo sát sơ nhóm chất. .. chuyên gia thực vật 1.2 Nghiên cứu thành phần hóa học 1.2.1 Khảo sát sơ nhóm chất hữu có Phong lữ thảo - Thực phản ứng định tính nhóm chất có dược liệu bằng phản ứng định tính ống nghiệm sắc ký... lữ thảoThu hái, chế biến, bảo quản dược liệu Phong lữ thảo Thu thập bọ gậyvà muỗi Ae.aegypti Trứng muỗi Khảo sát sơ nhóm chất hữu thân, phong lữ thảo Bọ gậy Điều chế cao cồn 96%, cao phân đoạn